N-乙酰半胱氨酸對(duì)2型糖尿病大鼠肝氧化應(yīng)激及FoxO1活性的影響

雷少青，王雅楓，周璐，張?jiān)闹性?，蘇娃婷

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，武漢 430060)

糖尿病是一種以持續(xù)高血糖為主要特征的代謝紊亂性疾病，其控制不良往往會(huì)導(dǎo)致心臟、腦、腎、眼、周圍神經(jīng)等多種組織器官功能損害，因而被社會(huì)廣泛關(guān)注。流行病學(xué)資料顯示：近70%的2型糖尿病患者存在慢性肝損害，其中最為常見(jiàn)的是非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)[1-2]，但由于肝具有較強(qiáng)的代償功能且早期肝損傷不明顯，因而糖尿病所導(dǎo)致的肝病變未引起臨床醫(yī)師及患者重視。研究顯示，NAFLD與糖尿病可相互促進(jìn)，并形成惡性循環(huán)，從而加速疾病進(jìn)展[3-4]。盡管糖尿病患者易發(fā)生肝損害的具體機(jī)制不詳，但已有證據(jù)表明高血糖所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是其發(fā)生發(fā)展的重要始發(fā)因素[5]。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O亞型1(forkhead transcription factor of class O1)是機(jī)體調(diào)控代謝的重要因子，其活性受胰島素負(fù)性調(diào)控[6]。在糖尿病狀態(tài)下，F(xiàn)oxO1過(guò)度活化可增加脂肪酸的攝取及氧化，同時(shí)抑制葡萄糖氧化利用率，當(dāng)脂肪酸攝入量超過(guò)細(xì)胞的代謝能力時(shí)，將導(dǎo)致細(xì)胞線粒體功能紊亂而產(chǎn)生過(guò)量ROS(reactive oxygen species)致細(xì)胞損傷[7-8]。由此可見(jiàn)，F(xiàn)oxO1過(guò)度活化也可能是糖尿病氧化應(yīng)激的重要機(jī)制。盡管如此，目前關(guān)于氧化應(yīng)激與FoxO1過(guò)度活化在糖尿病肝損害中的具體作用關(guān)系仍然不明。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是一種含巰基的自由基清除劑，并是抗氧化劑谷胱甘肽的前體，因此被廣泛用來(lái)去除氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的ROS[9]。本研究旨在觀察2型糖尿病大鼠肝組織的抗氧化狀態(tài)及FoxO1的活性，并觀察抗氧化劑NAC干預(yù)對(duì)其的影響，以探究糖尿病相關(guān)肝損害的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24只SPF級(jí)雄性SD大鼠，7～8周齡，180～220 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供【SCXK(鄂)2015-0018】，飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心【SYXK(鄂)2015-0027】。

1.1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素與N-乙酰半胱氨酸(NAC)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、丙二醛和三磷酸腺苷(比色法)含量測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；一抗FoxO1購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；預(yù)染Marker、GAPDH、H3、Caspase-3與二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；全自動(dòng)生化分析儀(日本東芝公司)；美國(guó)強(qiáng)生血糖分析儀。

1.2 方法

1.2.1 模型制作

SD大鼠以標(biāo)準(zhǔn)飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)列將大鼠分為正常對(duì)照組(C)、糖尿病組(D)及NAC治療組(D+NAC)。D組與D+NAC組給予高脂飲食喂養(yǎng)4周后開(kāi)始造糖尿病模型。造模前禁食12 h，腹腔注射小劑量STZ(25 mg/kg)，連續(xù)3 d血糖值超過(guò)11.1 mmol/L為2型糖尿病成功模型。D+NAC組大鼠灌胃給予NAC 1.5 g/(kg·d)[9]，C組與D組大鼠給予同體積生理鹽水。C組大鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飲食，D組與D+NAC組大鼠繼續(xù)給予高脂飲食，持續(xù)8周。

1.2.2 標(biāo)本收集與指標(biāo)檢測(cè)

(1)一般指標(biāo)

試驗(yàn)期間，每周監(jiān)測(cè)大鼠血糖、體重一次，NAC治療后第4周與第8周分別記錄24 h進(jìn)食量與飲水量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，記錄體重、肝重，并計(jì)算肝重指數(shù)=肝重/體重×100%。

(2)樣本收集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉(65 mg/kg)麻醉及肝素抗凝后，處死大鼠，從下腔靜脈收集血液，隨后獲取肝組織，所有標(biāo)本(血漿與肝組織)于-80℃冰箱保存。

(3)血漿指標(biāo)檢測(cè)

全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)三酰甘油(triglyceride，TG)、血漿游離脂肪酸(free fat acid，F(xiàn)FA)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平；應(yīng)用試劑盒檢測(cè)血漿MDA水平，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

(4)肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

將部分肝組織進(jìn)行勻漿，提出上清液及BCA法測(cè)定蛋白濃度后，檢測(cè)肝組織標(biāo)本中的SOD、CAT、GSH-Px和MDA水平，所有操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

