豬傳染性胸膜肺炎黃芪多糖滅活疫苗免疫效果的研究

胡迎東

（江西宜春學(xué)院，江西 宜春 336000）

豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia，PCP） 是由胸膜肺炎放線桿菌 (Actinobacillus pleuropneu-moniae，APP)引起豬的一種以胸膜炎和肺炎為主要特征的高度傳染性呼吸道傳染病[1]。APP對(duì)豬具有高度宿主特異性，病原可通過飛沫擴(kuò)散傳播，各階段豬均對(duì)其易感，尤其是斷奶仔豬在環(huán)境條件溫度、濕度應(yīng)激下多發(fā)，造成飼料的報(bào)酬降低和藥物的防制費(fèi)用增加，給養(yǎng)豬場造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。近些年來呈不斷上升趨勢，APP現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有15個(gè)血清型，而在不同地區(qū)流行的血清型可能有所差異，主要以 1、3、7型為主[2-4]，從而降低了現(xiàn)有多價(jià)疫苗的免疫效果，給該病的防控帶來了巨大困難。

黃芪多糖(Astragaluspolysaccharin，APS)是中藥黃芪的主要生物活性成分，具有提高T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的數(shù)量和功能，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生等作用[5-7］；近年來，很多研究證實(shí)黃芪多糖能明顯增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫和特異性免疫，顯著提高機(jī)體的抗病力和抵抗力水平，可作為多種疫苗的免疫增強(qiáng)劑，提高疫苗的免疫效果[8-10］；同時(shí)APS作為天然藥物成分，具有對(duì)動(dòng)物機(jī)體毒副作用小、無殘留等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于綠色畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

本試驗(yàn)通過對(duì)江西某地區(qū)分離鑒定的胸膜肺炎放線桿菌進(jìn)行分離培養(yǎng)后，用甲醛進(jìn)行滅活，加入黃芪多糖佐劑，制成黃芪多糖滅活苗；然后對(duì)疫苗的物理性狀、安全性、有效性等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，探討黃芪多糖對(duì)豬胸膜肺炎放線桿菌滅活苗的免疫增強(qiáng)效果，探索黃芪多糖作為一種胸膜肺炎放線桿菌疫苗佐劑的可行性，為黃芪多糖在胸膜肺炎放線桿菌疫苗免疫中的推廣應(yīng)用提供理論支持。

1 材料

黃芪多糖購自山河南聚豐飼料科技有限公司；6周齡仔豬來當(dāng)?shù)谹PP陰性養(yǎng)豬場，經(jīng)IHA檢測,APP血清抗體效價(jià)均小于1∶4。豬胸膜肺炎放線桿菌ApxIV ELISA抗體檢測試劑盒，購自武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司。

2 方法

2.1 菌的擴(kuò)增

將分離鑒定的胸膜肺炎放線桿菌種子液1%接種于TSB液體培養(yǎng)基，37℃條件CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，分別接種于普通瓊脂、厭氧肉肝湯、馬丁肉湯37℃恒溫箱培養(yǎng)48 h，檢測其有無雜菌生長。

2.2 豬胸膜肺炎黃芪多糖佐劑滅活疫苗的制備

2.2.1 滅活條件的選擇。TSB液體培養(yǎng)基24 h胸膜肺炎放線桿菌培養(yǎng)物，用PBS液（pH7.4）稀釋至含菌濃度為4×109CPU/mL，然后分別加入終濃度為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的甲醛，搖晃均勻，37℃每隔2h將其搖勻一下，使其充分滅活24 h。然后用滅菌接種環(huán)在每個(gè)滅活濃度的中蘸取少量菌液，TSA培養(yǎng)基上劃線,37℃條件CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，看有無細(xì)菌生長。

2.2.2 無菌實(shí)驗(yàn) 。取含菌濃度為4×109CPU/mL的胸膜肺炎放線桿菌菌液，加入上述試驗(yàn)甲醛的最佳滅菌濃度攪拌均勻，37℃每隔2 h將其搖勻一次，滅活24 h。滅活后取樣分別接種于TSA培養(yǎng)基37℃條件CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，普通瓊脂、厭氧肉肝湯、馬丁肉湯37℃恒溫箱培養(yǎng)48 h，觀察是否有細(xì)菌生長。

2.2.3 黃芪多糖佐劑滅活疫苗的制備。在保持疫苗抗原劑量為1 mL、2 mL、3 mL的條件下，將滅活完全的豬胸膜肺炎放線桿菌菌液與黃芪多糖混合,分別制成黃芪多糖終濃度1 000 mg/L、500 mg/L和250 mg/L的高、中、低黃芪多糖佐劑滅活疫苗，用膠體磨高速混勻。

2.2.4 疫苗使用劑量的測定。濃度為0.4%的甲醛進(jìn)行滅活處理后，并將該疫苗1 mL/只的免疫量定為1個(gè)單位抗原劑量；6周齡的健康仔豬分為4大組，1A、1B、1C、2A、2B、2C、3A、3B、3C及第 4 組，均為 2頭，共20頭。

