斑馬魚ints12的CRISPR/Cas9敲除及其對UsnRNA剪接的調(diào)控

黃思雨 何牡丹 王厚鵬 孫永華

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室, 武漢 430072;2. 中國科學(xué)院大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院, 北京 100049)

在生物體中, 前體mRNA(pre-mRNA)經(jīng)過一系列加工得到成熟的mRNA, 其中包括前體mRNA中內(nèi)含子的剪切, 這一過程主要由剪接體完成[1]。U-snRNAs (U-rich small nuclear RNAs)是剪接體中的主要核酸組分[2,3]。UsnRNAs是一些富含尿嘧啶的小核RNA, 主要包括有U1-U6等6種UsnRNA。除U6 snRNA由RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄外, 其余的UsnRNAs都由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄, 并產(chǎn)生帶有3′延伸端的RNA前體[4], 這些RNA前體被進一步加工, 剪切掉3′延伸端, 產(chǎn)生成熟的UsnRNAs, 成熟的UsnRNAs被運送到細胞質(zhì)中與RNA剪切相關(guān)蛋白結(jié)合組成UsnRNPs[5,6], 發(fā)揮剪接復(fù)合體的功能。

UsnRNAs由特定的啟動子轉(zhuǎn)錄, 形成UsnRNA-3′box前體, 其3′box將被剪切形成成熟的UsnRNA。研究表明, UsnRNA特定的啟動子及其剪切位點下游的3′box元件都是通過剪切形成成熟UsnRNAs所必需的[7—9]。近年的研究發(fā)現(xiàn), 在UsnRNAs的轉(zhuǎn)錄過程中, 整合因子(Integrator)復(fù)合體對UsnRNAs的3′端加工至關(guān)重要。整合因子復(fù)合體在進化上非常保守, 其直接與RNA聚合酶Ⅱ的C端結(jié)構(gòu)域相互作用[10,11]。在轉(zhuǎn)錄起始時, 整合因子復(fù)合體便結(jié)合在RNA聚合酶Ⅱ的C端結(jié)構(gòu)域上[12], 隨著轉(zhuǎn)錄的進行,當(dāng)UsnRNAs前體的3′box元件被轉(zhuǎn)錄出來后, 整合因子復(fù)合體便結(jié)合在3′box元件上, 對3′ box元件進行剪切, 從而產(chǎn)生成熟的UsnRNAs。

整合因子復(fù)合體包含有14個亞基, 理論上破壞任何一個亞基都會導(dǎo)致UsnRNAs的3′端剪切出現(xiàn)錯誤[13]。INTS12 (Integrator subunit 12)是整合因子復(fù)合體的第12個亞基, 也是其中最小的一個亞基,其分子量約為53 kD[14]。INTS12由N端結(jié)構(gòu)域、PHD結(jié)構(gòu)域和富含絲氨酸的C端結(jié)構(gòu)域組成, 在整合因子復(fù)合體中INTS12與INTS1直接作用在一起[14,15]。斑馬魚是研究發(fā)育生物學(xué)和模擬人類疾病的良好模型[16,17]。利用斑馬魚模型的研究發(fā)現(xiàn), ints5通過調(diào)節(jié)Smad/BMP信號通路影響胚胎的造血作用[18],ints6通過某種未知的機制限制胚胎的背側(cè)組織發(fā)育[19]。但是, 人們對整合因子復(fù)合體其他成員在胚胎和個體發(fā)育中的功能仍知之甚少。特別是關(guān)于INTS12的功能研究, 主要集中于體外培養(yǎng)的細胞水平進行[20]。