(5)肝組織ATP含量測(cè)定

ATP水平可以直接反映線粒體功能。將上述的肝組織上清液經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度后，用試劑盒檢測(cè)肝組織標(biāo)本中的ATP水平，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

(6)Western blot分析肝組織總蛋白中的Caspase-3及細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中FoxO1蛋白表達(dá)水平

嚴(yán)格按照碧云天生物蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取肝組織總蛋白及細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核蛋白，BCA法測(cè)定其蛋白濃度。上樣量為50～100 μg，10%～12.5% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)到PVDF膜；常溫封閉2 h后，加入一抗Caspase-3(1∶1000, Cell Signaling)，F(xiàn)oxO1 (1∶500, Santa Cruz Biotechnology)，GAPDH (1∶2000, Cell Signaling)，H3 (1∶1000, Cell Signaling)，4℃孵育過(guò)夜；再次洗膜后加入二抗(anti-rabbit IgG，1∶10 000, Cell Signaling)中室溫孵育2 h；按奧德賽 (Gene Company Limited) 操作人員手冊(cè)掃描條帶，分析并導(dǎo)出蛋白條帶，計(jì)算目標(biāo)條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較

如表1所示，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束階段，與C組相比，D組大鼠24 h進(jìn)食量與飲水量、血糖水平及肝重指數(shù)明顯增加，而體重明顯減輕(P<0.01)。與D組比較，D+NAC組大鼠24 h進(jìn)食量與飲水量均有減少(P< 0.05)，但血糖水平、體重及肝重指數(shù)未有統(tǒng)計(jì)學(xué)改變。值得注意的是，在本實(shí)驗(yàn)的前期研究中，我們未發(fā)現(xiàn)NAC干預(yù)對(duì)正常大鼠的一般情況有顯著影響(結(jié)果未顯示)，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)C+NAC組大鼠相關(guān)指標(biāo)的變化。

2.2 各組大鼠血漿TG、FFA、ALT、AST及MDA水平

如表2所示，與C組相比，D組大鼠血漿中TG、FFA、ALT、AST及MDA水平均顯著增加(P<0.01)；與D組比較，D+NAC組大鼠血漿TG、FFA、ALT、AST與MDA水平均明顯降低(P<0.05)，但仍明顯高于C組(P<0.05)。

2.3 各組大鼠肝組織SOD、CAT、GSH-Px、MDA及ATP水平

如表3所示，與C組比較，D組大鼠肝組織中SOD、CAT與GSH-Px活性及ATP含量均顯著降低(P<0.05)，而脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA含量明顯增加(P<0.01)；與D組比較，D+NAC組大鼠SOD、CAT與GSH-Px活性及ATP含量均明顯增加(P<0.05)，MDA含量盡管仍高于C組但顯著低于D組(P<0.05)。

表1 各組大鼠一般情況Table 1 General characteristics of rats at the end of the study(n=8,

注：與C組比較,*P<0.05，**P<0.01；與D 組比較，#P<0.05。C：正常對(duì)照組；D：糖尿病組；D+NAC：糖尿病+N-乙酰半胱氨酸治療組。(下表和圖同)。

Note. Compared with group C,*P<0.05,**P<0.01. Compared with group D,#P<0.05. C: control group; D: diabetic group; D+NAC: diabetes with N-acetylcysteine (NAC) treated group.(The same in the following Figures and Tables).

表2 各組大鼠血漿TG、FFA、ALT、AST及MDA水平Table 2 Plasma levels of TG, ALT, AST and MDA in rats of each

表3 各組大鼠肝組織SOD、CAT、GSH-Px及MDA水平Table 3 The levels of SOD, CAT, GSH-Px and MDA in liver tissues of rats in each group(n=8,

2.4 各組大鼠肝組織Caspase-3表達(dá)水平

如圖1所示，與C組比較，D組大鼠肝組織Caspase-3表達(dá)水平顯著降低(P< 0.01)，提示糖尿病肝組織凋亡水平增加；抗氧化劑NAC治療后顯著降低Caspase-3表達(dá)水平。

圖1 各組大鼠肝組織Caspase-3蛋白表達(dá)水平Figure 1 Caspase-3 expression in liver tissues of rats in each group

2.5 各組大鼠肝組織FoxO1活性水平

如圖2所示，與C組比較，D組大鼠肝組織細(xì)胞質(zhì)成分中FoxO1表達(dá)顯著降低，而細(xì)胞核中FoxO1表達(dá)顯著增加(P< 0.01)，提示糖尿病肝組織FoxO1活性顯著增強(qiáng)；抗氧化劑NAC治療后顯著降低FoxO1活性水平。

圖2 各組大鼠肝組織細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中的FoxO1蛋白表達(dá)水平Figure 2 FoxO1 expression in cytoplasm and nucleus of liver tissues of rats in each group