1A組于耳后肌肉分別注射所制備的疫苗1mL，其中含有黃芪多糖終濃度250 mg/L，1B組于耳后肌肉分別注射所制備的疫苗1 mL，其中含有黃芪多糖終濃度500 mg/L，1C組于耳后肌肉分別注射所制備的疫苗1mL，其中含有黃芪多糖終濃度為1 000 mg/L；

2A組于耳后肌肉分別注射所制備的疫苗2 mL，其中含有黃芪多糖終濃度250 mg/L，2B組于耳后肌肉分別注射所制備的疫苗2 mL，其中含有黃芪多糖終濃度500 mg/L，2C組于耳后肌肉分別注射所制備的疫苗2 mL，其中含有黃芪多糖終濃度為1 000 mg/L；

3A組于耳后肌肉分別注射所制備的疫苗3 mL，其中含有黃芪多糖終濃度250 mg/L，3B組于耳后肌肉分別注射所制備的疫苗3 mL，其中含有黃芪多糖終濃度500 mg/L，3C組于耳后肌肉分別注射所制備的疫苗3 mL，其中含有黃芪多糖終濃度為1 000 mg/L；

第4組作為對(duì)照組，首次免疫之后3周再分別對(duì)第1、2、3 組加強(qiáng)免疫 1 mL、2 mL、3 mL一次，2 周后分別對(duì)4組實(shí)驗(yàn)豬只攻毒，攻毒劑量為1×107CPU/只。攻毒后每日觀察各組豬只的體溫、健康狀況及發(fā)病死亡情況。

2.3 疫苗的安全性檢測

選取8頭6周齡的健康仔豬，分為4組，第1組為常規(guī)免疫劑量組，第2組為超劑量免疫組，第3組為對(duì)照組，對(duì)第1組的仔豬頸部肌肉注射2 mL疫苗，超劑量組免疫接種注射10 mL疫苗，對(duì)照組不接種，觀察1周，每日測定體溫，注射部位有無炎癥，并觀察是否有針對(duì)免疫的副反應(yīng)及仔豬的健康狀況。

2.4 疫苗對(duì)健康仔豬的免疫保護(hù)力實(shí)驗(yàn)

2.4.1 選取15頭6周齡的健康仔豬，分為實(shí)驗(yàn)組10頭，另設(shè)對(duì)照組5頭。以黃芪多糖滅活疫苗使用劑量為2 mL/只（其中黃芪多糖含量為500 mg/L）對(duì)10頭仔豬進(jìn)行初次免疫，3周后進(jìn)行二次免疫，免疫劑量方法同初免，在二免之后 14d、21d、30d、60d、90 d分別選取2頭免疫組豬只采取少量血清進(jìn)行豬胸膜肺炎放線桿菌ELISA抗體測定。

2.4.2 在進(jìn)行豬胸膜肺炎放線桿菌ELISA抗體測定后對(duì)采血后動(dòng)物進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，方式是以鼻腔接種的方式對(duì)免疫組接種豬胸膜肺炎放線桿菌強(qiáng)毒，攻毒劑量為1×107CPU/只；攻毒免疫組的同時(shí)，選取對(duì)照組一頭豬只進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，每日測量其體溫、觀察記錄其健康狀況。對(duì)瀕死或病癥嚴(yán)重的豬只進(jìn)行剖檢，觀察病理變化，采集典型病料于-20℃保存。

3 結(jié)果

3.1 菌的擴(kuò)增

將分離鑒定的胸膜肺炎放線桿菌種子液1%接種于TSB液體培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)24 h，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，檢測結(jié)果為無雜菌生長。

3.2 豬胸膜肺炎黃芪多糖佐劑滅活疫苗的制備

3.2.1 滅活條件的選擇。取TSB液體培養(yǎng)基24 h豬胸膜肺炎放線桿菌培養(yǎng)物，用PBS液（pH7.4）稀釋至含菌濃度為4×109CPU/mL，然后分別加入終濃度為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的甲醛，搖晃均勻，37℃每隔2 h將其搖勻一下，使其充分滅活24 h。然后用滅菌接種環(huán)在每個(gè)滅活濃度的中蘸取少量菌液，TSA培養(yǎng)基上劃線，37℃恒溫箱培養(yǎng) 48 h，0.2%、0.3%濃度的甲醛滅活時(shí)有少量細(xì)菌生長，而0.4%、0.5%濃度的甲醛滅活時(shí)無細(xì)菌生長，所以豬胸膜肺炎放線桿菌最佳滅活條件為甲醛濃度為0.4%、37℃滅活 24 h。

3.2.2 黃芪多糖滅活疫苗的無菌實(shí)驗(yàn)。取含菌濃度為4×109CPU/mL的豬胸膜肺炎放線桿菌菌液，加入上述試驗(yàn)甲醛的最佳滅菌濃度攪拌均勻，37℃每隔2 h將其搖勻一次，滅活24 h。滅活后取樣分別接種于TSA培養(yǎng)基37℃條件CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h、普通瓊脂、厭氧肉肝湯、馬丁肉湯37℃恒溫箱培養(yǎng)48h，無細(xì)菌及霉菌等微生物生長。說明該黃芪多糖滅活疫苗純粹無雜菌。