基因敲除是研究基因功能的重要技術(shù)手段之一, 第三代人工核酸內(nèi)切酶技術(shù)CRISPR/Cas9近年來已被廣泛運用于各種模式生物的基因功能研究中。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)nanog的母源合子突變體(MZnanog)中ints12的表達水平顯著降低(另文發(fā)表)。在本研究中, 我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了ints12的基因敲除品系, 發(fā)現(xiàn)ints12對斑馬魚UsnRNA的剪切、個體發(fā)育和性別分化有著重要作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用AB品系的野生型斑馬魚來自于國家斑馬魚資源中心(武漢, http://zfish.cn)。斑馬魚飼養(yǎng)于28.5℃恒溫及14h∶10h光暗周期條件下。用于顯微注射的胚胎由雌魚和雄魚自然產(chǎn)卵而得。胚胎發(fā)育階段定義參照文獻[21]。

1.2 方法

基因克隆利用原腸期斑馬魚胚胎cDNA為模板, 參考Ensembl網(wǎng)站上的推導(dǎo)的ints12編碼序列(ENSDARG00000091678)設(shè)計特異引物(F: 5′-CGGGATCCATGGCTGGGACAGTAAGTCT-3′; R:5′-CCATCGATTCATTTCTTCAGTTTTTTCT-3′),PCR擴增斑馬魚ints12基因編碼序列, 用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Thermo, 美國)回收, 克隆入體外轉(zhuǎn)錄載體pCS2+, 測序鑒定。將測序正確的重組質(zhì)粒對應(yīng)的菌液擴大培養(yǎng), 用質(zhì)粒提取試劑盒(Omega, 美國)提取質(zhì)粒。

原位雜交將pCS2-ints12克隆載體用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ線性化, 電泳檢測酶切效率, 用DNA純化試劑盒(Thermo, 美國)回收模板。按以下反應(yīng)體系合成反義RNA探針: DNA模板1 μg, 5× transcription buffer 2 μL, DIG-RNA labeling mix 1 μL,DTT 0.5 μL, RNAsin 0.5 μL, T7 RNA聚合酶1 μL,補水至10 μL, 在37℃反應(yīng)2h, 加入2 μL不含RNA酶的DNaseI和18 μL無酶水, 37℃孵育15min。加入1 μL EDTA (1 mol/L, pH 8.0)終止反應(yīng), 用Sigma Spin reaction clean-up Kit回收探針。

取發(fā)育到實驗所需時期的胚胎, 置于4%多聚甲醛(PFA)中在4℃固定過夜, 第二天將胚胎脫水保存至甲醇中。按照文獻中的方法進行原位雜交實驗[22]。

反轉(zhuǎn)錄定量PCR(qRT-PCR)取發(fā)育至特定時期的不同樣品的斑馬魚胚胎, 用Trizol法提取總RNA, 使用微量分光光度計(Nanodrop 2000,Thermo Scientific, 美國)測定RNA的濃度和純度。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo, 美國)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA。配制反應(yīng)體系: 2× SYBR Green mix 10 μL, 基因特定的定量PCR正反向引物各0.5 μL, 純水8 μL, 在Bio-Rad CFX96定量PCR儀中進行擴增反應(yīng), 反應(yīng)條件:95℃ 3min, 94℃ 15s, 60℃ 15s, 72℃ 45s, 40個循環(huán)。實驗結(jié)果采用2-△△Ct法進行分析[23]。內(nèi)參采用U6或者β-actin。

gRNA設(shè)計和制備針對ints12基因組上編碼Ints12 PHD功能域的第3號外顯子, 利用CRISPR-scan設(shè)計gRNA靶點, 靶點序列為GGAAATGGG TCTTGCTTGTGtgg, 其中小寫字母為PAM序列。以質(zhì)粒pT7-gRNA骨架為模板, 利用含有T7啟動子和gRNA靶點序列的特異性上游引物和通用下游引物gRNA-RP(表 1)擴增gRNA模板[24]。反應(yīng)體系:2×EsTaqMasterMix(康為世紀(jì), 北京)25 μL, 上下游引物各2 μL, pT7-gRNA模板1 μL, 補水至20 μL。反應(yīng)條件: 94℃ 5min, 94℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 30s,30個循環(huán); 最后72℃ 2min。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收模板, MAXIscript T7 Kit (Ambion, 美國)試劑盒體外轉(zhuǎn)錄gRNA, 用 DNase Ⅰ(NEB, 英國)去除DNA模板, 再用Post-reaction clean up Kit (Sigma, 美國)試劑盒純化回收gRNA, 瓊脂糖凝膠電泳檢測gRNA質(zhì)量并測定濃度。

