CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶研究進展

劉保光，栗俞程，汪保英，白 明，苗明三，許二平

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 科研實驗中心，河南 鄭州 450046；2.河南省仲景方藥現(xiàn)代研究重點實驗室，河南 鄭州 450046)

近年來，隨著獸用抗菌藥的廣泛應(yīng)用，細菌耐藥問題變得日趨嚴峻，已成為全球性難以解決的問題。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)能夠水解含β-內(nèi)酰胺環(huán)類的抗生素，可被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制，其自身大多由質(zhì)粒介導(dǎo)，同時是革蘭氏陰性菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥最主要的機制，具有廣泛的水解酶活性[1]。產(chǎn)ESBLs的臨床菌株，不僅對β-內(nèi)酰胺環(huán)類藥物耐藥，而且還對氨基糖苷類、氟喹諾酮類藥物、多西環(huán)素、氟苯尼考等耐藥[2]，表現(xiàn)出多重耐藥特性。

CTX-M型ESBLs是一類對頭孢噻肟具有強大水解能力的酶。前人研究發(fā)現(xiàn)，CTX-M型ESBLs耐藥基因可以通過質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等可移動元件，在質(zhì)粒與染色體間，或從一個質(zhì)粒到另一個質(zhì)粒，或從一種細菌到另一種細菌進行轉(zhuǎn)移，具有復(fù)雜的遺傳傳播背景[3-5]。為此，針對近些年有關(guān)CTX-M型ESBLs的研究進展進行了綜述，以期為CTX-M型ESBLs菌株感染的防控和遺傳背景的深入研究提供參考。

1 CTX-M型ESBLs的發(fā)現(xiàn)

BAUERNFEIND等[6]于1989年首次發(fā)現(xiàn)了耐頭孢噻肟的1株大腸桿菌分離菌株(命名為CTX-M-1)。隨后，阿根廷學(xué)者于1990年從1株耐頭孢噻肟的沙門氏菌中檢測到CTX-M-2型ESBLs[7]，CNIADKOWSKI等[8]在腸桿菌科細菌中發(fā)現(xiàn)了CTX-M-3型ESBLs。相繼檢出CTX-M型ESBLs感染菌株，使CTX-M型ESBLs菌株在眾多國家、地區(qū)的各種臨床菌株中得以流行，引起了人們對該型酶的很大關(guān)注，并迅速組成了一個穩(wěn)定增長的ESBLs成員[9-10]。

2 CTX-M型ESBLs的種類

目前，已發(fā)現(xiàn)的CTX-M型ESBLs已達上百余種(http://www.lahey.org/studies)，呈現(xiàn)出快速增長的趨勢。而CTX-M型ESBLs的攜帶菌，主要是變形桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等革蘭氏陰性細菌，臨床發(fā)現(xiàn)CTX-M型ESBLs對頭孢噻肟具有較強的水解活性。依據(jù)基因同源性的不同，將CTX-M型酶分組 ：①CTX-M-1系列，包含12種酶；②CTX-M-2系列，包含8種酶；③CTX-M-8系列，僅包括這1種酶；④CTX-M-9系列，共11種酶；⑤CTX-M-25系列，包括CTX-M-25和CTX-M-26這2種酶[11]。

3 CTX-M型ESBLs的生化特性與產(chǎn)耐藥性

CTX-M型ESBLs最主要的特征表現(xiàn)在大多數(shù)的CTX-M型ESBLs菌株對頭孢噻肟的水解能力遠高于對頭孢他啶的水解能力。頭孢他啶對產(chǎn)CTX-M型ESBLs菌株的最小中抑菌濃度(MIC)介于0.5～2.0 μg/mL，而頭孢噻肟的MIC介于8～256 μg/mL[12]?？梢?，針對產(chǎn)CTX-M型ESBLs菌株，頭孢噻肟的水解率較頭孢他啶高出很多。因此，通過檢測頭孢他啶水解活性的高低，可以初步判斷出大多數(shù)CTX-M型ESBLs與TEM、SHV型的不同，以此進行初步分型。

此外，CTX-M型ESBLs的菌株對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑是敏感的。在臨床試驗中，針對大多數(shù)產(chǎn)TEM、SHV型ESBLs菌株，舒巴坦的抑制活性沒有克拉維酸強。分析其原因，這主要在于Arg-244位點能較好地與克拉維酸結(jié)合，該位點是TEM和SHV型ESBLs的重要位點。CTX-M型ESBLs菌株的Arg-276位點與Arg-244位點的結(jié)構(gòu)有一定的差異[13]，這在一定程度上決定了β-內(nèi)酰胺酶抑制劑發(fā)揮作用的差異。

氨基酸Asn-104-Glu突變后，CTX-M-14型酶對頭孢噻肟的水解能力大大降低，而對第一、二代頭孢類藥物的水解能力影響不明顯[14]。此外，根據(jù)已上傳的蛋白質(zhì)序列發(fā)現(xiàn)，在CTX-M型ESBLs菌株中普遍存在Ser237位點，由此可見，Ser237位點在影響產(chǎn)CTX-M型ESBLs菌株的水解活性方面發(fā)揮了重要的作用。BOYD等[15]研究表明，CTX-M型ESBLs第167、240位的氨基酸位點，與頭孢他啶的水解活性能力有密切關(guān)系，這2個氨基酸位點能夠促進CTX-M型ESBLs與頭孢他啶的結(jié)合，使頭孢他啶的水解活性高于頭孢噻肟。

