宰后牦牛肉成熟過程中活性氧對細胞凋亡酶活性及肌原纖維蛋白的影響

何方, 師希雄＊,岳建偉,余群力，王鵬燕,高振艷,陳顥予,岳瑤

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070

引言

牦牛是以青藏高原為中心，毗鄰高山、亞高山高寒地區(qū)的特有畜種，我國是世界上牦牛數(shù)量和品種最多的國家[1-2]。牦牛肉不僅蛋白質(zhì)與氨基酸含量高，脂肪含量低, 而且無農(nóng)藥殘留[3]，是一種天然的綠色食品，但與其他肉類相比，嫩度較差[4]。目前，國內(nèi)外研究表明，宰后成熟過程中肉的嫩化主要歸結(jié)于肌原纖維蛋白的降解[5-6]，所以肌原纖維蛋白與肉的嫩度緊密相關(guān)。ROS是需氧細胞在代謝過程中產(chǎn)生的一系列活性氧簇，包括超氧自由基(O2-)、過氧化氫(H2O2)和羥自由基(-OH)等[7]。線粒體電子傳遞鏈是活性氧產(chǎn)生的最主要來源[8]，活性氧一方面通過修飾蛋白質(zhì)骨架肽鏈及氨基酸的側(cè)鏈來改變蛋白的交聯(lián)或降解狀況，影響蛋白質(zhì)的溶解性、疏水性、持水力、凝膠特性等理化性質(zhì)，進一步?jīng)Q定著肉的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、色澤等消費品質(zhì)以及蛋白質(zhì)的組成、體外消化率等營養(yǎng)品質(zhì)。另一方面，ROS也可以間接介導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化，主要是通過介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化和加速非酶糖基化生成活性羰基化合類物質(zhì)，使蛋白質(zhì)糖基化和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的交聯(lián)，再利用其活性中間產(chǎn)物間接介導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化，使正常蛋白的活性增強或減弱[9]，因此，ROS可能影響宰后肉成熟過程中肌原纖維蛋白的降解。目前關(guān)于蛋白質(zhì)氧化在肉品加工領(lǐng)域頗具爭論，Sumder[10]認為活性氧在肉的成熟過程中會促進肌原纖維降解，增加肉的嫩度，張玉林[9]認為活性氧在肉的成熟過程中會抑制肌原纖維降解，不利于肉的嫩化。ROS對細胞凋亡酶還有一定作用，Caspase本身是以非活化的狀態(tài)存在，但是當(dāng)有ATP產(chǎn)生時會首先活化起始酶，通過級聯(lián)反應(yīng)激活效應(yīng)酶[11]，細胞凋亡酶系中Caspase-9和Caspase-3分別屬于起始酶和效應(yīng)酶，效應(yīng)酶Caspase-3作用于肌原纖維蛋白，使肌原纖維降解，達到嫩化的目的[12]?？傊琑OS對肌原纖維蛋白的影響報道不一致，而且關(guān)于牦牛肉的研究鮮有報道。因此，有必要深入研究牦牛肉宰后成熟過程中ROS細胞凋亡酶活性及肌原纖維蛋白的影響，為牦牛肉成熟工藝的改進提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

甘南牦牛，甘肅清河源清真食品股份有限公司，隨機選取5頭自然放牧，健康無病36月齡的牦牛，采用伊斯蘭教屠宰方式屠宰后，立即從半胴體上取背最長肌(Longissimus Dorsi，LD)

1.1.2 試劑

30%的過氧化氫（H2O2）、乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCl）、氯化鈉（NaCl）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、蔗糖、磷酸鈉（Na3PO4）、氯化鎂（MgCl2）、五水硫酸銅（CuSO4·5H2O）、氫氧化鈉（NaOH）、酒石酸鉀鈉、氯化鉀（KCl）、磷酸鉀（K3PO4）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化氫（HCl）、疊氮化鈉（NaN3）等均為國產(chǎn)分析純，活性氧熒光探針DCFH-DA（美國sigma公司）、caspase-3/-9檢測試劑盒（北京索萊寶公司）

