嚙齒動(dòng)物痙攣模型常用的評(píng)定方法

吳曉燕，金榮疆

成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都市610075

痙攣常見于腦卒中、脊髓損傷、腦癱、多發(fā)性硬化等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，屬于上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元綜合征的組成部分之一[1]。脊髓損傷引起的痙攣通常表現(xiàn)為屈肌和伸肌緩慢增加興奮性和過度活動(dòng)；腦部病變通常會(huì)導(dǎo)致興奮的快速積聚，并且偏向于反重力肌肉的參與；慢性痙攣可導(dǎo)致相關(guān)和鄰近肌肉的流變性質(zhì)的變化[2]。臨床上最初將痙攣定義為由于牽張反射的過度興奮性引起的強(qiáng)直性肌腱反射的速度依賴性增加[3]。伴隨著研究的深入，研究者們逐漸認(rèn)識(shí)到肌肉張力增加，不僅是因?yàn)榉瓷浠顒?dòng)增加，而且還可能更多地是由于肌肉的內(nèi)在特性發(fā)生變化引起的[4]。

痙攣研究依賴于優(yōu)質(zhì)動(dòng)物模型，而優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物模型又依賴于能夠敏銳地檢測(cè)出模型動(dòng)物痙攣差異的測(cè)量方法。嚙齒動(dòng)物常常被用來制作痙攣動(dòng)物模型，定性和定量的痙攣評(píng)定方法經(jīng)常用于判斷痙攣的程度，還可以對(duì)痙攣治療的效果進(jìn)行比較。

1 行為學(xué)觀察

觀察大鼠行為學(xué)的改變便于對(duì)模型進(jìn)行初步的判斷，識(shí)別受痙攣影響的大鼠模型。不同類型的痙攣模型大鼠可能會(huì)有不同的行為學(xué)改變。如選擇性將5-羥色胺再攝取抑制劑直接微量注射到大鼠紅核后，產(chǎn)生斜頸肌痙攣，并且肌張力障礙的發(fā)作伴隨著面部肌痙攣，空虛咀嚼動(dòng)作和梳理動(dòng)作增多[5]。

遺傳性痙攣性截癱(hereditary spastic paraplegias,HSPs)大鼠表現(xiàn)出年齡依賴性的進(jìn)行性步態(tài)缺陷，其特征在于后肢運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性差，軀干不穩(wěn)定以及開始運(yùn)動(dòng)困難。最早的異常是通過后肢異常姿勢(shì)表現(xiàn)的，其特征是明顯的內(nèi)收，通常導(dǎo)致后肢交叉爪子在內(nèi)部旋轉(zhuǎn)，倒置并相互扣合，而正常野生型大鼠用爪外旋保持其后肢[6]。

脊柱S2水平橫斷僅影響尾部肌肉組織，并在2周后開始導(dǎo)致慢性尾部痙攣，且持續(xù)無限期[7]。當(dāng)尾巴無約束時(shí)，尾巴自發(fā)或反射性屈肌和伸肌痙攣盤繞，移動(dòng)期間經(jīng)常在尾巴末端引發(fā)陣攣。輕微接觸尾毛和皮膚時(shí)，尾巴迅速撤回。Bennett等[8]描述了S2橫斷后大鼠尾部肌肉組織痙攣的4個(gè)階段。脊髓撞擊損傷痙攣模型經(jīng)常表現(xiàn)出后肢伸肌痙攣并且容易誘發(fā)陣攣[9]。

大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠痙攣模型因其張力變化微弱不易被感知，常觀察到痙攣明顯大鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)啟動(dòng)困難，腕掌關(guān)節(jié)屈曲握拳狀，后肢伸展過度等行為改變。

2 定量評(píng)價(jià)

通常大尺寸的裝置難以應(yīng)用于嚙齒動(dòng)物模型。因此，需要開發(fā)各種微型評(píng)估裝置用于量化大鼠的肌張力。

2.1 H反射

上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷后，脊髓中樞失去上位中樞的控制，導(dǎo)致節(jié)段內(nèi)中間神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元活性的改變，以致相應(yīng)電生理活性改變。

