牛病毒性腹瀉病毒SYBR Green熒光定量PCR方法的建立及其應(yīng)用

劉 存 ，崔尚金 ?

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)北京科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，北京 100193）

牛病毒性腹瀉-黏膜?。˙ovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD）由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起，主要以口腔、食管、胃、腸等部位黏膜侵蝕性或潰瘍性病變、腹瀉、白細(xì)胞減少、持續(xù)性感染及懷孕母牛流產(chǎn)或產(chǎn)畸形胎兒等癥狀為特征[1-2]。BVDV在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)牛業(yè)國(guó)家造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。犢牛感染BVDV后，潛伏期7～9 d，發(fā)病率為2%～5%，犢牛死亡率可達(dá)90%。妊娠母牛在妊娠30～120 d間感染后可產(chǎn)持續(xù)性感染牛，持續(xù)性感染牛可持續(xù)排毒成為BVDV重要的傳染源，是飼養(yǎng)場(chǎng)無(wú)法根除BVDV的重要原因之一。通過(guò)檢測(cè)并淘汰持續(xù)性感染牛，是逐步實(shí)現(xiàn)BVDV凈化的重要手段。

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）是黃病毒科（Flaviridae）瘟病毒屬（Pestivirus）成員，該病毒屬還包括豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）和羊邊界病病毒（Border disease virus，BDV）[4]。BVDV基因組為單股正鏈RNA，由5’非翻譯區(qū)（5′UTR）、ORF編碼區(qū)、3’非翻譯區(qū)（3′UTR）組成。BVDV基因組編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白和8種非結(jié)構(gòu)蛋白，分布依次為5’-Npro-capsid-Erns-E1-E2-P7-NS2/3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-3’[5]。根據(jù)是否引起細(xì)胞病變，BVDV可分為兩種生物型：致細(xì)胞病變型（Cytopathogenic，CP）和非致細(xì)胞病變型（Noncytopathogenic，NCP）[6]；根據(jù)BVDV基因序列，BVDV又可分為BVDV-1和BVDV-2兩個(gè)基因型。由于BVDV易突變且不同毒株間存在同源重組現(xiàn)象，因此BVDV基因亞型眾多，目前BVDV-1分為1a～1u共21個(gè)亞型，BVDV-2分為2a～2d共4個(gè)亞型[7]。由于BVDV5’UTR高度保守，常作為靶標(biāo)用于BVDV抗原的檢測(cè)。由于NCP型BVDV不致培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變，其病毒滴度測(cè)定常采用間接免疫熒光或者間接免疫過(guò)氧化物酶試驗(yàn)進(jìn)行，耗時(shí)且不方便。熒光定量PCR方法是常用于病原檢測(cè)以及定量的方法，且該方法特異性強(qiáng)、敏感性高、可重復(fù)性好、簡(jiǎn)便省時(shí)，可應(yīng)用于BVDV培養(yǎng)過(guò)程中BVDV生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。本研究參考BVDV保守的5’UTR序列，設(shè)計(jì)引物建立BVDV RT-qPCR方法，為BVDV檢測(cè)及培養(yǎng)過(guò)程一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞牛病毒性腹瀉病毒BVDV-BJ-2016株、牛副流感病毒3型BPIV3 Beijing株、牛傳染性鼻氣管炎病毒BHV-1 Beijing株均為作者所在實(shí)驗(yàn)室分離鑒定和保存，豬瘟病毒來(lái)源于市售弱毒活疫苗。經(jīng)牛腎細(xì)胞（MDBK）傳代培養(yǎng)BVDV，收取培養(yǎng)物-80℃保存?zhèn)溆?。MDBK細(xì)胞由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑及儀器AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒為Axygen產(chǎn)品；PrimeScriptTMRT reagent Kit為TaKaRa公司產(chǎn)品；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程有限公司；EasyPure Plasmid MiniPrep Kit購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；KAPA?SYBR?快速定量PCR試劑盒購(gòu)于北京普凱瑞生物科技有限公司；7900HT Fast Real-time PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。.4標(biāo)準(zhǔn)品DNA模板制備按照AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，從BVDV-BJ-2016株細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取RNA。參照PrimeScriptTMRT reagent Kit說(shuō)明書(shū)將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以獲得的cDNA為模板進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品DNA模板的PCR擴(kuò)增。標(biāo)準(zhǔn)品DNA模板擴(kuò)增用引物：上游引物：5’-TAgCCATgCCCTTAgTAggAC-3’；下游引物：5’-ACTCCATgTgCCATgTACAgC-3’，片段大小約298 bp。PCR采用50 μL體系：上、下游引物各1 μL；cDNA模板 3 μL；PCR Mix 25 μL；ddH2O 20 μL。反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收預(yù)期目的條帶與pMD18-T連接、轉(zhuǎn)化，獲得重組質(zhì)粒pMD18T-5’UTR。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定重組質(zhì)粒的質(zhì)量濃度，按照公式 copies/μL=（6.02×1023copies/mol）×（濃度g/mL）×10-3/（分子質(zhì)量g/mol）計(jì)算拷貝數(shù)計(jì)算重組質(zhì)?？截悢?shù)。