1.1.3 儀器

XHF-D高速分散器（寧波新芝生物科技股份有限公司）、TGL-24MC高速冷凍離心機（湖南平凡科技有限公司）、SP-756P型紫外分光光度計（上海光譜儀器有限公司）、FTIR-650型傅里葉變換紅外光譜儀（天津港東科技發(fā)展股份有限公司）

1.2 樣品處理

將取下的背最長肌，快速取約100g肉樣放入液氮中作為0h樣品。其余肉樣迅速切成體積均勻的肉塊（約50 g/塊），隨機分成兩組，第一組不做任何處理，第二組樣品浸泡于10mmol H2O2溶液（肉樣：處理液=10∶1），兩組樣品分別置于0～4℃條件成熟0、6、12、24、72、120、168 h，將肉樣在設(shè)計時間點采集并用液氮迅速冷凍后置于-80℃凍藏，用于測定Caspase-3活性、Caspase-9活性、肌原纖維蛋白溶解性、MFI、可溶性蛋白含量的測定等指標(biāo)。

1.2.1 ROS相對含量的測定

ROS相對含量的測定參考Lee等[13]與張玉林等[9]的方法稍加改進：將2g不帶肌腱、脂肪的肉放入12mL的Tri-HCl緩沖液（10 mmol/L Tri-HCl，0.8%(m/V) NaCl，0.1mmol/L EDTA-2Na，10 mmol/L sucrose，pH 7.4）中剪碎，在冰浴中勻漿1min，3000g冷凍離心15min收集上清，采用雙縮脲法測定上清蛋白濃度，并取將上清液與反應(yīng)緩沖液（10mmol/L Tris-HCl，0.8%(m/V) NaCl，0.1 mmol/L EDTA-2Na，10mmol/L sucrose，10 μmol/L DCFH-DA，pH 7.4）按1∶1的比例混合，孵育（37℃，15min）后4℃，12000 g條件下離心8 min，并迅速用熒光分光光度分別計測定（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm）熒光值。

1.2.2 Caspase-3、9活性的測定

按照Caspase-3和Caspase-9活性試劑盒上的測定方法測定。

1.2.3 肌原纖維蛋白溶解性

肌原纖維蛋白的提?。杭≡w維蛋白的提取方法參考王宇[14]的方法并進行適當(dāng)?shù)母倪M。肌原纖維蛋白的提取在4℃下進行，取2g絞碎的肉樣品加入8ml緩沖液（10 mmol/L Na3PO4，0.1mol/LNaCl，2mmol/LMgCl2和1mmol/L EDTA，pH 7.0），勻漿60s后，在4℃下6000r/min離心15min，取沉淀重復(fù)上述步驟2次，得到粗提肌原纖維蛋白。取此沉淀加入4倍體積的0.1mol/L NaCl溶液，勻漿60s，6000r/min冷凍（4℃）離心15min，重復(fù)此操作1遍，取此沉淀加入4倍體積的0.1mol/L NaCl溶液，勻漿60s，4層紗布過濾，取濾液，用0.1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.0，6000r/min冷凍（4℃）離心15min，沉淀即為提純的肌原纖維蛋白，4℃冷藏備用。

溶解性的測定在kingsley等[15]的方法上做了一些調(diào)整，肌原纖維蛋白1g，溶于50mL濃度為0.75%的NaCl溶液中，用0.1mol/L的氫氧化鈉或0.1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0（偏離等電點5.5即可），再在60℃水浴鍋加熱30min，之后6000r/min冷凍（4℃）離心15min取上清液，采用雙縮脲法測定離心前后上清液中蛋白質(zhì)含量，按下式計算：

肌原纖維蛋白溶解性（%）=上清液蛋白質(zhì)含量/樣品中總蛋白質(zhì)含量× 100%

1.2.4 MFI

參照DelgadoE.F.等[16]的研究方法，取2g肉樣，用20mL的MFI緩沖液（100mmol/L的KCl、20mmol/L Na3PO4、1mmol/L EDTA、1mmol/L MgCl2、1mmol/L NaN3，pH 7.1），將肉樣機械冰浴勻漿后。所得懸濁液在1000g離心15min，棄去上清液，沉淀再用20mL的MFI緩沖液使之重新處于懸濁態(tài)，再于1000g離心15min，棄去上清液。沉淀用10mL的MFI緩沖液使之重新處于懸濁態(tài)，用200目尼龍篩網(wǎng)過濾該懸濁液，另用10 ml的MFI緩沖液幫助肌原纖維蛋白通過濾網(wǎng)，過濾所得的肌原纖維蛋白懸濁液用雙縮脲法測定其蛋白含量。

