L-阿拉伯糖促進(jìn)秀麗隱桿線蟲的生長發(fā)育及降低脂肪合成

吳超，王慧，張曉偉，秦海蘭，周興華，趙延勝,

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

（2.鎮(zhèn)江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心，江蘇鎮(zhèn)江 212000）

L-阿拉伯糖又稱L-樹膠醛糖、果膠糖，其形態(tài)為白色結(jié)晶，對熱和酸穩(wěn)定，廣泛存在于植物中如玉米皮、甘蔗渣[1]。L-阿拉伯糖具有很強(qiáng)的非競爭性抑制蔗糖吸收的功能，能夠減少吸收蔗糖帶來的血清中葡萄糖濃度升高,其甜度是蔗糖的一半，可作為一種新型的低熱量功能型甜味劑[2]。已有研究表明，L-阿拉伯糖具有調(diào)節(jié)血糖吸收、降脂、促進(jìn)腸道消化排毒、防止齲齒等功效[3]，近年來不斷被開發(fā)應(yīng)用。

秀麗隱桿線蟲是一種重要的模式生物，以大腸桿菌OP50為食。它具有結(jié)構(gòu)簡單、身體透明、易于觀察、生命周期短、子代數(shù)目多等生物學(xué)特征[4]，并與人類脂肪代謝路徑相似，各關(guān)鍵步驟的酶相似度較高[5]。通過線蟲的生理生化研究，有助于闡明并揭示食品中功能活性成分對健康的影響及作用機(jī)制。L-阿拉伯糖作為一種食品中重要的代糖來源，目前在模式生物線蟲中的研究較少。因此，本試驗(yàn)擬通過研究 L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲生長發(fā)育和脂肪合成能力的影響，為進(jìn)一步探索開發(fā)其功能活性，并揭示其健康作用機(jī)制提供理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秀麗隱桿線蟲N2野生型、大腸桿菌OP50由東南大學(xué)王大勇實(shí)驗(yàn)室惠贈；L-阿拉伯糖由山東漢糖生物科技有限公司提供；甘油三酯檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；油紅O儲備液、瓊脂粉、NaCl粉末、胰蛋白胨、CaCl2、MgSO4、膽固醇、葡萄糖粉末、異丙醇均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試劑的配制

線蟲裂解液：10%的次氯酸鈉和1 mol/L的氫氧化鈉按照1：1的比例混合，搖勻得到裂解液。M9緩沖液：稱取KH2PO4粉末3 g、Na2HPO4粉末6 g、NaCl粉末5 g于錐形瓶內(nèi)，量取1 mL的1 mol/L硫酸鎂溶液加入，然后在磁力攪拌器上加水至1 L，高壓滅菌后分裝使用。油紅O染液：油紅O儲備液與蒸餾水3：2混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。上述配制的溶液均需過濾除菌。

1.3 主要儀器設(shè)備

體視顯微鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司；多功能酶標(biāo)儀，帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；生化培養(yǎng)箱，上?？茖W(xué)儀器有限公司；高速離心機(jī)，江蘇捷達(dá)離心機(jī)制造有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上?？茖W(xué)儀器有限公司；高壓滅菌鍋，帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；電子天平，沈陽科瑞永興化玻儀器有限公司；一次性培養(yǎng)皿，青島金典生化器材有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 含糖培養(yǎng)基的配制

（1）線蟲生長培養(yǎng)基（Nematode Growth Media，NGM）的配制參照Brenner等[6]的方法：稱取氯化鈉3 g、瓊脂粉17 g、胰蛋白胨2.5 g于錐形瓶中，加入975 mL蒸餾水混勻封口后放入高壓滅菌鍋內(nèi)121 ℃滅菌50 min，待培養(yǎng)液溫度降至60 ℃，依次加入1 mL濃度為1 mol/L的CaCl2、1 mL濃度為1 mol/L的MgSO4、1 mL濃度為5 mg/mL的膽固醇、以及25 mL濃度為1 M的K3PO4緩沖液，混勻后倒入無菌塑料培養(yǎng)皿。

