牛呼吸道合胞體病的診斷與防治研究進展

張秀華，路偉，蘇瑋瑋，李淑芬

（華威特（江蘇）生物制藥有限公司，泰州 225300）

牛呼吸道合胞體病是由牛呼吸道合胞體病毒（Bovine respiratory syncytial virus, BRSV）引起的一種急性、熱性傳染病。該病以發(fā)熱、流淚、流鼻液、流涎、呼吸急迫、咳嗽、乳牛泌乳量顯著下降和嚴重的間質性肺炎等為主要特征。1967年，Paccaud和Jacquier在瑞士首次從牛體內分離到BRSV。日本、比利時、英國、加拿大和美國等國也相繼分離出該病毒。北美BRSV特異性抗體陽性牛達81%，美國南部地區(qū)BRSV的血清陽性率要高于北部地區(qū)。在美國，呼吸疾病患牛的死亡率達到13%。在加拿大，BRSV的總感染率將近36%。墨西哥的兩個不同地區(qū)感染率分別達52%和90.8%。瑞典牛奶中BRSV抗體的檢出率高達41%～89%。丹麥、比利時、英國等國家也都有BRSV感染的報道，且發(fā)病率也較高。埃塞俄比亞和南非的BRSV感染發(fā)病率也較高。其他國家，如土耳其也有較高的血清陽性率（達43%）[1]。2007年，王紅等從國內發(fā)生牛呼吸道病的某牛場分離出BRSV[2]，說明BRSV感染在國內也是存在的，但尚無較大規(guī)模的血清流行病學研究報告。BRSV可以感染各年齡段的牛、綿羊、山羊及其他易感動物，大多數(shù)為無癥狀感染[3]，而且BRSV可通過再次感染或攜帶者在畜群中持續(xù)存在，導致治療費用不斷增加。

1 診斷方法

1.1 病毒分離與鑒定

動物病死后的病料不易分離到病毒，發(fā)病牛的氣管或者肺臟的沖洗液、病牛鼻腔深部的鼻液可作為病毒分離的病料。常用細胞有猴腎（Vero）細胞、牛腎（MDBK）細胞和牛鼻甲細胞系（BT），其中BT細胞對該病毒最敏感，適于作為分離和培養(yǎng)病毒之用。BRSV在牛鼻甲細胞上可形成其獨特、可見的合胞體及胞漿包涵體[3]。BRSV對熱及惡劣環(huán)境敏感，表現(xiàn)不穩(wěn)定，在運輸過程中極易失活。同其他病毒分離一樣，BRSV的分離被認為是診斷的“黃金標準”，但是病毒分離一般需要數(shù)個星期，而且陽性率低、成本高，進一步鑒定還需要免疫熒光或者分子生物學方法檢測，因此，不適用于臨床早期診斷和疫情應急診斷。

1.2 血清學檢測

血清學檢測對牛呼吸道合胞體病的診斷和流行病學調查均具有重要意義。目前，應用最多的有血清中和試驗（SNT）、間接免疫熒光試驗（IFA）、補體結合試驗（CFT）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等。

1.2.1 血清中和試驗（SNT）

SNT是經典的血清學檢測方法。該試驗的周期需要1周左右，而且操作繁瑣，所以很少用于臨床疾病的快速診斷，且無法診斷人工免疫后的動物[4]。應用抗BRSV陽性血清進行SNT，往往可以確定待檢的樣本是否為BRSV，并且新檢測方法的建立都將SNT作為依據(jù)標準，并與SNT進行比較以確定新檢測方法的敏感性。

1.2.2 補體結合試驗（CFT）

CFT是用免疫溶血機制作為指示系統(tǒng)來檢測另一反應系統(tǒng)抗原或抗體的試驗。Bostandzhieva等采用CFT對240份血清進行檢測，檢測出40份血清為陽性，感染率為18%，證明了該方法對疾病的檢測有效。但此方法在國內外診斷實驗室應用得很少。

