硒對液體培養(yǎng)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響初探

周連玉 更尕求卓 唐德華 米 琴

（青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室∕青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海西寧810008）

目前食物向多樣化發(fā)展，人們已注意膳食的合理搭配以及常量元素與微量元素的攝入比例。在缺乏的必需微量元素中，硒缺乏就在其中之一，硒是人體谷胱甘肽過氧化物酶的活性成分，硒能調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)速度，強(qiáng)化某些酶系統(tǒng)的活性及調(diào)節(jié)維生素A、C、E、K在體內(nèi)吸收和消化；還可對汞、鎘等重金屬具有解毒作用[1]。無機(jī)硒在體內(nèi)不易吸收且毒性強(qiáng)，人體對有機(jī)硒的吸收率比無機(jī)硒高30%，毒性也小，并且可以在人體組織內(nèi)儲存[2]。而許多生物能使添加的外源無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為易被體內(nèi)吸收利用的有機(jī)硒。

近年來國內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)，杏鮑菇、靈芝、雞腿菇、平菇、灰樹花等多種食藥用菌具有較強(qiáng)的富硒能力，然而不同種蕈菌液體耐硒能力有差別，其菌絲體生長受菌株特性、培養(yǎng)基、硒濃度、加硒時間、培養(yǎng)時間、pH、接種量、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量等多種因素的影響[3-7]。有許多研究表明：不同菌株在一定硒濃度下富硒后能提高發(fā)酵液或菌絲體的營養(yǎng)價值及活性作用[8-11]，還轉(zhuǎn)化硒的形態(tài)[4]，因此可作為補(bǔ)硒營養(yǎng)品和應(yīng)用于高附加值的食品中[12-13]。

黃綠蜜環(huán)菌（Armillaria luteo-virens）是一種大型真菌，隸屬于擔(dān)子菌亞門，層菌綱，口蘑目，口蘑科，蜜環(huán)菌屬。在青海主要生長在海拔3000～4300 m的草甸上，大多分布于海北（祁連、海晏、剛察）、黃南（澤庫、河南）、海南（共和、貴德、興海）、果洛（瑪沁、甘德、久治）及高海拔的玉樹地區(qū)；以及四川、西藏、河北、陜西、甘肅等省區(qū)也有分布[14]。目前黃綠蜜環(huán)菌還屬于野生菌，因此無法進(jìn)行人工栽培。研究多集中于其生物學(xué)特征、人工培養(yǎng)、化學(xué)成分分析、分子鑒定、生態(tài)特性等方面[15-24]。利用黃綠蜜環(huán)菌生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)特定物質(zhì)的相關(guān)報道很少，在一定轉(zhuǎn)化體系中黃綠蜜環(huán)菌可生物轉(zhuǎn)化合成天麻素[25-26]，LIU J等[27]發(fā)現(xiàn)黃綠蜜環(huán)菌ZJUUQH100-6菌株在適宜條件下可以將白樺脂醇轉(zhuǎn)化合成白樺脂酸。試驗研究亞硒酸鈉對黃綠蜜環(huán)菌液體培養(yǎng)菌絲體生物量的影響，旨在為黃綠蜜環(huán)菌富硒的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株

黃綠蜜環(huán)菌菌株HM，由青海師范大學(xué)微生物實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

活化菌株采用PDA培養(yǎng)基，配方為馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1000 mL。種子培養(yǎng)基采用PDB，配方為馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL。發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖4%，牛肉膏0.10%，KH2PO40.10%，MgSO40.10%。

1.2 試驗方法

1.2.1 液體菌種的制備

250 mL三角瓶中裝入種子培養(yǎng)基100 mL，將3塊4 mm的菌塊接到培養(yǎng)液中，于25℃培養(yǎng)4 d。

1.2.2 不同硒濃度對黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響

以15%的接種量將液體菌種接到含亞硒酸鈉的濃度分別為0 mmol∕L（CK）、0.20 mmol∕L、0.40 mmol∕L、0.60 mmol∕L、0.80 mmol∕L、1.00 mmol∕L 的發(fā)酵培養(yǎng)基中。25℃培養(yǎng)8 d，測定富硒黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量。每個濃度設(shè)三次重復(fù)。

1.2.3 添加硒時間對黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響

以15%的接種量將液體菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基，以上述試驗確定的適宜硒濃度后，將分別在0 d、2 d、4 d、6 d時將亞硒酸鈉添加到發(fā)酵培養(yǎng)基，重復(fù)3次。25℃培養(yǎng)8 d，測定富硒黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量。

