中華鱉Foxl2基因克隆及外源性激素對其表達(dá)的影響

高麗麗 刁曉明 李 云 翟旭亮 周春龍

(1. 西南大學(xué)動物科技學(xué)院, 重慶三峽生態(tài)漁業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院, 重慶 400715; 2. 西南大學(xué)淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715; 3. 重慶市水產(chǎn)技術(shù)推廣站, 重慶 400020)

Foxl2(Forkhead transcriptionfactor gene 2)是叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子超家族(Forkhead transcriptionfactor,FOX)成員之一[1,2], 1993年被發(fā)現(xiàn), 主要在垂體和卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá), 通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)其目的靶基因的轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá), 參與顆粒細(xì)胞的增殖與分化, 與卵巢發(fā)育性二態(tài)分化和卵巢功能維持密切相關(guān)[2—4]。Foxl2突變引起小瞼裂綜合征(BPES)、卵巢早衰(POF)、腫瘤及山羊的無角間性綜合征(PIS)[4—6]。迄今Foxl2基因已在許多脊椎動物和部分無脊椎動物中獲得, 且結(jié)構(gòu)高度保守。Foxl2在哺乳動物中研究最為深入, 被認(rèn)為是雌性相關(guān)基因[4,6]。國外學(xué)者對許多龜鱉動物的Foxl2基因進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究[7,8], 但對于中華鱉Foxl2基因的相關(guān)研究未見文獻(xiàn)報道。

中華鱉(Pelodiscus sinensis)隸屬于爬行綱、龜鱉目、鱉科(Trionychidae)、鱉屬(Pelodiscus), 之前溫度依賴型性別決定模式已被公認(rèn), 但總有20%—30%的個體并沒有沿溫度方向發(fā)育, 遺傳因素是影響其性別發(fā)育方向的重要方面[9]。對于爬行動物, 關(guān)鍵基因除外, 性激素在一定程度調(diào)控性別分化[10,11], 且在不同的發(fā)育階段發(fā)揮不同的作用[12]。

本實(shí)驗(yàn)室克隆了Foxl2 cDNA部分序列, 并以10 mg/kg劑量的MT和E2對中華鱉成鱉進(jìn)行注射實(shí)驗(yàn), 通過分析Foxl2表達(dá)變化, 旨在生理水平顯示外源性激素處理后Foxl2的響應(yīng)模式, 以分析激素與性別相關(guān)基因的關(guān)系, 為中華鱉性別調(diào)控機(jī)制提供一定的生物學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2015年5月22日, 從重慶市北碚區(qū)歇馬鎮(zhèn)星云養(yǎng)殖場購買150只中華鱉, 體長為(12.01±2.01) cm,體寬為(11.20±1.20) cm, 體重為(291.80±103.80) g,置于室內(nèi)淡水循環(huán)養(yǎng)殖池中暫養(yǎng)3d, 水源為曝氣自來水, 水溫為(26±0.5)℃。共分為5個組。

1.2 試劑

17α-甲基睪酮(MT)和17β-雌二醇(E2)購自生工生物工程(上海)股份有限公司, Trizol試劑以及pMD18-T Vector購自Takara, IScriptTMcDNA Synthesis Kit以及SsoFast Eva Green購自Bio-Rad,GoTaq(R)Green MasterMix和BM5000 DNA Marker購自Promega, 其余國產(chǎn)分析純試劑, 購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在本實(shí)驗(yàn)開展的前期, 已經(jīng)研究了中華鱉Foxl2多種組織的時空表達(dá), 結(jié)果表現(xiàn)出典型的性別二態(tài)性, 卵巢表達(dá)量明顯高于精巢表達(dá)量(結(jié)果待發(fā)表),在此研究工作的基礎(chǔ)上, 以同一濃度激素分別注射雌性與雄性個體, 充分顯示E2和MT對中華鱉成鱉Foxl2基因表達(dá)的影響。

在馴養(yǎng)3d后, 剔除體弱或受傷個體, 測量體型參數(shù), 注射激素后放入對應(yīng)編號養(yǎng)殖池。1號池為對照組, 2、3、4、5號池為實(shí)驗(yàn)組。劑量為10 mg/kg,每組設(shè)3個重復(fù), 每個重復(fù)10只, 實(shí)驗(yàn)周期15d。注射后的0、6h、12h、24h、48h、7d和14d時間點(diǎn)隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)個體, 以0為對照組, 并取出卵巢和精巢組織置于液氮中保存?zhèn)溆? 后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存,以備總RNA提取。