計算：用緩沖液調(diào)整懸浮液調(diào)節(jié)肌原纖維蛋白液的最終濃度為0.5mg/ml（MFI緩沖液加入6ml，根據(jù)測得蛋白含量計算所需蛋白體積），再用分光光度計測定（540nm處）吸光值，將所得結(jié)果（吸光值）乘以200后即為MFI值。

1.2.5 肌原纖維蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量

參考孫圳等[17]的方法，取背最長肌，剔除可見脂肪和結(jié)締組織，按樣品（g）與提取液（0.1mol/L NaCl，10mmol/L Na3PO4，2mmol/L MgCl2，2mmol/L EGTA，pH 7.0）1∶4（W/V）的比例加入，于組織搗碎機中充分斬拌混勻，得到均勻的肉糜混合液；形成的肉漿離心（2000g，15min，4℃），取其沉淀；在相同條件再洗滌、繼續(xù)離心兩次，用紗布過濾除去肌膜及脂肪組織等；隨后用4倍體積（V/W）的0.1mol/L NaCl溶液洗滌、離心兩次（2000g，15min，4℃），得到肌原纖維蛋白，將其冷凍干燥后存于抗氧化劑及其干燥劑中，用傅里葉變換紅外光譜儀測定二級結(jié)構(gòu)并利用PeakFit 4.12軟件擬合并計算各個二級結(jié)構(gòu)百分比。

2.結(jié)果與分析

2.1 H2O2對牦牛肉成熟過程中ROS生成量的影響4.2 測試方法

圖1 H2O2 對牦牛肉成熟過程中ROS生成量的影響（A、B代表在同一時間點兩組之間差異顯著）Figure 1 changes in relative content of ROS after natural maturity and H2O2 soaking during the postmortem ageing of yak(A, B represents a significant difference between the two groups at the same time point).

由圖1可知，牦牛肉成熟過程中，隨著成熟時間的延長，試驗組與對照組ROS相對含量均呈現(xiàn)先下降再上升再下降的趨勢，且對照組和試驗組均在5d時達到最高值，但0.5-8d試驗組ROS含量顯著高于對照組（P＜0.05）。H2O2作為自由基的一員，可以調(diào)節(jié)細胞代謝[9]，本研究中H2O2組ROS相對含量明顯高于對照組，這與張玉林等[9]研究結(jié)果類似。

2.2 ROS對牦牛肉成熟過程中 Caspase-3與Caspase-9活性的影響

圖2 ROS對牦牛肉成熟過程中 Caspase-3/9活性的影響（A、B代表在同一時間點兩組之間差異顯著）Figure 2 Effect of ROS on caspase-3/9activity during the postmortem ageing of yak(A, B represents a significant difference between the two groups at the same time point).

由圖2A可知，隨著成熟時間的延長，0.5-3d試驗組與對照組Caspase-3酶活性呈現(xiàn)先降低再升高再降低的趨勢，0.5d時Caspase-3酶活性最低，3d時最高，且0.5-1d試驗組高于對照組（P＜0.05）。由此可見，活性氧可提高Caspase-3的活性。由圖2B可知，隨著宰后成熟時間的延長，試驗組與對照組Caspase-9活性先降低后升高再降低，0.5-1d 試驗組Caspase-9活性顯著高于對照組（P＜0.05）。這可能是ROS導(dǎo)致Caspase-3/9活性增大，激活細胞凋亡酶級聯(lián)反應(yīng)。宋昱慶等[18]研究發(fā)現(xiàn)低濃度的活性氧能夠促進細胞凋亡的表達。本試驗與上述試驗結(jié)果都能夠說明細胞凋亡酶系受到ROS的調(diào)控作用，并且ROS增加了Caspase-3/9的活性。

2.3 ROS對牦牛肉成熟過程中MFI的影響

圖3 ROS對牦牛肉成熟過程中 MFI的影響（A、B代表在同一時間點兩組之間差異顯著）Figure 3 Effect of ROS on MFI of yak during the postmortem ageing of yak(A, B represents a significant difference between the two groups at the same time point).