H反射是常用的電生理檢查方法，用于了解脊髓節(jié)段內(nèi)α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、γ運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、閏紹細(xì)胞及其他中間神經(jīng)元的活性[10]。

H/M比：在痙攣大鼠中，隨著中樞神經(jīng)的喪失和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的活動(dòng)增加，H反射的振幅將增加；M波的振幅不會(huì)改變；結(jié)果Hmax∶Mmax比增加[11]。

另外常用指標(biāo)為H反射的頻率依賴性抑制(rate-dependent depression,RDD)：通過逐漸增加刺激頻率，正常大鼠肌肉H反射振幅被抑制，痙攣時(shí)，H反射在高頻率的刺激下，振幅下降不明顯，RDD減弱，表明脊髓反射興奮性增高[12]。

Escobar-Corona等[13]的研究表明，脊髓損傷大鼠的H反射振幅和H/M比與正常大鼠相比顯著增強(qiáng)，電針治療的脊髓損傷大鼠表現(xiàn)出H反射振幅和H/M比的減少，并且促進(jìn)H反射的頻率依賴性振幅抑制。

Cordero等[14]通過在大鼠中誘發(fā)H反射，研究飲食干預(yù)降低痙攣的功效，發(fā)現(xiàn)隨著刺激頻率的增加，脊髓損傷大鼠H反射抑制減少，服用維生素E補(bǔ)充飲食的大鼠H反射抑制改善。Lee等[12]在小鼠的嘴側(cè)和尾側(cè)前肢運(yùn)動(dòng)區(qū)誘導(dǎo)光致血栓形成來建立腦卒中痙攣性小鼠模型，與假手術(shù)小鼠相比，腦卒中小鼠受累肌肉中的RDD顯著減弱，并且持續(xù)8周。同樣，宗海洋等[15]也在光化學(xué)損傷單側(cè)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)致大鼠后肢痙攣性偏癱模型中驗(yàn)證了H反射RDD在痙攣側(cè)肢體中明顯降低。

2.2 超聲彈性成像(ultrasound elastography,UE)

UE是一種新興的技術(shù)，用于實(shí)時(shí)無創(chuàng)監(jiān)測(cè)彈性組織特性。在肌肉骨骼領(lǐng)域，超聲應(yīng)變彈性成像可以成功地檢測(cè)到肌肉硬度的變化。對(duì)于一些肌肉結(jié)構(gòu)已發(fā)生微小變化，但尚未引起顯著力學(xué)改變等情況，其阻抗改變不易被測(cè)試者感知，用分級(jí)量表區(qū)分肌張力變化十分困難[16]。UE是通過檢測(cè)外力或超聲波作用下組織應(yīng)變、應(yīng)變率或剪切波速度等參數(shù)來判斷組織硬度，對(duì)目標(biāo)進(jìn)行組織機(jī)械特性定量及可視化定性研究[17]。

UE在臨床中可應(yīng)用于腦卒中、脊髓損傷和腦癱所致的肌痙攣評(píng)定[18]。在嚙齒動(dòng)物模型中，Johannsen等[19]利用UE檢測(cè)大鼠藥理學(xué)刺激后局部骨骼肌的彈性反應(yīng)。Wijesinghe等[20]報(bào)道新鮮的離體大鼠腓腸肌和小鼠腹部橫斷肌肉和結(jié)締組織之間的黏彈性對(duì)比，這說明UE檢測(cè)大鼠骨骼肌彈性的可行性。Jiang[21]等應(yīng)用UE評(píng)估脊髓損傷痙攣大鼠腓腸肌的硬度，結(jié)果顯示隨脊髓損傷大鼠腓腸肌張力增加，其肌肉硬度也發(fā)生明顯增加，說明UE可用來評(píng)估脊髓損傷大鼠痙攣腓腸肌的硬度改變。該研究為UE用于評(píng)價(jià)動(dòng)物肌張力變化奠定基礎(chǔ)。