1.4 總RNA提取與cDNA合成

上述采集到的組織樣品用研缽在液氮中充分研磨, 取100 mg左右的研磨干粉, 根據(jù)Trizol(TakaRa)一步法提取各組織樣品總RNA, 所得到的總RNA定量到1 μg。通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳, Goldview染色, 檢測RNA的完整性。將所有樣品的總RNA用微量核酸測定儀(NanoDrop 1000)測定其濃度和純度, 確保OD值在1.8—2.0。根據(jù)IScriptTMcDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)試劑盒合成cDNA, 得到的cDNA -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 基因克隆和序列分析

根據(jù)Ensembl網(wǎng)站預(yù)測的中華鱉Foxl2基因mRNA序列, 針對于Foxl2基因的保守區(qū)域, 利用Primer Premier 5.0軟件來設(shè)計(jì)兼并引物, 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中的同源克隆。設(shè)計(jì)好的引物序列由華大基因公司合成; 所涉及的引物如下:Foxl2 (F: 5′-ATGATGGCCAGCTACCAGG-3′, R: 5′-CTAGATG TCTATCCGGGAGTGC-3′); GAPDH (F: 5′-AGAA CATCATTCCAGCATCCA-3′, R: 5′-CTTCATCA CCTTCTTAATGTCGTC-3′, GenBank登錄號:AB 124567.1)。引物均稀釋為10 μmol/L備用。

以卵巢組織的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成第一鏈cDNA, 并將該cDNA作為模板, 使用Foxl2的上、下游引物, 對該目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為25 μL, 擴(kuò)增條件: 94℃ 5min; 35個循環(huán)(94℃ 40s,60℃ 40s); 72℃ 5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1%的瓊脂糖凝膠電泳、切膠并回收純化后連接到pMD18-T載體上, 轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌, 培養(yǎng)過夜, PCR篩選陽性克隆后經(jīng)測序獲得Foxl2基因片段。

根據(jù)NCBI網(wǎng)站的氨基酸序列BLAST分析, 選取一部分典型的脊椎動物物種, 經(jīng)Mega5.0軟件的Neighbor-joining法構(gòu)建各物種Foxl2氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹, 比較中華鱉Foxl2基因與其他物種之間的親緣關(guān)系。用DNAMAN軟件對不同物種的Foxl2基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行多重比對。

1.6 引物設(shè)計(jì)及熒光定量PCR

定量PCR引物設(shè)計(jì)跨越內(nèi)含子以減少基因組DNA的影響, 各引物序列如下:Foxl2 (F: 5′-AGAA CAGCATCCGCCACA-3′, R: 5′-GGGTCCAGCG TCCAGTAGTT-3′); GAPDH (F: 5′-AGAACATCATT CCAGCATCCA-3′, R: 5′-CTTCATCACCTTCTT AATGTCGTC-3′)。

從性腺提取總RNA, 按照IScriptTMcDNA Synthesis Kit (Bio-Rad)試劑盒合成cDNA, 以合成的20 μL cDNA為模板, 使用SsoFast Eva Green (Bio-RAD公司)熒光定量試劑盒。按照以下參數(shù)配置10 μL體系: SsoFast EvaGreen supermix 5 μL, 上下游引物各0.5 μL, cDNA模板1 μL, ddH2O 3 μL, 反應(yīng)液的配制在冰上操作, 每個反應(yīng)3次重復(fù), 各個樣品做3次平行實(shí)驗(yàn), 按以下參數(shù)在CFX-96實(shí)時熒光定量擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增: 95預(yù)變性30s; (95℃, 5s;60.2℃, 30s), 40個循環(huán)。為了保證PCR擴(kuò)增和檢測的特異性(是否含有二聚體), 每個PCR反應(yīng)的程序后都增加溶解曲線, 65—95℃, 5s/0.5℃。

1.7 數(shù)據(jù)分析

目的基因的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法, 2-ΔΔCt值代表目的基因與對照組表達(dá)量之間的倍數(shù)差異。目的基因表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)值用算數(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示, 用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差(One-Way ANOVA)和Tukey B檢驗(yàn)法統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05作為顯著性差異;P＜0.01為非常顯著性差異;P＜0.001為極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 中華鱉Foxl2基因部分cDNA克隆