（2）含葡萄糖的NGM培養(yǎng)基：將1 mol/L葡萄糖母液按照1：1000的比例加入NGM培養(yǎng)基內(nèi)。

（3）含L-阿拉伯糖的NGM培養(yǎng)基：配制L-阿拉伯糖濃度分別為5、10、15、20、40 mmol/L，然后按1：1與線蟲混合，再涂布到含葡萄糖的NGM培養(yǎng)基，得到L-阿拉伯糖的終濃度分別是2.5、5、7.5、10、20 mmol/L。

1.4.2 線蟲的培養(yǎng)與同步化

在超凈工作臺上，將1 mL的大腸桿菌OP50涂布到配制好的NMG培養(yǎng)基上，然后自然干燥，放于4 ℃的冰箱內(nèi)備用。將秀麗隱桿線蟲接種于上述含有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為20 ℃，培養(yǎng)到產(chǎn)卵期。用2 mL M9緩沖液將大量處于產(chǎn)卵期的雌雄同體秀麗隱桿線蟲成蟲從NGM固體培養(yǎng)基表面沖洗下來并轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，然后3000 r/min離心1.5 min，棄上清。向EP管中加入1 mL裂解液，上下顛倒混勻裂解5 min，3000 r/min離心1.5 min，棄上清，然后用無菌M9緩沖液反復(fù)清洗3次，充分去除裂解液成分，得到同步化后的蟲卵[7]。

1.4.3 暴露方法

將同步化后的蟲卵置于含有不同濃度的 L-阿拉伯糖并涂有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基，和含有葡萄糖并涂有大腸桿菌 OP50的 NGM 培養(yǎng)基中，20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，此時(shí)秀麗隱桿線蟲處于L4期，再養(yǎng)12 h可測定各項(xiàng)指標(biāo)，同時(shí)進(jìn)行三次平行試驗(yàn)。

1.4.4 生長發(fā)育指標(biāo)的測定[8]

（1）頭部擺動頻率：將秀麗隱桿線蟲置于含有60 μL M9緩沖液的載玻片上，等待其經(jīng)過1 min的適應(yīng)，行為恢復(fù)穩(wěn)定后，在體視顯微鏡下觀察并記錄秀麗隱桿線蟲的頭部擺動頻率。每個(gè)濃度測量20條秀麗隱桿線蟲。頭部擺動頻率的標(biāo)準(zhǔn)為1 min內(nèi)頭部從一側(cè)擺到另一側(cè)再擺回來的次數(shù)。

（2）身體彎曲頻率：將線蟲置于表面未涂有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上，等待線蟲恢復(fù)1 min以去除身體粘附的大腸桿菌，然后在體視顯微鏡下觀察并記錄秀麗隱桿線蟲1 min內(nèi)的身體彎曲頻率。每個(gè)濃度測量20條秀麗隱桿線蟲。一次身體彎曲的標(biāo)準(zhǔn)為假定沿著咽泵的方向是y軸，線蟲爬行過程中身體沿著相應(yīng)x軸方向上的一次改變。

（3）身體長度的測定：將線蟲轉(zhuǎn)移到載玻片上，經(jīng)麻醉劑麻醉，置于顯微鏡下觀察并測量身長。

（4）子代數(shù)目：在涂有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上挑1只待測的線蟲，放置在20 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在產(chǎn)卵期內(nèi)每天將線蟲轉(zhuǎn)移到新的NGM培養(yǎng)基內(nèi)，含有蟲卵的舊平板繼續(xù)放置在 20 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，然后對每個(gè)平板內(nèi)的線蟲的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、相加。等到線蟲的排卵期結(jié)束后，計(jì)算每條線蟲總的子代數(shù)目。