1.2.3 免疫熒光檢測（IFA）

IFA是目前應用較廣泛的BRSV快速檢測技術，其原理是用熒光素標記的抗體和相應抗原形成免疫復合物，借助熒光顯微鏡觀察細胞內病毒抗原及其存在的位置。將IFA用于自然感染牛和試驗感染牛鼻咽上皮細胞中BRSV抗原的檢測，但未能獲得滿意結果。Quinting等建立了一種間接免疫熒光法檢測發(fā)病牛器官勻漿液中的BRSV抗原，整個檢測只需1.5h，與Real-time RT-PCR法相比，該方法更敏感和特異。IFA檢測的病料（如肺臟及氣管組織等）必須是新鮮或速凍的病料，因為在福爾馬林等化學品固定的病料中，BRSV抗原往往受到較大的破壞，診斷結果的準確性有所降低[5]。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA是一項已在動物疫病診斷工作中得到廣泛應用的血清學診斷技術。由于酶的高效催化作用使其對抗原抗體結合識別起到了放大作用，從而達到了快速、靈敏、高效的檢測要求，是一種重要的疫病早期診斷方法[4]。ELISA適合檢驗大批標本和微量標本，被列為診斷BRSV感染的常規(guī)檢測方法。目前國際上用于檢測BRSV抗體的間接ELISA診斷方法主要針對的是BRSV的N蛋白、F蛋白和G蛋白。N蛋白具有良好的穩(wěn)定性和特異性，常被用于包被抗原，進而建立診斷BRSV抗體的有效方法。目前利用純化的BRSV為抗原建立了檢測牛奶和血清中BRSV抗體的間接ELISA方法，結果表明該方法快速可靠。有學者使用桿狀病毒表達載體在昆蟲細胞內表達BRSV N蛋白，并以此重組N蛋白為抗原建立了間接ELISA診斷方法，對感染牛血清進行了流行病學調查。此外，也有使用桿狀病毒表達載體表達的F蛋白作為包被抗原，建立檢測BRSV血清抗體的間接ELISA方法的。與SNT相比較，該方法快速、敏感、特異。利用G蛋白建立的間接G-ELISA診斷方法不僅比傳統(tǒng)的間接F-ELISA診斷方法更敏感，而且還可以區(qū)分亞型。馮軍科等應用純化的重組蛋白G1為包被抗原，檢測國內牛血清中的BRSV抗體，建立了牛呼吸道合胞體病毒G蛋白的血清學診斷方法[6]。

1.3 分子生物學方法

1.3.1 聚合酶鏈式反應（PCR）

以特異性強、敏感性高、高效快速為特點的PCR已經成為實驗室診斷最常用的方法。該方法已廣泛用于BRSV的檢測。與病毒分離和IFA相比，PCR的結果不受標本病毒失活的影響，也不需要完整的受感染細胞，但是PCR反應的條件選擇非常嚴格，擴增所用引物具有較強的特異性。Larsen等應用RT-PCR方法對自然和試驗感染牛肺組織中BRSV的F基因進行檢測，結果表明該方法較敏感、可靠。Valarcher等應用nRT-PCR方法對BRSV的N基因進行檢測，結果表明該方法敏感性高、特異性強，適合BRSV的診斷和分子流行病學調查。Boxus等利用實時定量RT-PCR方法從被感染牛的氣管和肺臟的灌洗液中檢測到BRSV，靈敏度是傳統(tǒng)RTPCR的100倍，并且能夠對感染14d后的肺臟灌洗液進行病毒定量。史鴻飛等首次用套式RT-PCR技術證實了我國部分省份牛群中存在BRSV感染[7]。

1.3.2 原位雜交技術(ISH)

ISH是將組織化學與經典的核酸雜交技術相結合衍生出來的可定位檢測核酸分子的病理學技術，可在組織、細胞或染色體上原位檢測是否存在目的DNA或RNA片段。西班牙學者Masot等應用原位雜交（ISH）技術檢測了試驗感染牛呼吸道合胞體病毒（BRSV），并檢測了不同時間內在羔羊肺中的分布情況[8]。

1.3.3 環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)

LAMP是利用4種不同的特異性引物識別靶基因的6個特定區(qū)域，在等溫條件下進行擴增反應的技術?；虻臄U增和產物的檢測可一步完成，擴增效率高，可在15～60min擴增109～1 010倍；所有靶基因序列的檢測可通過擴增產物的有、無來判斷。有無擴增反應是利用添加熒光染料的熒光強度或利用核酸擴增過程中產生的焦磷酸鎂沉淀反應的沉淀濁度來判定的?？筛鶕?jù)BRSV的保守基因設計4條特異性引物，建立BRSV環(huán)介導等溫擴增方法，為牛呼吸道疾病的準確診斷提供新的方法。環(huán)介導等溫擴增方法具有特異性強、靈敏度高、擴增高效、快速、設備簡單、鑒定簡便等優(yōu)點，適于在基層推廣和應用。

