結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性
——一個不容忽視的問題

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，也是我國重點防控的重大傳染病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)估計，2017年我國結(jié)核病患者數(shù)居世界第2位，耐多藥結(jié)核病(multi-drug resistant TB，MDR-TB)/耐利福平結(jié)核病(rifampicin resistant tuberculosis， RR-TB)負(fù)擔(dān)居世界第2位[1]，結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病對我國如期完成“終止結(jié)核病流行目標(biāo)”是一個重大挑戰(zhàn)。因此，加強結(jié)核分枝桿菌耐藥性的研究尤其重要。

異煙肼和利福平是治療結(jié)核分枝桿菌感染最重要的2個首選藥物，二者均存在價格便宜、殺菌力強和副作用低的特點。目前國內(nèi)外的研究熱點主要集中在MDR-TB、 RR-TB以及廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug resistant tuberculosis, XDR-TB，指MDR菌株同時對一種氟喹諾酮類藥物和3種二線注射類藥物中的一種或多種耐藥)上。然而，由于異煙肼的耐藥機制更為復(fù)雜，其研究和快速分子診斷難度更大。筆者將在本文中從異煙肼耐藥的流行狀況、耐藥機制以及耐藥性的檢測方法等方面討論，以期給異煙肼耐藥結(jié)核病的防控一點提示。

1 結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥的流行情況

異煙肼由Meyer和Mally于1912年在布拉格首次合成[2]，1952年分別被美國、德國的2個科學(xué)家團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)具有抗結(jié)核活性，從此用于抗結(jié)核治療[3]。在20世紀(jì)50年代早期，異煙肼主要作為單藥治療結(jié)核病，后因觀察到單藥使用容易導(dǎo)致異煙肼耐藥性快速發(fā)生，從而導(dǎo)致了多藥聯(lián)合化療方案的出現(xiàn)。

WHO于2014年的全球結(jié)核病報告中首次報道了利福平敏感菌株的異煙肼耐藥率，根據(jù)154個國家1995-2013年報告的數(shù)據(jù)估計初治患者為8.1%，復(fù)治患者為14.0%[4]；2018年WHO報告，根據(jù)146個國家2003-2017年的數(shù)據(jù)估算該結(jié)果有所下降，初治結(jié)核患者為7.1%，復(fù)治患者為7.9%[1]。2018年WHO報告的利福平敏感菌株的異煙肼耐藥率與2017年全球的MDR/RR耐藥率相比，初治患者中前者明顯高于后者(7.1%vs3.5%)；但復(fù)治患者前者明顯低于后者(7.9%vs18%)[1, 4]。Yuen[5]通過對32個國家和地區(qū)的兒童結(jié)核病患者進(jìn)行系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)：兒童結(jié)核病患者中異煙肼耐藥率高達(dá)12.1%，且大部分集中在西太區(qū)和東南亞地區(qū)。由此可看出，異煙肼耐藥結(jié)核病在全球范圍內(nèi)處于一個比較嚴(yán)重的流行狀態(tài)。

我國的結(jié)核病異煙肼耐藥疫情也處于一個較嚴(yán)重的狀態(tài)。根據(jù)我國2007-2008年開展的全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查結(jié)果顯示，初治患者異煙肼總耐藥率為16.01%，在6種檢測藥物中位列第2，明顯高于利福平總耐藥率(6.65%)；復(fù)治患者異煙肼總耐藥率為38.51%，在6種檢測藥物中位列第1，明顯高于利福平總耐藥率(29.40%)[6]。據(jù)報道，我國多個省市的初治患者中異煙肼耐藥率均高于利福平耐藥率，如杭州市11.22%vs5.19%[7], 浙江省江山市13.7%vs4.3%[8]，廣東省8.30%vs3.86%[9]。

異煙肼是結(jié)核病控制中一個非常重要的藥物，該藥便宜、有效而且副反應(yīng)少，目前它的地位不可替代。異煙肼不僅對繁殖期的結(jié)核分枝桿菌具有殺菌作用，對靜止期的結(jié)核分枝桿菌同樣具有殺菌作用，因此除了治療活動性結(jié)核病外，還常用于治療結(jié)核分枝桿菌隱性感染，而且是少有的能通過血腦屏障的抗結(jié)核藥物之一。因此，對異煙肼耐藥的問題必須引起重視。Menzies D等人[10]在Meta分析文章中綜述：對臨床治療方案進(jìn)行校正后初始異煙肼耐藥患者治療失敗和復(fù)發(fā)的發(fā)生率均明顯大于全敏患者[OR值分別為10.9(95%置信區(qū)間為5.9-20)和1.8(95%置信區(qū)間為1.2-2.6)]。此外，多個地方的觀察性研究[11-12]也報道了類似的結(jié)果。