1.4.5 甘油三酯含量的測定

用M9緩沖液將線蟲沖洗三遍，離心棄上清，加入150 μL M9緩沖液超聲破碎蟲體提取甘油三酯，超聲條件：超聲功率為100 W，工作時(shí)間為20 s，暫停時(shí)間為60 s，重復(fù)8個(gè)循環(huán)；或者采用勻漿器進(jìn)行研磨：加入M9緩沖液使得總體積為300 μL，進(jìn)行研磨，最后在倒置顯微鏡下取20 μL蟲液觀察線蟲是否都已經(jīng)破碎（研磨過程需冰?。?。線蟲研磨充分后，將各濃度組研磨管置于 4 ℃離心機(jī)中 5000 r/min離心 10 min，將離心后上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中。根據(jù)試劑盒說明測定甘油三酯含量。

1.4.6 油紅O染色

油紅O染色方法參照Ramirez等的染色方法[9]，每個(gè)濃度組取生長至L4末期的線蟲，用M9緩沖液將平板中的線蟲洗脫于離心管中，轉(zhuǎn)速為1500 r/min離心2 min去上清，重復(fù)洗脫三次；加入體積分?jǐn)?shù)為60%的異丙醇，使線蟲脫水，15 min后洗去異丙醇溶液；加入油紅O染色30 min，用M9反復(fù)沖洗6次；將線蟲轉(zhuǎn)移到NGM平板上，隨機(jī)挑取20只線蟲置于載玻片上，顯微鏡下觀察拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 12.0進(jìn)行顯著性分析，顯著水平設(shè)定為*p＜0.05、**p＜0.01。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲生長指標(biāo)的影響

2.1.1 L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲頭部擺動頻率的影響

頭部擺動頻率是線蟲運(yùn)動能力的一項(xiàng)重要指標(biāo)，將葡萄糖作為對照組，設(shè)置L-阿拉伯糖的濃度分別為2.5、5、7.5、10、20 mmol/L，研究不同濃度下秀麗隱桿線蟲的頭部擺動頻率變化。結(jié)果如圖1顯示，當(dāng)L-阿拉伯糖濃度為5 mmol/L時(shí)，線蟲頭部擺動頻率出現(xiàn)顯著性增加（p＜0.05），與對照組相比增加了16.43%；當(dāng)濃度在 7.5～20 mmol/L時(shí)，出現(xiàn)極顯著性增長（p＜0.01）；與對照組相比，20 mmol/L組的頭部擺動頻率增加了19.72%；試驗(yàn)結(jié)果表明，L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲的頭部擺動頻率有顯著性促進(jìn)作用。

圖1 L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲頭部擺動頻率的影響Fig.1 Effect of L-arabinose on the head swing frequency of Caenorhabditis elegans

2.1.2 L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲身體彎曲頻率的影響

線蟲身體彎曲頻率的大小表明其運(yùn)動能力的強(qiáng)弱。如圖2所示，當(dāng)L-阿拉伯糖濃度為2.5 mmol/L和10 mmol/L時(shí)，線蟲身體彎曲頻率稍有增長，相對于對照組分別增加了 7.32%、9.02%；隨著 L-阿拉伯糖濃度的增加，線蟲身體彎曲的頻率保持相對穩(wěn)定的水平狀態(tài)。但統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，與葡萄糖對照組相比，L-阿拉伯糖對線蟲身體彎曲頻率的影響效果不顯著（p＜0.05，p＜0.01）。

圖2 L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲身體彎曲頻率的影響Fig.2 Effect of L-arabinose on body bending frequency of Caenorhabditis elegans

2.1.3 L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲子代數(shù)目的影響

不同濃度 L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲子代數(shù)目的影響結(jié)果如圖 3所示，當(dāng) L-阿拉伯糖濃度為 2.5 mmol/L時(shí)，子代數(shù)目最多，相對于對照組增加了1.43%；但隨著 L-阿拉伯糖濃度的增加，秀麗隱桿線蟲的子代數(shù)目沒有顯著性的增加或減少（p＜0.05，p＜0.01），維持在一個(gè)較為穩(wěn)定的水平，表明在現(xiàn)有濃度作用下，L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲子代數(shù)目無顯著影響。

圖3 L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲子代數(shù)目的影響Fig.3 Effect of L-arabinose on the brood size of Caenorhabditis elegans