2.3 速度依賴性踝扭矩和肌電記錄

1996年Thompson等[22]評(píng)估正常大鼠踝伸肌伸展反射的速度依賴性踝扭矩和相關(guān)活動(dòng)。簡(jiǎn)而言之，將動(dòng)物置于限制器中，并將后爪粘貼到由計(jì)算機(jī)控制的步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)的金屬板上，并且總是與同側(cè)的肌電圖(electromyography,EMG)一起測(cè)量。在步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)的踝關(guān)節(jié)屈曲期間，使用中速、快速和慢速踝關(guān)節(jié)旋轉(zhuǎn)速度，測(cè)量踝關(guān)節(jié)對(duì)背屈的抵抗力。分別在清醒動(dòng)物和麻醉動(dòng)物中測(cè)量阻力，用清醒時(shí)的阻力減去麻醉時(shí)的阻力，可以計(jì)算出神經(jīng)源性的相對(duì)阻力。此外，可以檢測(cè)到肌肉阻力的痙攣成分，因?yàn)榀d攣狀態(tài)與速度有關(guān)。同時(shí)記錄EMG活性，將一對(duì)鎢電極間隔1 cm經(jīng)皮插入腓腸肌，為了檢測(cè)痙攣狀態(tài)，僅使用來自快速踝關(guān)節(jié)旋轉(zhuǎn)測(cè)量的EMG數(shù)據(jù)[23]。

有研究評(píng)估在大鼠中慢性鞘內(nèi)注射GABAB激動(dòng)劑巴氯芬(intrathecal baclofen pump implantation,ITB)及其停藥期間的反射興奮性和運(yùn)動(dòng)改變，結(jié)果觀察到在ITB治療4周期間，速度依賴性踝扭矩持續(xù)降低；在巴氯芬戒斷期間，速度依賴性踝扭矩增加[24]。Bose等[25]使用速度依賴性踝扭矩和肌電記錄儀器研究T8挫傷后踝關(guān)節(jié)伸展反射速度依賴性變化的性質(zhì)和時(shí)間過程，結(jié)果表明2個(gè)月時(shí)在使用這些途徑的肌肉伸展反射中有明顯的痙攣模式，踝關(guān)節(jié)扭矩和踝伸肌肌電圖振幅顯著增加。van Gorp等[26]利用人神經(jīng)干細(xì)胞移植(human fetal spinal cord-derived neural stem cells,HSSC)治療改善了急性腰脊髓損傷大鼠踝關(guān)節(jié)旋轉(zhuǎn)期間腓腸肌抵抗力和肌電圖活動(dòng)，證明人神經(jīng)干細(xì)胞移植可以改善痙攣。

2.4 步態(tài)分析

Tread Scan步態(tài)分析系統(tǒng)和CatWalk裝置已被用于評(píng)估各種中樞和周圍神經(jīng)損傷模型的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)步態(tài)參數(shù)(例如爪位置，支撐基部，步長(zhǎng)，前肢與后肢協(xié)調(diào))。其基本原理為：將一只動(dòng)物放在玻璃步道上行走，光線從動(dòng)物的爪子上反射出來，從步道下方可觀察到一系列明亮的足跡，通過攝像機(jī)記錄足跡并分析[27]。CatWalk系統(tǒng)允許實(shí)驗(yàn)者在動(dòng)物穿過走道時(shí)計(jì)算清晰的步態(tài)特征。Tread Scan步態(tài)分析系統(tǒng)的皮帶驅(qū)動(dòng)跑步機(jī)設(shè)備提供相同的手動(dòng)識(shí)別步進(jìn)周期和計(jì)算步態(tài)特征的能力，但具有速度控制的附加優(yōu)勢(shì)。