由于利福平表型和基因型耐藥的高度相關(guān)性以及GenXpert等分子檢測技術(shù)的出現(xiàn)使得RR-TB的快速檢測成為可能，加上利福平在結(jié)核病防控中的重要性，RR-TB快速引起結(jié)核病防控領(lǐng)域的重視。然而，Smith等[13]對WHO多年報告的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，在一些MDR患病率較低的國家和地區(qū)約有40%的利福平耐藥患者沒有對異煙肼耐藥，他們認(rèn)為檢測異煙肼耐藥性是非常必要的。中國地域遼闊，各個省市結(jié)核病控制水平有差異，在強調(diào)利福平耐藥危險性或者說重要性的基礎(chǔ)上，對異煙肼耐藥的重要性問題有必要進(jìn)一步探討。

2 基因突變與結(jié)核分枝桿菌對異煙肼耐藥的關(guān)系

異煙肼作用機制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。目前主要認(rèn)為異煙肼進(jìn)入結(jié)核分枝桿菌后首先被過氧化氫-過氧化物酶(catalase-peroxidase, KatG)還原成具有殺菌活性的異煙酸，異煙酸與烯?；d體蛋白InhA相結(jié)合，從而阻斷細(xì)胞壁分枝菌酸的合成而發(fā)揮殺菌作用。據(jù)報道，katG和inhA啟動子突變是結(jié)核分枝桿菌對異煙肼產(chǎn)生耐藥的主要原因，然而科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)異煙肼耐藥的機制更為復(fù)雜，耐藥相關(guān)基因突變與表型、治療結(jié)局的關(guān)系需進(jìn)一步闡明[14-18]。通常認(rèn)為katG突變與結(jié)核分枝桿菌對異煙肼高水平耐藥相關(guān)，inhA啟動子突變與異煙肼低水平耐藥相關(guān)。katG基因突變株約占異煙肼耐藥菌株的50%～75%；inhA啟動子突變約占10%～20%左右；oxyR-ahpC間隔區(qū)突變約占5%～10%，排在第3位，屬于katG耐藥性突變引起的代償性突變[14-16]。值得注意的是，近年來一直認(rèn)為與乙胺丁醇耐藥性相關(guān)的embB基因突變同時被認(rèn)為與異煙肼耐藥性相關(guān)[17-18]。此外，目前發(fā)現(xiàn)還有18個基因與之有關(guān)[17]。

3 異煙肼耐藥對多藥耐藥的影響

異煙肼耐藥重要與否及其重要性如何，假設(shè)異煙肼耐藥像利福平耐藥是MDR的重要預(yù)兆因子，那么控制異煙肼耐藥是非常重要的。據(jù)報道80%的利福平耐藥株同時對異煙肼耐藥，因此利福平耐藥被看作是MDR的一個主要標(biāo)志[19]。如此，從基因進(jìn)化的角度理解，應(yīng)是菌株先獲得利福平耐藥性，然后快速累積異煙肼耐藥相關(guān)基因突變，從而發(fā)生異煙肼耐藥。然而事實并非如此，多個地方的研究表明異煙肼耐藥率明顯高于利福平耐藥率[6, 20]，顯然多數(shù)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性獲得提前于利福平。Mannson等[21]通過對來自5個洲的5 310株結(jié)核分枝桿菌基因組進(jìn)行分析以后發(fā)現(xiàn)不同家系、不同地區(qū)和不同年代的MDR菌株中約有96%其獲得異煙肼耐藥性先于利福平耐藥性，只有4%的MDR菌株其異煙肼耐藥性是在利福平耐藥的基礎(chǔ)上后獲得的。Hu等[22]也發(fā)現(xiàn)異煙肼耐藥性尤其是katG315突變更容易誘發(fā)菌株對利福平耐藥而形成耐多藥菌株。2009年menzis等[10]在其對臨床相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行meta分析的綜述中檢驗了異煙肼耐藥性是否會增加其它藥物耐藥性獲得的可能性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異煙肼耐藥組獲得性耐藥的發(fā)生率是異煙肼敏感組的5.1倍 (95%置信區(qū)間: 2.3-11.0) 。還有多個觀察性研究[23-27](未設(shè)立敏感對照組)認(rèn)為異煙肼耐藥結(jié)核病發(fā)展為MDR的可能性在1%～10%之間。我國也有相關(guān)研究報道，同樣采用含異煙肼和利福平的方案治療，單耐異煙肼患者比單耐利福平肺結(jié)核患者更容易發(fā)展成耐多藥肺結(jié)核[28]。利用基因組數(shù)據(jù)對結(jié)核分枝桿菌群體水平上獲得的相關(guān)基因突變構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)異煙肼耐藥相關(guān)基因突變提前利福平耐藥相關(guān)基因突變3～30年之間[29-31]。