以卵巢組織cDNA為模板進(jìn)行PCR, 產(chǎn)物電泳顯示一條約為903 bp的片段, 隨后經(jīng)華大基因公司測序, 經(jīng)NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行序列比對, 確定為中華鱉Foxl2基因片段, 編碼大約300個氨基酸殘基。將該序列提交GenBank, 已獲得登錄號: KP734210。

根據(jù)NCBI網(wǎng)站的氨基酸序列BLAST程序進(jìn)行中華鱉Foxl2基因與其他物種同源關(guān)系分析, 結(jié)果表明: 中華鱉與紅耳龜(Trachemys scripta)相似性最高, 達(dá)到99%; 西部錦龜(Chrysemys picta bellii)、密西西比鱷(Alligator mississippiensis)、紅原雞(Gallus gallus)次之, 分別為92%、88%和84%, 其他物種的相似性基本在66%—80%。通過DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對顯示Foxl2具有高度保守的FH結(jié)構(gòu)域(圖 1A)。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹表明: 中華鱉Foxl2與同目爬行動物聚為一分支, 其中與西部錦龜遺傳距離最近(圖 1B)。

2.2 E2對雌雄中華鱉Foxl2基因表達(dá)的影響

如圖 2所示, 處理6h后雌性個體中Foxl2的表達(dá)量高于對照組, 差異不顯著(P＞0.05), 12h和24h后,E2極顯著上調(diào)雌性個體Foxl2的表達(dá)量(P＜0.001),其表達(dá)量呈現(xiàn)與時間相關(guān)的增加趨勢, 分別增加到對照組的8倍和18倍, 尤其在24h出現(xiàn)表達(dá)高峰, 至第48h和第7天時雌性個體Foxl2的表達(dá)量下降, 差異不顯著(P＞0.05); 至14d后E2又顯著提升Foxl2的表達(dá)量(P＜0.05), 達(dá)到對照組的5倍; 處理6h、24h和48h后雄性個體Foxl2的表達(dá)量低于對照組, 差異不顯著(P＞0.05), 至7d之前, E2對雄性個體Foxl2的表達(dá)影響均不顯著(P＞0.05), 至7d和14d后, E2極顯著上調(diào)Foxl2的表達(dá)量(P＜0.001), 均增加到對照組的5倍。

結(jié)果顯示: 1 mg/mL E2明顯促進(jìn)雌性中華鱉Foxl2的表達(dá), 促進(jìn)高峰在24h, 隨著時間的推移其促進(jìn)作用呈現(xiàn)減弱的趨勢; 1 mg/mL E2在注射后期促進(jìn)雄性中華鱉Foxl2的表達(dá), 其促進(jìn)高峰時間比雌性個體大大延遲, 表達(dá)高峰出現(xiàn)在7d和14d, 且其表達(dá)量整體要低于在雌性個體中的表達(dá)量。

2.3 MT對雌雄中華鱉Foxl2基因表達(dá)的影響

如圖 3所示, 處理6h和12h后雌性個體中Foxl2的表達(dá)量高于對照組, 差異不顯著(P＞0.05);至24h之前, MT對雌性個體Foxl2的表達(dá)影響不顯著(P＞0.05), 隨著時間的延長; 至24h后, MT極顯著上調(diào)雌性個體中Foxl2的表達(dá)(P＜0.001), 出現(xiàn)表達(dá)高峰, 達(dá)到對照組的17倍; 至第48h、第7和第14天后,Foxl2的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(P＜0.05),但均穩(wěn)定在高于注射前5倍的水平。處理6h和12h后雄性個體Foxl2的表達(dá)量與對照組持平, 差異不顯著(P＞0.05); 隨著注射時間的延長, 尤其在24h,MT極顯著促進(jìn)Foxl2的表達(dá)(P＜0.001), 出現(xiàn)表達(dá)高峰, 達(dá)到對照組的5倍; 第48h后, 其表達(dá)量低于對照組(P＞0.05); 7d后,Foxl2的表達(dá)量又出現(xiàn)顯著回升的趨勢(P＜0.05); 至14d后, 其表達(dá)量略微下降。

結(jié)果顯示: 1 mg/mL MT明顯促進(jìn)雌性中華鱉Foxl2的表達(dá); 除48h外, 1 mg/mL MT對雄性中華鱉Foxl2的表達(dá)呈現(xiàn)不同程度的促進(jìn)作用, 但其作用沒有雌性明顯, 且無論雌雄, 24h時MT的促進(jìn)作用最強(qiáng)。