Cas9 mRNA的合成體外轉(zhuǎn)錄斑馬魚密碼子優(yōu)化的Cas9 mRNA[25]。用限制性內(nèi)切酶線性化載體, 回收酶切產(chǎn)物, 使用mMessage mMachine sp6 UltraKit (Ambion, 美國)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進行轉(zhuǎn)錄mRNA, 用微量分光光度計測濃度和純度, 用瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA的質(zhì)量。

顯微注射及突變體的篩選將gRNA和Cas9 mRNA同時注射到1細胞期的胚胎中, 然后使用0.3×Danieau's Buffer于28.5℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至24h, 隨機取30顆胚胎, 用斑馬魚快速裂解試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)提取基因組DNA, 用靶點上下游的擴增引物ints12-cas9-F、ints12-cas9-R(表 1)擴增靶點區(qū)域片段。對PCR產(chǎn)物進行Sanger測序, 通過讀取測序峰圖, 判斷靶點是否有效[25]。將靶點有效的胚胎養(yǎng)至性成熟, 與野生型測交, 取30顆所產(chǎn)F1代胚胎, 提基因組DNA并測序。選取F1代胚胎發(fā)生突變的P0代測交, 大量飼養(yǎng)F1代至性成熟。取F1代剪尾鰭提基因組DNA、PCR擴增、測序, 篩選發(fā)生有效突變的陽性F1代, 與野生型雜交獲得F2代雜合子。同時, 利用野生型和突變體基因組序列的差異, 設(shè)計、篩選出能夠PCR鑒定突變型的引物對ints12-wt-F、ints12-mu-F、ints12-R(表 1), 用于批量篩選突變體。將同一基因型的性成熟F2代雜合子自交, 獲得包含純合子的F3代群體。通過PCR篩選結(jié)合克隆測序, 鑒定F3代純合子個體。

表 1 實驗所用引物及其序列Tab. 1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 ints12在斑馬魚中廣泛表達并在物種間高度保守

斑馬魚Ints12由N端結(jié)構(gòu)域、PHD結(jié)構(gòu)域和富含絲氨酸的C端結(jié)構(gòu)域組成, 包含479個氨基酸(圖 1a)。我們比對人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)和斑馬魚INTS12的氨基酸序列, 發(fā)現(xiàn)INTS12負責(zé)核酸蛋白互作的PHD結(jié)構(gòu)域在各物種間高度保守, 提示ints12的主要功能在各個物種間也應(yīng)該十分保守;同時, 其N端和C端存在較大的序列差異, 提示斑馬魚Ints12蛋白與哺乳動物相比, 在結(jié)構(gòu)和蛋白互作上具有一定的種屬特異性(圖 1b)。

為了研究ints12在斑馬魚中的表達情況, 我們通過原位雜交和定量PCR的方法檢測ints12在野生型早期胚胎中的表達量, 發(fā)現(xiàn)ints12在受精卵時期的胚胎中表達量最高, 在2h、4h和6h的胚胎中, 表達量隨著胚胎的發(fā)育而減少; 當(dāng)胚胎發(fā)育至受精后1d (1 day-post-fertilization, 1dpf)時,ints12的表達區(qū)域廣泛, 但在中樞神經(jīng)的表達量相對較高(圖 2a、2b)。通過定量PCR檢測野生型各組織中ints12的表達量, 發(fā)現(xiàn)ints12在各組織中都有表達, 但在卵巢中的表達量最高(圖 2c)。以上結(jié)果提示Ints12可能作為母源因子發(fā)揮作用。