3.2.3 疫苗使用劑量的測定。待前3大組二免后2周，以1×107CPU/只的劑量對(duì)所有4組進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，攻毒后每日觀察各組豬只的體溫、健康狀況及發(fā)病死亡情況，結(jié)果如下（見表1）：第1組豬均出現(xiàn)食欲下降、間斷性咳嗽的癥狀，第2A組出現(xiàn)間斷性咳嗽癥狀、2B、2C組及第3組無癥狀，第4組病豬發(fā)熱、咳嗽，全部死亡。所以黃芪多糖滅活疫苗的使用劑量為2 mL/只，黃芪多糖劑量含量為500 mg/L。

表1 疫苗接種劑量測量結(jié)果

3.3 黃芪多糖滅活疫苗的安全性檢測

從表2中可以看出，常規(guī)免疫劑量（2 mL）組、超劑量免疫組（10 mL）及對(duì)照組均體溫、食欲等均正常，未出現(xiàn)呼吸困難、行動(dòng)緩慢等癥狀，說明黃芪多糖滅活疫苗沒有不良反應(yīng)，安全性好。

3.4 疫苗對(duì)健康仔豬的保護(hù)力實(shí)驗(yàn)

表2 黃芪多糖滅活疫苗的安全性檢測結(jié)果

3.4.1 在二免之后 14 d、21 d、30 d、60 d、90 d 分別選取2頭免疫組豬只采取少量血清進(jìn)行豬胸膜肺炎放線桿菌ELISA抗體測定。在450 nm處測量記錄樣品和對(duì)照的吸光度值，計(jì)算抗體阻斷率(S/P)，公式為S/P=(樣品OD值-陰性對(duì)照OD值)/(陽性對(duì)照OD值-陰性對(duì)照OD值)×100%，并計(jì)算抗體平均阻斷率。檢測結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為:S/P＜0.3為陰性，S/P≥0.4為陽性，0.3≤S/P＜0.4為可疑;結(jié)果如下表3：

由表3中數(shù)據(jù)可以看出，二免后仔豬傳染性胸膜肺炎的抗體平均阻斷率逐漸升高，在二免后第30天達(dá)到高峰，隨后抗體平均阻斷率逐漸下降，但仍維持在較高水平。

表3 不同日齡試驗(yàn)仔豬二免后豬胸膜肺炎放線桿菌抗體平均阻斷率

3.4.2 以2 mL黃芪多糖滅活疫苗免疫劑量對(duì)10頭仔豬進(jìn)行免疫,攻毒實(shí)驗(yàn)時(shí)間為加強(qiáng)免疫后14d、21d、30 d、60 d、90 d，另設(shè)對(duì)照組 5 頭。表 4 結(jié)果顯示:二免后 14 d、21 d、30 d、60 d 免疫實(shí)驗(yàn)組未發(fā)病，90 d 組有一只發(fā)病，發(fā)病率10%，疫苗保護(hù)率總體為90%；而對(duì)照組均表現(xiàn)出發(fā)熱、咳嗽等癥狀。

表4 疫苗對(duì)仔豬的保護(hù)率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 小結(jié)

4.1 對(duì)制苗菌株生產(chǎn)的抗原滅活后進(jìn)行了滅活檢驗(yàn),實(shí)驗(yàn)最終確定甲醛的滅活抗原條件為甲醛濃度為0.4%、37℃滅活 24 h。

4.2 在滅活完全的基礎(chǔ)上，最終確定在疫苗使用劑量為2 mL/只，其中黃芪多糖含量為500 mg/L時(shí)能顯著提高動(dòng)物保護(hù)能力。

4.3 對(duì)疫苗進(jìn)行的大劑量安全性試驗(yàn)表明,用2 mL/只的疫苗免疫劑量免疫豬群無不良反應(yīng)，安全可靠，無毒副作用，安全性好。

4.4 對(duì)二免之后 14 d、21 d、30 d、60 d、90 d 的豬只進(jìn)行豬胸膜肺炎放線桿菌ELISA抗體測定，表明二免后仔豬傳染性胸膜肺炎的抗體平均阻斷率逐漸升高，在二免后第30天達(dá)到高峰，隨后抗體平均阻斷率逐漸下降，但仍維持在較高水平；攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明二免后 14 d、21 d、30 d、60 d 免疫實(shí)驗(yàn)組未發(fā)病，90 d組有1頭發(fā)病，發(fā)病率10%，疫苗保護(hù)率總體為90%；而對(duì)照組均表現(xiàn)出發(fā)熱、咳嗽等癥狀，說明黃芪多糖豬傳染性胸膜肺炎滅活苗具有較好的免疫保護(hù)性。

綜上所述，黃芪多糖含量為500 mg/L時(shí)能顯著提高仔豬傳染性胸膜肺炎滅活疫苗的免疫效果，使免疫豬群獲得具有較好的免疫保護(hù)性，具有一定的應(yīng)用前景。