1.3 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank上登錄的BVDV 5’UTR序列的保守序列，應(yīng)用Primer Express 3.0設(shè)計(jì)特異性熒光定量RT-PCR引物，上游引物序列：5’-GGGNAGTCGTCARTGGTTCG-3’，下游引物序列：5’-TGTGCCATGTACAGCAGAGYTT-3’，目的片段大小為198 bp。上述引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

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1.5 熒光定量PCR反應(yīng)條件根據(jù)KAPA?SYBR?快速定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，熒光定量PCR體系采用20 μL體系。以陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板，采用矩陣法，對(duì)熒光定量PCR方法的退火溫度（58、60、62、64℃）進(jìn)行優(yōu)化，并利用矩陣法對(duì)引物（10 μmol/L）使用量（0.4、0.6、0.8、1.0 μL）依次進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋，選用 107、106、105、104、103、102、101copies/μL的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品為模板，以優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品做3個(gè)重復(fù)。以log（拷貝數(shù)）為縱坐標(biāo)、CT值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸分析。

1.7 敏感性試驗(yàn)將制備的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，采用濃度為108、107、106、105、104、103、102、101、100copies/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品為模板 ，應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，確定其敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)采用濃度為108、107、106copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板進(jìn)行3批重復(fù)性試驗(yàn)。每批次重復(fù)3次以檢驗(yàn)其批內(nèi)重復(fù)效果。在不同時(shí)間對(duì)該試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)以檢驗(yàn)該方法批間重復(fù)效果。

1.9 特異性試驗(yàn)應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法對(duì)BVDV-BJ-2016株、BPIV3 Beijing株、BHV-1 Beijing株以及CSFV的cDNA或DNA進(jìn)行檢測(cè)以評(píng)價(jià)所建立方法的特異性。

1.10 BVDV一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定將BVDV病毒液（BVDV-BJ-2016株）稀釋1 000倍后接種MDBK細(xì)胞，在接毒后 2、4、6、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108 h分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清1 mL，用于RNA的提取。RNA提取參照AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的RNA用Nano Drop 2000測(cè)定質(zhì)量濃度后，取1 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。取1 μL cDNA用本研究中所建立的SYBR Green熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，確定培養(yǎng)上清中BVDV基因組拷貝數(shù)的變化。根據(jù)所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及Ct值計(jì)算每毫升病毒液中所含BVDV基因組拷貝數(shù)，并以l g（copies/mL）為縱坐標(biāo)、時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制BVDV一步生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 BVDV 5’UTR RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果以提取的BVDV-BJ-2016株cDNA為模板，采用BVDV 5’UTR的特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的片段約298 bp，符合預(yù)期目的條帶大小?；厥漳康臈l帶，連接于pMD18-T載體，以構(gòu)建陽(yáng)性模板。將鑒定為陽(yáng)性的重組載體命名為pMD-5’UTR。

2.2 熒光定量PCR方法條件優(yōu)化根據(jù)KAPA?SYBR?快速定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)確定反應(yīng)體系為20 μL，經(jīng)過(guò)優(yōu)化最終確定為qPCR Mix 10 μL，上、下游引物（10 μm/L）0.6 μL，Rox 0.4 μL，模板 1 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。經(jīng)過(guò)對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定該方法最佳的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s（收集熒光），共計(jì)40個(gè)循環(huán)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將重組質(zhì)粒pMD-5’UTR經(jīng)10 倍梯度稀釋，分別以 107、106、105、104、103、102、101copies/μL的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)獲得擴(kuò)增曲線（見(jiàn)圖1B）。以起始模板濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)、Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)熔解曲線分析（見(jiàn)圖1A），可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)樣品均出現(xiàn)了單一的峰，表明該方法為特異性擴(kuò)增。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.5197+40.4431，相關(guān)系數(shù)R2=0.9973，各濃度標(biāo)準(zhǔn)品間具有良好的線性關(guān)系。

圖1 BVDV RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Standard curve of BVDV RT-qPCR

2.4 敏感性試驗(yàn) 分別以107、106、105、104、103、102、101、100copies/μL的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品模板利用所建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均呈現(xiàn)典型的S型曲線（圖2）。該建立的方法最低檢測(cè)限為10.0 copies/μL。

圖2 BVDV RT-qPCR方法敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2Result of sensitivity test of BVDV RT-qPCR