MFI（肌原纖維蛋白小片化指數(shù)）表征肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞的情況，可以反映肉的嫩化程度，MFI越大，表明肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)受破壞的程度越大，肉的嫩度也越好。圖3中0-8d 試驗組與對照組的MFI均呈現(xiàn)呈上升的趨勢，但0.5-8d 試驗組MFI顯著高于對照組（P＜0.05），可能是用H2O2處理后，ROS加強了肌原纖維蛋白的氧化作用，肌原纖維上連接Z線與I 帶、A帶的蛋白降解，導(dǎo)致Z線弱化，肌原纖維降解為數(shù)個肌節(jié)組成的串聯(lián)體或片斷[19]，表現(xiàn)為MFI上升，最終導(dǎo)致肉被嫰化。

2.4 ROS對牦牛肉成熟過程中肌原纖維蛋白溶解性的影響

圖4 ROS對牦牛肉成熟過程中肌原纖維溶解性的影響（A、B代表在同一時間點兩組之間差異顯著）Figure 4 Effect of ROS on the solubility of myofibrillar protein of yak during the postmortem ageing of yak(A, B represents a significant difference between the two groups at the same time point).

肌原纖維蛋白是構(gòu)成肌原纖維的蛋白質(zhì)，也稱不溶性蛋白質(zhì)，占肌肉中總蛋白的40-60%，主要包括肌球蛋白，肌動蛋白，肌動球蛋白，原肌球蛋白和肌鈣蛋白等。由圖4可知隨著成熟時間延長，試驗組與對照組均呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢，且試驗組均高于對照組（P＜0.05）。這可能由于 ROS加速蛋白質(zhì)氧化的進程，使蛋白質(zhì)理化性質(zhì)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)溶解性增加。

2.5 ROS對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響

圖5 ROS對牦牛肉成熟過程中Caspase-3/9活性的影響（A、B代表在同一時間點兩組之間差異顯著）Figure 5 Effect of ROS on protein secondary structure of yak during the postmortem ageing of yak(A, B represents a significant difference between the two groups at the same time point).

二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈借助于氫鍵沿一維方向排列成具有周期性的結(jié)構(gòu)構(gòu)象，主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角與無規(guī)則卷曲。通過改變蛋白質(zhì)所處環(huán)境，其結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變從而導(dǎo)致功能的變化，其中凝膠性的改變包含了肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)與功能的變化[20]。由圖5可見試驗組β-折疊在3d、5d、8d時顯著高于對照組（P＜0.05），無規(guī)則卷曲在1-8d時顯著高于對照組（P＜0.05），α-螺旋在0-8d時逐漸降低。本實驗中二級結(jié)構(gòu)最明顯的變化是無規(guī)則卷曲的增加與β-轉(zhuǎn)角的減少，F(xiàn)ang等[21]研究中發(fā)現(xiàn)α-螺旋并不是直接轉(zhuǎn)化為β-折疊，中間需要α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)則卷曲的過程。張玉林等[9]也發(fā)現(xiàn)H2O2可促進蛋白氧化，從而促進止α-螺旋轉(zhuǎn)化為無規(guī)卷曲和β-折疊，這與本試驗結(jié)果一致。

3.結(jié)論

在牦牛肉宰后成熟過程中，H2O2促進ROS的產(chǎn)生，導(dǎo)致MFI升高、肌原纖維溶解性增加，Caspase-3和Caspase-9活性增強，說明ROS促進了細胞凋亡和肌原纖維蛋白的降解。同時，ROS 還影響脂肪族 C-H 基團的微環(huán)境，使肌原纖維蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、無規(guī)則卷曲升高，β-轉(zhuǎn)角降低以及β-折疊的變化從而改變肌原纖維蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)?？傊蜐舛鹊腍2O2促進ROS產(chǎn)生，進而增加細胞凋亡酶活性和促進肌原纖維蛋白的降解，使肉的嫩度增加。