4 結(jié)核分枝桿菌從異煙肼耐藥到多藥耐藥的可能機制

4.1外排泵機制 外排泵是一類與細(xì)菌生理活動和物質(zhì)代謝密切有關(guān)的膜蛋白，其在結(jié)核分枝桿菌對抗生素的耐藥中也發(fā)揮了重要的作用。外排泵引起的耐藥具有泛耐藥性、可誘導(dǎo)性和低耐藥性的特點。2012年，Machado等[32]報道利福平單耐藥菌株以及H37Rv經(jīng)異煙肼誘導(dǎo)后，異煙肼耐藥水平升高，并引起katG438位密碼子突變和katG的缺失，RT-qPCR顯示mmpL7，p55，efpA，mmr，Rv1258c和Rv2459等外排泵基因的表達(dá)水平明顯升高。此外，還有2個研究報告異煙肼誘導(dǎo)(亞抑菌濃度)培養(yǎng)菌株后，會導(dǎo)致菌株對異煙肼耐藥、異煙肼耐藥相關(guān)基因突變，多個外排泵基因高表達(dá)[33-34]。Colangeli等人[35-36]報道外排泵IniBAC與異煙肼和乙胺丁醇的耐藥有關(guān),該外排泵系統(tǒng)受轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子Lsr2的調(diào)節(jié)。盡管通常認(rèn)為外排泵對底物無特異性，但有文獻(xiàn)報道并不是當(dāng)前應(yīng)用中的抗生素都可被認(rèn)為是外排泵的底物[37]，而且Li等[38-39]分別用異煙肼和利福平誘導(dǎo)各自的單耐藥菌株后發(fā)現(xiàn),前者誘導(dǎo)高表達(dá)的外排泵個數(shù)高于后者(14>8)(共檢測35個)。以上證據(jù)表明異煙肼在結(jié)核分枝桿菌中容易誘發(fā)多種外排泵的表達(dá)。由于結(jié)核病治療療程長達(dá)6～24月且采用聯(lián)合化療方案，因此筆者推測異煙肼誘導(dǎo)外排泵過表達(dá)后，這些高表達(dá)的外排泵同時也將其它藥物排出菌體外，間接形成細(xì)菌長期接觸的藥物濃度低于殺菌濃度的環(huán)境，有可能使結(jié)核分枝桿菌先對其它藥物低耐藥，接著產(chǎn)生耐藥相關(guān)基因的突變致耐藥表型的出現(xiàn)，其具體機制如何有待進(jìn)一步研究。

4.2其它機制 Sherman等人[40]和Zhang 等人[41-42]首先發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，異煙肼進(jìn)入結(jié)核分枝桿菌后需經(jīng)氧化應(yīng)激蛋白KatG和AhpC的作用才能發(fā)揮其活性作用。上文中提到耐多藥外排泵蛋白調(diào)節(jié)系統(tǒng)Lsr2通過調(diào)節(jié)外排泵的表達(dá)影響異煙肼及其它藥物的耐藥性，多個研究還發(fā)現(xiàn)Lsr2可以保護(hù)結(jié)核分枝桿菌免受氧化應(yīng)激的影響，氧化應(yīng)激與多種抗生素耐藥相關(guān)[43-44]。因此，異煙肼耐藥菌株的抗氧化應(yīng)激水平可能會影響到其它藥物的耐藥性。Saunders等人[45]認(rèn)為異煙肼耐藥性能夠促使利福平耐藥性產(chǎn)生而導(dǎo)致MDR的出現(xiàn)是因為利福平產(chǎn)生的選擇壓力小于異煙肼，導(dǎo)致利福平耐藥株容易被異煙肼殺死，而異煙肼耐藥株被利福平殺死相對較難，因此異煙肼耐藥株能夠存活并在標(biāo)準(zhǔn)治療方案藥物刺激下獲得額外藥物耐藥性。

5 異煙肼耐藥性的檢測方法

目前臨床上用于檢測異煙肼耐藥性的方法主要分為兩類，一類是表型檢測方法，一類為分子生物學(xué)檢測方法。表型檢測方法包括基于羅氏培養(yǎng)基的絕對濃度法和比例法，快速培養(yǎng)法以及微孔板法[46]。傳統(tǒng)方法可以直接得到結(jié)核分枝桿菌對異煙肼的敏感性，方法可靠、技術(shù)成熟，缺點是需要細(xì)菌純培養(yǎng)物、檢測周期長，值得一提的是最近幾年應(yīng)用逐漸廣泛的微孔板法由于缺乏密封性對實驗室環(huán)境和設(shè)備的生物安全要求、實驗室人員的操作技能和生物安全意識要求較高，筆者認(rèn)為如果無法對單個反應(yīng)板進(jìn)行密封，也應(yīng)該對多個板形成一個組合進(jìn)行密封。分子生物學(xué)方法基于其原理，主要有反向雜交法、基因芯片法、溶解曲線法等[46]，均建立在異煙肼耐藥相關(guān)基因突變的基礎(chǔ)上，因此其敏感性和特異性均受到人們對異煙肼耐藥機制認(rèn)識的限制，應(yīng)進(jìn)一步加強異煙肼耐藥機制的研究，以建立一種簡單快速和可靠的藥敏檢測方法為臨床用藥提供幫助。

6 總 結(jié)

國內(nèi)外異煙肼耐藥性的流行及其帶來的危害均是較嚴(yán)重的問題，但是否重要主要受當(dāng)?shù)亟Y(jié)核病耐藥性負(fù)擔(dān)的影響，筆者雖然不推薦減少對MDR、RR或者XDR-TB的研究和重視，但是應(yīng)該認(rèn)識到異煙肼耐藥同樣是不容忽視的問題，應(yīng)該加強對異煙肼作用機制、耐藥機制、協(xié)同作用機制以及快速檢測耐藥性方面的研究。