Beare等[28]研究顯示，脊髓損傷后4周以10 cm/s行走的中度脊髓挫傷小鼠，后肢擺動(dòng)時(shí)間變短，后肢軌道寬度相當(dāng)窄，后肢趾部擴(kuò)展減少，后肢步幅減少。類似的變化也在腦卒中大鼠模型中被觀察到。CatWalk結(jié)果顯示MCAO模型組大鼠的四肢壓強(qiáng)、足接觸面積和步行速度均比對(duì)照組大鼠減小、減慢[29]。雖然大多數(shù)研究是基于探討大鼠造模后運(yùn)動(dòng)功能變化，但不可否認(rèn)步態(tài)的變化與痙攣的發(fā)生有著密切的關(guān)聯(lián)。

van Gorp等[26]證明在肌痙攣緩解的同時(shí)，步態(tài)分析顯示，在SCI-HSSC動(dòng)物中，后肢放置有顯著改善，大鼠顯示出更好的首尾后爪定位。Harada等[30]在Catwalk系統(tǒng)收集的步態(tài)分析參數(shù)中，MCAO后印刷區(qū)域(前爪或后爪區(qū)域)和中間腳趾擴(kuò)展(指尖距離)顯著減少，被認(rèn)為可能與缺血應(yīng)激誘導(dǎo)的痙攣狀態(tài)有關(guān)。

與此相似的足跡分析，是將大鼠后肢涂上黑色墨水，讓大鼠沿著舷梯走在一張白紙上，然后分析留在紙上的足跡。已經(jīng)有研究通過測(cè)量每只大鼠第一和第五腳趾之間的距離和步幅長(zhǎng)度，并與同側(cè)后肢對(duì)比，把腦梗死對(duì)側(cè)后肢的足趾擴(kuò)散和/或步長(zhǎng)的顯著減少作為痙攣標(biāo)準(zhǔn)[31-32]。

3 特殊實(shí)驗(yàn)

2006年Smith等[33]開發(fā)一種評(píng)級(jí)系統(tǒng)，稱之為路易斯維爾游泳秤(Lovisville Swimming Scale,LSS)，評(píng)估游泳的三個(gè)特征，即后肢運(yùn)動(dòng)、前肢依賴性和身體姿勢(shì)。數(shù)據(jù)結(jié)果表明，LSS是一種靈敏可靠的方法，用于確定胸椎標(biāo)準(zhǔn)化挫傷后游泳能力和后肢功能的改善。

2017年Ryu等[34]檢查了游泳測(cè)試和EMG用于評(píng)估挫傷性脊髓損傷大鼠模型的痙攣狀態(tài)的可行性，在脊髓損傷造模后3～6周進(jìn)行游泳測(cè)試，結(jié)果表明，游泳測(cè)試可以準(zhǔn)確評(píng)估這種挫傷脊髓模型的痙攣狀態(tài)，是評(píng)估痙攣行為和開發(fā)針對(duì)脊髓損傷后痙攣狀態(tài)治療方法的有效方法。

4 小結(jié)

痙攣常常會(huì)導(dǎo)致疼痛、關(guān)節(jié)攣縮、共同運(yùn)動(dòng)、步行功能障礙、跌倒等不良事件發(fā)生，大大降低了許多類型中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的生活質(zhì)量[35]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立為研究痙攣的機(jī)制、發(fā)生的生理病理變化和治療手段的有效性提供了科學(xué)的理論基礎(chǔ)。動(dòng)物模型損傷中樞不同部位可模擬不同損傷機(jī)制導(dǎo)致的肢體痙攣，痙攣發(fā)生后及時(shí)發(fā)現(xiàn)并做出定量的評(píng)定是研究中要解決的關(guān)鍵問題。但是定量測(cè)量方法應(yīng)用還存在一些問題：①UE受檢測(cè)者操作手法的影響，還與模型鼠脂肪含量、肌肉內(nèi)是否有鈣化等異常病變有關(guān)；②步態(tài)分析在臨床中已經(jīng)廣泛用來分析痙攣，然而在動(dòng)物模型中大多用來評(píng)定運(yùn)動(dòng)功能的變化，與痙攣的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。