3 討論

3.1 中華鱉Foxl2基因序列分析

多重序列比對顯示中華鱉Foxl2基因部分片段含有一個高度保守的FH結(jié)構(gòu)域, 且與其他很多物種具有很高的相似性, 說明該結(jié)構(gòu)域在不同物種生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用; 同源性分析表明, 中華鱉Foxl2基因是已發(fā)現(xiàn)物種Foxl2基因的同源基因, 該基因在進(jìn)化上具有較高的序列保守性和功能一致性; 其中與紅耳龜和西部錦龜?shù)耐葱苑謩e達(dá)到99%和92%, 說明其在進(jìn)化上與爬行類的同源性;聚類分析表明中華鱉與西部錦龜?shù)腇oxl2基因在同一大支, 而與氨基酸同源性較高的紅耳龜?shù)腇oxl2基因親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 這說明Foxl2基因在進(jìn)化過程中承受了不同的選擇壓力, 最終導(dǎo)致不同物種之間該基因的進(jìn)化速率差異, 但是其在進(jìn)化過程中變異還是較小, 且保守性很高, 其演化關(guān)系也與生物學(xué)結(jié)果一致。

3.2 E2對中華鱉Foxl2基因表達(dá)的影響

圖 1 Foxl2氨基酸序列比對及分子進(jìn)化樹分析Fig. 1 Comparing amino acid sequence alignments and phylogenetic analysis of Foxl2

圖 2 E2對雌雄中華鱉Foxl2基因表達(dá)的影響Fig. 2 The effects of E2 on the Foxl2 expression in Pelodiscus sinensis's females and males

圖 3 MT對雌雄中華鱉Foxl2基因表達(dá)的影響Fig. 3 The effects of MT on the Foxl2 expression in Pelodiscus sinensis's females and males

在非哺乳脊椎動物中, 雌激素是卵巢分化的關(guān)鍵因素, 但其作用機(jī)制仍不甚了解。本研究結(jié)果顯示, E2促進(jìn)中華鱉Foxl2基因的表達(dá), 雌性的促進(jìn)作用比雄性明顯, 且其表達(dá)高峰時間比雄性提前(提前一周), 可以判斷E2以不同的途徑調(diào)控中華鱉雌雄個體中Foxl2基因表達(dá)。目前國內(nèi)外對中華鱉Foxl2基因的研究尚少見報道。多數(shù)文獻(xiàn)報道雌激素促進(jìn)Foxl2的表達(dá)[13,14]; 降低雌激素合成或者抑制雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)均可顯著抑制Foxl2的表達(dá)[15,16],如南方鲇(Southern catfish)[17]、虹鱒(Rainbow trout)[18]、雞(Gallus gallus)[19]以及稀有 鯽(Gobiocypris rarus)[20]; 關(guān)于其調(diào)控機(jī)制, 有學(xué)者解釋為Foxl2基因通過激活芳香化酶(雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的關(guān)鍵酶)的表達(dá), 從而共同調(diào)控雌激素的生成[21,22];哺乳動物中也有類似現(xiàn)象[23]; 本研究中雌性的表達(dá)結(jié)果與以上研究結(jié)果一致。雌激素信號傳導(dǎo)過程依賴于細(xì)胞環(huán)境和受體的存在, 即雌激素受體(ERα和ERβ)以及跨膜受體GPER(非基因組通路),基因組通路(ERα和ER)的表達(dá)水平可以發(fā)生轉(zhuǎn)換,這種轉(zhuǎn)換允許E2在不同的方向介導(dǎo)其作用并調(diào)節(jié)未成熟支持細(xì)胞的增殖[24]。正常雌性個體中雌激素受體及其相應(yīng)原件均處于非激活狀態(tài)。從本研究結(jié)果來看E2可能通過激活雌性個體中的ERα或者ERβ來啟動相應(yīng)原件(在基因轉(zhuǎn)錄水平上)上調(diào)Foxl2的表達(dá), 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)激素濃度發(fā)生改變, 則開始調(diào)動GPER來調(diào)節(jié)激素平衡。但是我們并沒有檢測內(nèi)源激素水平和性腺發(fā)育狀態(tài), 所以不能進(jìn)行驗(yàn)證,而且雌激素的具體作用機(jī)制比較復(fù)雜, 這也是我們后續(xù)的研究熱點(diǎn)。