1.2.4 硒對黃綠蜜環(huán)菌菌絲體動態(tài)性的影響

以最適硒濃度、最適添加硒時間進(jìn)行黃綠蜜環(huán)菌深層富硒動態(tài)培養(yǎng)。分別以添加亞硒酸鈉和不加硒的發(fā)酵培養(yǎng)基為富硒處理組與對照組，25℃培養(yǎng)，在發(fā)酵時間5 d、6 d、7 d、8 d時，分別對富硒處理組與對照組進(jìn)行取樣，重復(fù)三次，測定黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量。

1.3 菌絲體生物量的測定

培養(yǎng)液過濾獲得菌絲體和發(fā)酵液，并用蒸餾水反復(fù)清洗菌絲體至濾液無色，菌絲體于60℃干燥至恒重，電子天平稱重測得菌絲體生物量。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，不同硒濃度處理下菌絲體生物量和不同加硒時間下菌絲體生物量差異性比較用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行單因素方差分析（LSD，P＜0.05）。加硒組和對照組菌絲體生物量動態(tài)性的顯著性通過獨立樣本的t-test進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硒濃度對黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響

不同硒濃度對黃綠蜜環(huán)菌菌絲生長的影響結(jié)果如圖1所示。供試黃綠蜜環(huán)菌菌絲在5種加硒培養(yǎng)基里均能生長，而硒濃度為0.80 mmol∕L能顯著提高黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量（P＜0.05），但其他硒濃度與對照之間不存在顯著性差異。

圖1 不同硒濃度對黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響

2.2 不同加硒時間對黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響

由2.1試驗結(jié)果確定適宜硒濃度為0.80 mmol∕L，探討不同加硒時間對黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的研究，結(jié)果如圖2所示，與不加硒相比，除第6天時加硒組與不加硒組之間不存在顯著性差異，其他時間加硒顯著提高黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量（P＜0.05），而第4天加硒菌絲體生物量增長最大，達(dá)到9.32%。

圖2 不同加硒時間對黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響

2.3 硒對黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量累積動態(tài)的影響

黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量動態(tài)變化如圖3所示，富硒組與對照組的菌絲生長動態(tài)規(guī)律基本一致。于發(fā)酵時間5 d、6 d、8 d時加硒組與不加硒兩者之間的菌絲體生物量干重不存在顯著性差異。與對照組相比，在培養(yǎng)時間第7天時硒顯著提高黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量（P＜0.05），且增長幅度達(dá)到33.33%。

圖3 不同發(fā)酵時間硒對黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響

3 小結(jié)與討論

食藥用菌富硒菌絲體生物量與硒濃度密切相關(guān)，硒濃度不同所起到促進(jìn)或抑制的作用也各異[6-7]。本試驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加硒后，黃綠蜜環(huán)菌的菌球呈現(xiàn)紅色（有些菌球內(nèi)層紅色外層為白色），當(dāng)硒濃度0.80 mmol∕L時，顯著提高菌絲體生物量的含量（P＜0.05，圖1），可見，在適宜硒濃度下可促進(jìn)黃綠蜜環(huán)菌菌絲生長。

將濃度為100 μg∕mL亞硒酸鈉分別于第1天、第3天、第5天加到靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中，結(jié)果加硒時間為第1天時，靈芝菌絲體生物量最高且發(fā)酵液的顏色正常為淺黃色[28]。發(fā)現(xiàn)在黃綠蜜環(huán)菌培養(yǎng)第4天時加0.80 mmol∕L亞硒酸鈉顯著提高菌絲體生物量（P＜0.05，圖2）。

張炎灼等[29]通過添加3 μg∕mL亞硒酸鈉于秀珍菇液體培養(yǎng)基中研究菌絲體動態(tài)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)對照組與富硒組生長趨勢基本一致，于培養(yǎng)72 h時菌絲體生物量達(dá)到最大值，分別為1.81 mg∕mL和1.92 mg∕mL，但兩者之間不存在顯著性差異。發(fā)現(xiàn)黃綠蜜環(huán)菌于發(fā)酵時間7 d時，富硒組菌絲體生物量顯著高于對照組，而在發(fā)酵時間5 d、6 d和8 d時富硒組生物量略大于對照組（P＜0.05，圖3），這一結(jié)果也表明了適當(dāng)硒濃度能促進(jìn)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生長。

總之，硒對食藥用菌菌絲體生物量有明顯的影響，有關(guān)硒對黃綠蜜環(huán)菌營養(yǎng)成分的作用有待于進(jìn)一步研究。