3 討論

現(xiàn)代生活方式和飲食習(xí)慣使得糖尿病及肥胖人群不斷增多，臨床上糖尿病相關(guān)的肝損害也越來(lái)越常見(jiàn)[10]。糖尿病狀態(tài)下糖利用障礙，而脂肪動(dòng)員代償性增加，使得血漿游離脂肪酸增多，從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性作用。肝能通過(guò)促進(jìn)脂肪酸氧化和轉(zhuǎn)化為甘油三酯儲(chǔ)存在肝細(xì)胞內(nèi)，從而適應(yīng)糖尿病高脂質(zhì)環(huán)境，這一方面導(dǎo)致肝組織氧化應(yīng)激增強(qiáng)，另一方面致使肝細(xì)胞甘油三酯堆積而產(chǎn)生脂肪變性[11]。隨著糖尿病的進(jìn)展，肝功能逐漸受損，導(dǎo)致胰高血糖素等激素滅活減少、胰島素抵抗加重、白蛋白合成障礙等一系列病理變化，從而形成惡性循環(huán)，最終加速了糖尿病及肝病變的進(jìn)展[12]。

本研究采用高脂飲食與小劑量STZ腹腔注射誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型，實(shí)驗(yàn)中糖尿病大鼠出現(xiàn)典型的“三高一少”臨床癥狀，同時(shí)大鼠還表現(xiàn)為肝功能、線粒體功能與血脂異常，具體表現(xiàn)為ALT、AST、ATP、FFA及 TG水平均明顯增加。此外，糖尿病大鼠肝組織caspase-3表達(dá)水平增高，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)血漿和肝組織中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA濃度顯著上升，這提示肝凋亡亡及氧化應(yīng)激水平增加。NAC是目前較為常用的一種抗氧化劑，在我們前期研究中，其灌胃劑量在每日1.5 g/kg持續(xù)4周時(shí)可有效降低機(jī)體的氧化應(yīng)激水平[9]，并能減輕糖尿病心肌功能紊亂及缺血后再灌注損傷[13]。在本研究中，我們應(yīng)用NAC治療8周后，ALT、AST、FFA、TG、ATP及調(diào)亡水平均顯著降低。這表明抗氧劑NAC可部分抑制2型糖尿病大鼠肝組織氧化損傷、線粒體與肝功能減退及脂質(zhì)異常代謝。

目前關(guān)于糖尿病導(dǎo)致肝損害的具體機(jī)制尚未完全闡明，但大量臨床研究發(fā)現(xiàn)活性氧自由基(ROS)增多被認(rèn)為是NAFLD的始發(fā)因素和中心環(huán)節(jié)[5, 14]。SOD、CAT及GSH-Px是機(jī)體最為重要的內(nèi)源性抗氧化酶，其活性能反映機(jī)體的抗氧化能力。本研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠肝組織中SOD、CAT及GSH-Px活性均顯著降低， NAC干預(yù)明顯升高了這三種抗氧化酶的活性。這提示NAC具有增強(qiáng)2型糖尿病大鼠肝組織內(nèi)源性抗氧化能力的作用，這可能是其減輕糖尿病肝損害的有關(guān)機(jī)制。

FoxO家族是近年研究的一個(gè)熱點(diǎn)，其在調(diào)控細(xì)胞周期、氧化應(yīng)激、能量代謝等方面具有重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)四種FoxO家族成員：FoxO1、FoxO3、FoxO4及FoxO6。其中，F(xiàn)oxO1在調(diào)節(jié)代謝方面尤為重要，其活性受胰島素負(fù)性調(diào)節(jié)[6]。在糖尿病狀態(tài)下，胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足均會(huì)導(dǎo)致FoxO1活性增強(qiáng)，從而增加脂肪動(dòng)員，致使FFA濃度顯著增加，過(guò)量的FFA進(jìn)入肝并超過(guò)肝的氧化能力，造成大量TG在肝中蓄積形成脂肪肝。此外，過(guò)量的FFA也會(huì)抑制胰島素的釋放、干擾胰島素的功能[15]，這會(huì)加重糖尿病，因而形成惡性循環(huán)。這提示糖尿病相關(guān)肝損害的發(fā)生和發(fā)展與FoxO1活性顯著增加密切相關(guān)。由于高血糖與高血脂均可以引起機(jī)體氧化應(yīng)激的增強(qiáng)，因而在本實(shí)驗(yàn)中我們特別檢測(cè)了抗氧化劑NAC對(duì)肝FoxO1活性的影響。我們發(fā)現(xiàn)2型糖尿病肝組織FoxO1活性顯著增強(qiáng)，而抗氧化劑NAC可以顯著抑制其活性。這表明糖尿病肝FoxO1活性增強(qiáng)與氧化應(yīng)激有關(guān)，通過(guò)減輕糖尿病氧化應(yīng)激從而抑制FoxO1活化的措施或許是減輕糖尿病肝損害的重要途徑。

綜上所述，抗氧化劑NAC可以減輕實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病相關(guān)肝損害，其機(jī)制可能與其增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力、減少血脂代謝與線粒體功能異常并抑制FoxO1過(guò)度活化有關(guān)。本研究初步探討了抗氧化劑對(duì)2型糖尿病相關(guān)肝損害中氧化應(yīng)激及FoxO1的影響，以期為糖尿病相關(guān)肝損害臨床藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。