最新研究報道, 雌激素在動物雄性個體中同樣發(fā)揮重要作用, 其中雌激素介導(dǎo)的ERα信號對于生殖細(xì)胞活性和維持生精上皮的正常組織至關(guān)重要。雌激素的生理水平對精子生成至關(guān)重要, 高劑量對精子發(fā)生有損傷作用, 而低劑量則對其有積極作用[24]。Hultman等[25]也發(fā)現(xiàn)EE2處理雄性虹鱒后,Foxl2表達(dá)水平上升。中華鱉雄性個體中Foxl2的表達(dá)水平在E2暴露7d后明顯上升, 這說明E2在雄性中華鱉生長后期發(fā)揮了重要作用, 但是對于具體機(jī)制,尚不清晰, 還需進(jìn)一步研究。

3.3 MT對中華鱉Foxl2基因表達(dá)的影響

中華鱉雌雄個體注射MT后,Foxl2基因表達(dá)增強(qiáng), 在24h時均出現(xiàn)表達(dá)高峰, 之后逐漸減弱, 其變化趨勢可能與體內(nèi)外源MT有效劑量的變化相關(guān),表明中華鱉雌雄個體以相同的節(jié)奏和強(qiáng)度應(yīng)答外源MT, 24h是Foxl2基因應(yīng)激MT的敏感時期, 且MT對雌性個體的作用比雄性強(qiáng)烈。

有文獻(xiàn)報道MT在魚類等性逆轉(zhuǎn)過程中發(fā)揮重要作用[26,27]; Fenseke和Segner[28]用10000 ng/L劑量的MT處理斑馬魚, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP19b表達(dá)量上升。雄激素的信號傳導(dǎo)過程主要依賴以下3個途徑: 直接與雄激素受體(AR)結(jié)合、或者在芳香化酶的作用下轉(zhuǎn)化為雌二醇, 隨后雌二醇與雌激素受體結(jié)合而發(fā)揮效應(yīng), 也可以轉(zhuǎn)化為二氫睪酮(DHT)。本研究結(jié)果表明Foxl2基因的表達(dá)依賴以上機(jī)制的相互作用。MT影響雌雄個體的高峰期一致, 也說明MT促進(jìn)中華鱉Foxl2基因表達(dá)的性別差異較小, 但是以上機(jī)制之間的具體作用機(jī)理及如何切換我們目前還不清楚。而且MT是直接作用于Foxl2基因還是通過間接的激素平衡反饋機(jī)制, 我們也不得而知。我們推測MT暴露不久后, MT轉(zhuǎn)化為了內(nèi)源性的E2, 雌雄性個體的應(yīng)答機(jī)制間接轉(zhuǎn)為擬雌激素效應(yīng), 并通過干擾內(nèi)源性激素的合成及代謝而發(fā)揮作用。此外還有研究表明MT抑制Foxl2基因的表達(dá)[29], 這可能由于多種因素導(dǎo)致, 例如所使用的性激素化合物種類不用; 所采用方法的不同; 注射時間和濃度的差異; 或者是實(shí)驗(yàn)動物所處的不用發(fā)育或生理時期等因素造成的。相關(guān)研究表明, 使用外源雄激素和芳香化酶抑制劑后, 血清中E2水平下調(diào)[30—32], 但是我們沒有檢測中華鱉血清內(nèi)激素含量的變化, 所以無法進(jìn)行驗(yàn)證, 這也是本文的不足之處。

總之, 基因在信號通道和代謝2個水平產(chǎn)生重要影響, 前者具有迅速而猛烈的特性, 后者具有緩沖和補(bǔ)償功能。在中華鱉雌性個體中, 外源性激素是以影響信號通道為主的模式來調(diào)控Foxl2表達(dá);在雄性個體中, 外源性激素打破了中華鱉原有激素的平衡[29], 改變了原有的代謝模式, 逐漸切入信號通道。從我們的實(shí)驗(yàn)中, 可以得出中華鱉雌性個體中Foxl2基因?qū)ν庠葱约に氐膽?yīng)答模式趨于一致,而中華鱉雄性個體中Foxl2基因?qū)ν庠葱约に氐膽?yīng)答模式存在差異, E2和MT均促進(jìn)中華鱉Foxl2基因的表達(dá)。但是不能分析其具體機(jī)制及E2對雄性個體中Foxl2基因的持續(xù)作用, 希望在后續(xù)的研究中得到結(jié)果。