2.2 利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建ints12基因敲除品系

為了盡可能破壞ints12的結(jié)構(gòu)和功能, 我們將gRNA靶點選擇在PHD結(jié)構(gòu)域的起始處, 即ints12的第3號外顯子末端(圖 3a)。取30顆敲除后胚胎, 提取基因組, 擴增包含靶點的檢測序列, 使用PCR產(chǎn)物的直接Sanger測序法判斷靶點有效性(圖 3b)。通過P0代與野生型測交, 篩選產(chǎn)生有效突變的F1代雜合子, 得到缺失8個堿基和缺失13個堿基的兩個突變品系(圖 3c)。野生型斑馬魚編碼的Ints12蛋白含有479個氨基酸, 而缺失8個堿基的突變品系編碼的Ints12蛋白在第164個氨基酸處出現(xiàn)錯誤翻譯, 并在第182個氨基酸處提前終止翻譯; 缺失13個堿基的突變品系編碼的Ints12蛋白在第161個氨基酸處出現(xiàn)錯誤翻譯, 并在第165個氨基酸處提前終止翻譯(圖 3d)。

因為2個突變品系的純合子突變體的表型一致,所以后續(xù)實驗我們統(tǒng)一使用缺失13個堿基的突變品系。為了更方便能直接使用PCR的方法鑒定突變品系, 我們在突變位點分別針對野生型序列和突變型序列設(shè)計兩條不同的上游引物, 再使用同樣的下游引物分別擴增。野生型引物能擴增出條帶而突變型引物不能擴增出條帶的模板為野生型; 野生型引物和突變型引物都能擴增出條帶的模板為雜合子突變體; 野生型引物不能擴增出條帶而突變型引物能擴增出條帶的模板則為純合子突變體(圖 3e)。利用上述引物對非常方便地篩選出足夠數(shù)目的F2代ints12突變雜合子及F3代合子型突變純合子(Zints12), 以供進一步研究。

圖 1 Ints12的PHD功能域在物種間高度保守Fig. 1 The PHD domain of Ints12 is highly conserved among species

圖 2 ints12在斑馬魚胚胎和各組織中的表達情況Fig. 2 Relative expression levels of ints12 in different embryonic stages and different tissues

圖 3 運用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除斑馬魚ints12Fig. 3 Knockout of zebrafish ints12 by CRISPR/Cas9

為了證實合子型純合突變體Zints12中ints12基因被有效敲除了, 我們通過qRT-PCR的方法檢測Zints12中ints12的表達量, 與野生型相比, Zints12中ints12的表達量顯著減少, 表明Zints12中ints12的敲除導(dǎo)致其自身mRNA水平的降低有效(圖 3f)。

2.3 ints12基因敲除品系中的UsnRNA剪切障礙和細胞增殖缺陷

將同一基因型的F2代雜合子自交, 獲得包含純合子的F3代群體, 利用尾鰭DNA PCR鑒定, 并通過Sanger測序進一步確認, 鑒定F3代純合子。有趣的是, 我們發(fā)現(xiàn)純合子的比例僅為9.5% (9/95), 而雜合子比例為58.9% (56/95), 野生型比例為31.6%(30/95)。純合子的比例明顯低于理論值1/4, 并且篩到的純合子全為雄性, 個體尺寸相對于野生型(WT)普遍偏小, 而雜合子則沒有明顯的生長缺陷。

我們觀察同年齡3個月大的雄性WT和Zints12,發(fā)現(xiàn)Zints12個體大小明顯小于野生型(圖 4a)。持續(xù)觀察記錄以體長為標(biāo)志的雄性Zints12的生長, 發(fā)現(xiàn)Zints12的生長比野生型顯著緩慢(圖 4b)。我們分別測量20條3月齡時WT和Zints12的體重, 發(fā)現(xiàn)Zints12的體重相比野生型顯著偏輕(圖 4c)。

我們通過qRT-PCR檢測Zints12中細胞增殖相關(guān)基因ccnd1[26]、pcna[27]、mki67[28]的表達水平, 發(fā)現(xiàn)ccnd1、pcna、mki67在Zints12中都顯著性下調(diào)表達, 因此推測Zints12個體偏小應(yīng)與Zints12中細胞增殖缺陷相關(guān)(圖 4d)。