2.1.4 L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲身體長度的影響

如圖4結(jié)果顯示，與對照組相比，當(dāng)L-阿拉伯糖濃度為2.5 mmol/L，線蟲身體長度開始出現(xiàn)增長的狀態(tài)，說明此時(shí)阿拉伯糖的濃度有促進(jìn)線蟲身體生長作用；當(dāng)濃度達(dá)到7.5 mmol/L時(shí)，線蟲身體長度增長明顯（p＜0.05），與對照組相比增加了 10.89%；當(dāng)濃度大于7.5 mmol/L，與5 mmol/L濃度下的線蟲身體長度相比無明顯變化，維持在較為穩(wěn)定的水平。

圖4 L-阿拉伯糖濃度對秀麗隱桿線蟲身體長度的影響Fig.4 Effect of L-arabinose on body length of Caenorhabditis elegans

2.2 甘油三酯含量的測定

甘油三酯是脂肪合成的重要原料，如果甘油三酯含量降低，將會導(dǎo)致脂肪合成的減少，從而達(dá)到降脂的效果。圖5結(jié)果顯示，在2.5～20 mmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著L-阿拉伯糖濃度的逐漸增加，與葡萄糖對照組相比，L-阿拉伯糖試驗(yàn)組中秀麗線蟲體內(nèi)的甘油三酯含量下降均極為顯著（p＜0.01）；當(dāng)L-阿拉伯糖濃度為2.5 mmol/L，相比于對照組其甘油三酯含量降低了45.56%；而當(dāng)L-阿拉伯糖濃度為20 mmol/L時(shí)，線蟲體內(nèi)的甘油三酯含量與對照組相比降低了67.34%，說明L-阿拉伯糖具有良好的降低線蟲脂肪合成的能力。

圖5 L-阿拉伯糖對甘油三酯含量的影響Fig.5 Effect of L-arabinose on triglyceride contents

2.3 油紅O染色

試驗(yàn)通過油紅O染色檢測分析了線蟲體內(nèi)脂肪的變化情況。圖6結(jié)果可以直觀的顯示，試驗(yàn)組線蟲的脂肪含量明顯要低于對照組，且隨著L-阿拉伯糖濃度的不斷增加脂肪含量逐漸減少。這一試驗(yàn)結(jié)果和甘油三酯含量測定結(jié)果相同，進(jìn)一步說明L-阿拉伯糖具有明顯的降低脂肪合成作用，具有一定的降脂功效。

圖6 油紅O染色結(jié)果Fig.6 The results of oil red O staining

3 結(jié)論

隨著 L-阿拉伯糖功能性質(zhì)研究的深入以及生產(chǎn)成本的逐漸降低，其在食品、保健、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。本文通過研究不同濃度L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲生長發(fā)育的影響，結(jié)果表明L-阿拉伯糖能夠一定程度上促進(jìn)秀麗隱桿線蟲的頭部擺動頻率和身體的生長；已有研究報(bào)道指出，經(jīng)L-阿拉伯糖作用后大鼠體重、空腹血糖、甘油三酯含量均有明顯下降[10]，L-阿拉伯糖對人體腸道血糖酶活性也有降低作用[11]。本研究通過線蟲體內(nèi)甘油三酯含量的測定和油紅O染色試驗(yàn)，表明L-阿拉伯糖可能通過調(diào)控糖脂代謝相關(guān)基因從而降低線蟲體內(nèi)甘油三酯含量，導(dǎo)致了脂肪合成量的減少；李凱[12]研究報(bào)道了L-阿拉伯糖可通過上調(diào)控肝臟CPT-Iα、PDK4 mRNA的表達(dá)，下調(diào)ACCαmRNA的表達(dá)，使大鼠糖脂代謝改善、體重增加有延緩趨勢?；谝陨显囼?yàn)及其研究結(jié)果，可進(jìn)一步通過分子生物學(xué)等手段，以秀麗隱桿線蟲作為研究對象，繼續(xù)探索并解析L-阿拉伯糖對生物體糖脂代謝等方面的調(diào)節(jié)機(jī)制，有助于明確L-阿拉伯糖這一重要代糖資源的生理功能及其健康促進(jìn)功效。