2.5 特異性試驗(yàn)利用建立的SYBR Green熒光定量PCR方法對(duì)BVDV、BPIV3、BHV-1、CSFV的核酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示BVDV和CSFV樣品為陽(yáng)性，其他病毒樣品均為陰性。該結(jié)果表明，豬瘟病毒對(duì)本研究中所建立的RT-qPCR方法存在干擾（圖3），即所建立的SYBR Green熒光定量PCR方法不能夠區(qū)別鑒定BVDV與豬瘟病毒，這可能由于BVDV與豬瘟病毒同屬瘟病毒屬，而在瘟病毒屬成員中基因組5’非編碼序列相對(duì)保守。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，所建立的SYBR Green熒光定量PCR方法雖不能特異性地鑒別BVDV與豬瘟病毒，但其與牛副流感病毒3型、牛傳染性鼻氣管炎病毒并不存在交叉反應(yīng)，可應(yīng)用于瘟病毒與其他不同病毒的診斷中。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)選取濃度為108、107、106copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板，分別進(jìn)行3批批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)以評(píng)價(jià)所建立SYBR Green熒光定量PCR方法的重復(fù)性。結(jié)果顯示，所建立的熒光定量PCR方法的批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于5%，說(shuō)明所建立SYBR Green熒光定量PCR方法具有良好的重復(fù)性。

圖3 BVDV RT-qPCR特異性試驗(yàn)Fig.3Specificity test of BVDV RT-qPCR

2.7 BVDV一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定在BVDV接種MDBK細(xì)胞后，收取接毒后2、4、6、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108 h的細(xì)胞培養(yǎng)上清。收取上清用所建立的RT-qPCR方法進(jìn)行檢測(cè)，獲得Ct值，將Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)方程后計(jì)算拷貝數(shù)。以拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以樣品收集時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制BVDV一步生長(zhǎng)曲線（圖4）。BVDV一步生長(zhǎng)曲線顯示，在接毒后12～48 h間為BVDV對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在接毒48 h以后，BVDV基本處于穩(wěn)定期。從繪制的BVDV一步生長(zhǎng)曲線提供的參考，BVDV在接毒后72～84 h間收獲病毒即可。

3 討論

牛病毒性腹瀉病毒感染是危害養(yǎng)牛業(yè)的重要疾病，開(kāi)發(fā)檢測(cè)和診斷牛病毒性腹瀉的快速診斷技術(shù)對(duì)牛病毒性腹瀉的防控及凈化、推動(dòng)養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展具有重要的意義。為了預(yù)防與控制牛病毒性腹瀉病毒感染，科研人員建立了諸多分子生物學(xué)診斷方法。應(yīng)用地高辛、生物素等標(biāo)記物標(biāo)記核酸探針，建立核酸雜交檢測(cè)方法，快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)地檢測(cè)BVDV[8]。白泉陽(yáng)等[10]、宋爽等[11]針對(duì)BVDV保守的5’UTR設(shè)計(jì)引物和探針，建立Taqman熒光定量PCR方法，方便、快速地檢測(cè)BVDV，該方法敏感度高、重復(fù)性好。

表1 BVDV RT-qPCR重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Table 1Inter-assay and intra-assay reproducibility test of the RT-qPCR

圖 4 BVDV在MDBK細(xì)胞上一步生長(zhǎng)曲線Fig.4 One-step growth curve of BVDV in MDBK cells

熒光定量PCR方法具有操作簡(jiǎn)便、特異性高、敏感性高、重復(fù)性好、可實(shí)時(shí)定量等特點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR包括探針?lè)ê腿玖戏?，其中染料法相?duì)探針?lè)▋r(jià)格更低。目前熒光定量PCR已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)和診斷病原的重要手段[12]。對(duì)于非致細(xì)胞病變型牛病毒性腹瀉病毒在培養(yǎng)細(xì)胞上不產(chǎn)生細(xì)胞病變，通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)或間接免疫過(guò)氧化物酶試驗(yàn)測(cè)定接毒后不同時(shí)間點(diǎn)收獲病毒的TCID50，進(jìn)而繪制非致細(xì)胞病變型牛病毒性腹瀉病毒在培養(yǎng)細(xì)胞上的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線，此種測(cè)定方法耗力費(fèi)時(shí)。而應(yīng)用熒光定量PCR方法可快速定量地對(duì)病毒基因組進(jìn)行檢測(cè)，因此本試驗(yàn)將熒光定量PCR方法應(yīng)用于BVDV一步生長(zhǎng)曲線的繪制中。

為了實(shí)現(xiàn)測(cè)定BVDV NCP型一步生長(zhǎng)曲線，本試驗(yàn)根據(jù)牛病毒性腹瀉病毒5’UTR保守序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，建立了檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的SYBR Green熒光定量PCR方法并將該方法應(yīng)用于BVDV一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定中。研究中所建立的SYBR Green熒光定量PCR方法具有良好的重復(fù)性和敏感性，但其存在不能特異性鑒別BVDV與豬瘟病毒的缺陷。這一缺陷，可根據(jù)瘟病毒屬成員5’UTR序列中的差異序列區(qū)設(shè)計(jì)特異性的探針，以改善熒光定量PCR方法的特異性。該方法的建立和應(yīng)用，為研究非致細(xì)胞病變型BVDV分離毒株的生長(zhǎng)特性的研究提供了一定的參考。