為了研究斑馬魚中ints12對UsnRNA剪切的作用, 我們運用qRT-PCR檢測Zints12中沒有被正確剪切的UsnRNA的3′box段[29], 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Zints12中存在大量未被正確剪切的UsnRNA, 且與野生型具有顯著性差異(圖 4e)。這說明在Zints12中UsnRNA的剪切存在明顯障礙,ints12的缺失造成UsnRNA的剪切異常。

因為成熟的UsnRNA在編碼基因pre-mRNA的內(nèi)含子剪切過程中有重要作用, 我們猜想Zints12中成熟UsnRNA的缺失, 是否會進一步影響Zints12中pre-mRNA的內(nèi)含子加工呢? 我們利用ints12第2、4號內(nèi)含子特異的引物(表 1), 檢測ints12基因的內(nèi)含子滯留水平, 相較于外顯子特異引物的結(jié)果(圖 3f),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Zints12中ints12存在顯著更高水平的內(nèi)含子滯留, 這表明Zints12中UsnRNA的剪切障礙使得ints12自身pre-mRNA的加工也出現(xiàn)異常(圖 4f)。

3 討論

本文利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了ints12的基因敲除品系, 得到2種突變類型的純合突變品系。在純合突變體Zints12中UsnRNA的3′box剪切存在明顯的障礙, 這說明斑馬魚中ints12對UsnRNA的3′box剪切有重要的作用。Zints12中UsnRNA的3′box剪切缺陷, 造成Zints12體內(nèi)缺少成熟的Usn-RNA, 使得pre-mRNA的內(nèi)含子剪切過程也受阻, 導(dǎo)致Zints12中ints12 mRNA出現(xiàn)大量內(nèi)含子滯留。

同時,Zints12出現(xiàn)生長緩慢, 體型偏小的現(xiàn)象,并且細胞增殖相關(guān)基因的表達水平出現(xiàn)顯著性下調(diào)。我們推測, 這也是由于Zints12中UsnRNA的3′box剪切缺陷, 影響細胞增殖相關(guān)基因的pre-mRNA的正常加工。我們得到的Zints12全為雄性極有可能是由生殖細胞增殖缺陷所導(dǎo)致, 因為早期生殖細胞的數(shù)目直接影響到斑馬魚的性別發(fā)育[30]。

圖 4 Zints12中UsnRNA的3′端剪切障礙及細胞增殖缺陷Fig. 4 The misprocessing of UsnRNA 3′ ends and cell proliferation defects in Zints12

由于現(xiàn)階段有關(guān)整合因子復(fù)合體的功能研究還不全面, 在脊椎動物體內(nèi)有關(guān)整合因子復(fù)合體的研究更少, 我們不清楚整合因子復(fù)合體在其他方面的功能以及整合因子復(fù)合體各亞基間的聯(lián)系。根據(jù)Zints12體型偏小的表型, 以及Zints12中細胞增殖相關(guān)基因表達水平偏低的現(xiàn)象, 我們猜想ints12除了通過UsnRNA影響到編碼基因的mRNA加工之外,ints12還可能直接在編碼基因的轉(zhuǎn)錄和加工過程中發(fā)揮作用。近來有研究發(fā)現(xiàn), 整合因子復(fù)合體也參與到編碼基因轉(zhuǎn)錄的暫停及延伸過程[31,32]。由于整合因子復(fù)合體各亞基的結(jié)構(gòu)和功能在物種間都十分保守, 我們推測整合因子復(fù)合體也可能會直接影響斑馬魚編碼基因的轉(zhuǎn)錄過程。

由于本研究所獲得的Zints12表現(xiàn)為全雄性的表型, 在接下來的研究中, 需要通過生殖細胞替換(借腹懷胎)技術(shù)[33], 利用野生型的成魚批量產(chǎn)生ints12的突變雌雄配子, 以獲得ints12的母源合子突變體MZints12, 從而更好地刻畫和研究ints12的發(fā)育功能。