2 防治

2.1 免疫預防

經過幾十年的努力，BRSV疫苗的研究已取得了顯著的進展，BRSV疫苗一般在免疫系統(tǒng)不健全和母源抗體存在時能誘導有效的免疫反應，產生具有中和活性的血清抗體和黏膜抗體。目前上市的主要有兩種疫苗：①滅活苗。可誘導犢牛產生高水平的中和抗體，但并不能保護所有免疫牛免于感染。②弱毒苗。Kubota等報道，BRSV在低溫(30℃)條件下通過HAL繼代獲得rs-52株，用它接種犢牛，既不出現(xiàn)臨床癥狀和排毒現(xiàn)象，又能抵抗強毒的攻擊，且抗體持續(xù)期長，可有效預防BRSV感染。Xue等報道，采用多聯(lián)活疫苗（包含5個病毒抗原BVDV1、BVDV2、IBRV、PI3V和BRSV）免疫3～8日齡的小牛，免疫后與未免動物攻毒后比較，該多聯(lián)活疫苗免疫動物的臨床癥狀、肺部變化、白細胞和血小板減少數(shù)量大大降低，雖然大多數(shù)免疫動物依然排毒，但是與未接種動物相比，排毒期和排毒量大幅度降低，證明該5聯(lián)活疫苗安全有效[9]。而Taylor報道，人呼吸道合胞體病毒對溫度敏感的突變株ts-1雖然對牛的毒力明顯減弱，但不能完全保護犢牛免于BRSV感染[10]。

近年的研究表明，有效的副黏病毒疫苗能誘導針對病毒表面糖蛋白的抗F、G抗體的產生，尤其是抗F抗體，這為研制BRSV的生物技術疫苗提供了重要依據(jù)。目前已研制了用牛皰疹病毒作載體表達BRSV的G蛋白重組疫苗，可誘導黏膜免疫使牛得到保護。采用重組牛痘病毒表達的F蛋白免疫小牛能夠產生IgG抗體和誘導CD8+T細胞反應，不能產生IgE抗體，同時該疫苗能夠抵抗BRSV的攻擊[11]。

BRSV感染或者疫苗接種所產生的免疫力時間很短，可能僅能持續(xù)3～4個月，其原因目前尚不清楚，但是可以解釋BRSV發(fā)生頻繁甚至反復感染免疫動物和非免疫動物的原因。因此，頻繁的免疫能夠控制該病的發(fā)生。懷孕母畜接種BRSV病毒活疫苗是安全的，且能夠將母源抗體轉移給小牛。有證據(jù)表明，具有母源抗體的小牛接種疫苗易產生免疫應答。用含有BRSV抗原的三聯(lián)滅活疫苗免疫哺乳小牛，抗原能夠沖破母源抗體干擾產生免疫保護，推測二免后抗體水平將更高[12]。

值得注意的是，大多數(shù)情況下BRSV并不是獨立存在的，它往往與其他的牛傳染性呼吸道致病原同時感染牛，造成典型的“運輸熱”或“干草熱”。這些致病原包括牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、傳染性牛鼻氣管炎病毒（IBR）、牛副流感病毒3型（PI-3）、牛呼吸道冠狀病毒（rBCoV）、溶血性巴氏桿菌以及牛支原體等。試驗證明，與其他病原共同感染的BRSV對牛造成的臨床疾病更嚴重。因此，有效地防控其他病原，也是有效防控BRSV感染的必要條件。

2.2 治療

牛呼吸道合胞體病目前沒有特效療法，只能采取對癥治療。發(fā)生BRSV感染的牛經常表現(xiàn)脫水，需要補充水分和電解質；另外，被感染牛易繼發(fā)感染溶血性巴氏桿菌、壞死性巴氏桿菌以及牛支原體等，可直接采用廣譜的抗生素防止細菌繼發(fā)感染，采用皮質類固醇藥物控制過敏反應等。短期使用皮質類固醇藥物可以緩和呼吸困難的癥狀，但是該藥物有免疫抑制作用，能夠加重牛呼吸道合胞體病的病情和繼發(fā)感染，因此在使用皮質類固醇藥物時要慎重，如果不是急性癥狀，勿輕易使用。

2.3 綜合措施

每日及時清理牛舍地面及運動場的糞便，同時對地面、用具、工作服等嚴格消毒。經常觀察牛群，發(fā)現(xiàn)病牛應立即隔離或淘汰。對外界引進的牛只，一律采取隔離、檢疫措施，確診無病才能入群。對于受威脅的牛，應全面接種疫苗，以預防本病發(fā)生。另外，減少小牛特別是易感小牛與成年牛的接觸是簡單有效的控制手段。