4 CTX-M型ESBLs的流行病學(xué)

大腸桿菌和肺炎克雷伯菌是產(chǎn)CTX-M型ESBLs菌株中最常見的細菌。自CTX-M-1型ESBLs首次報道以來，現(xiàn)今許多國家已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)CTX-M型ESBLs菌株。在產(chǎn)ESBLs的腸桿菌科細菌中，CTX-M-2和CTX-M-3型ESBLs菌株占了重要比例[16]。在不同的國家和地區(qū)，攜帶ESBLs菌株的分離率及基因亞型種類也有較大差異，CTX-M-15型在印度、尼日利亞多見[17]，而CTX-M-9和CTX-M-14型在西班牙多見，我國臺灣地區(qū)主要以CTX-M-3、CTX-M-14型為常見基因亞型[18-19]。

杜向黨等[20]發(fā)現(xiàn)，河南地區(qū)雞、豬源大腸桿菌CTX-M型ESBLs的產(chǎn)生率較高, 以CTX-M-2型和CTX-M-9型為主。近年來，我國的浙江、北京、廣州等地區(qū)的流行菌株主要以產(chǎn)CTX-M型ESBLs菌株為主，多數(shù)同時與產(chǎn)TEM型廣譜酶共存。在檢測的30株虎源大腸桿菌中，產(chǎn)ESBLs的菌株有21株，陽性率高達70%，而CTX-M型基因的檢出率為50%[21]。趙鳳菊等[22]研究發(fā)現(xiàn)，遼寧地區(qū)的產(chǎn)ESBLs豬源大腸桿菌的檢出率較高，TEM型和TEM+CTX-M型為主要流行的基因型。可見，各地產(chǎn)CTX-M型ESBLs的菌株存在一定差異。

5 CTX-M型ESBLs基因可在質(zhì)粒間、質(zhì)粒和染色體之間轉(zhuǎn)移

CTX-M型ESBLs編碼基因通常位于質(zhì)粒上，大多情況下與TEM-1共同存在于1個質(zhì)粒上。此外，TEM-2、SHV及OXA-1型的基因還可能存在這個質(zhì)粒上，質(zhì)粒的大小介于在7～160 kb，這提示了這些質(zhì)粒可攜帶多個或多類耐藥基因[23]。體外試驗發(fā)現(xiàn)，CTX-M型ESBLs的質(zhì)粒通?？赏ㄟ^接合傳遞的方式傳播，這可能是CTX-M型ESBLs菌株容易傳播流行的原因。從產(chǎn)CTX-M-17型菌株中提取的質(zhì)粒較小，在10 kb以下，不具有接合基因的功能，為非接合型質(zhì)粒[24]。然而，這種較小的非自我傳播的特殊質(zhì)粒，也可以進行傳播，它主要是通過轉(zhuǎn)化的形式來實現(xiàn)。在波蘭腸桿菌科的7種不同細菌中均發(fā)現(xiàn)了具有相同耐藥性的CTX-M-3型的質(zhì)粒[25]。

PALUCHA等[26]從臨床分離的大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)存在第二染色體插入的CTX-M型基因。在波蘭華沙檢測出2種性質(zhì)截然不同的質(zhì)粒上都攜帶CTX-M-3型基因[27]。我國在大腸桿菌和陰溝腸桿菌的質(zhì)粒和染色體上同時檢出CTX-M型ESBLs基因[28]?？梢?，CTX-M型基因能夠移動，且移動能力很強，可使CTX-M型基因能夠在質(zhì)粒與質(zhì)粒間及質(zhì)粒和染色體間進行互相傳遞，從而達到快速散播的目的。

6 CTX-M型ESBLs的轉(zhuǎn)位因子及基因轉(zhuǎn)移的遺傳環(huán)境

臨床中攜帶的絕大部分CTX-M型ESBLs基因，主要是由可接合的能夠轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒所攜帶的，與之相關(guān)的轉(zhuǎn)位因子，如插入序列ISEcp1、IS903、轉(zhuǎn)座子及整合子等，目前還不明確。一些攜帶有ESBLs基因亞型(如CTX-M-2、CTX-M-3、CTX-M-9、CTX-M-15型等)的基因能夠定位在轉(zhuǎn)座子、整合子等可轉(zhuǎn)移的元件上[29]。此外，位于CTX-M型基因上游的ISEcp1移動元件對耐藥基因的傳播發(fā)揮了重要的作用[30]。

6.1 ISEcp1、IS903插入序列

SINGH等[31]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)CTX-M型ESBLs基因的轉(zhuǎn)移和表達與插入序列的性質(zhì)有密切的關(guān)系。ECKERT等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、沙門氏菌等多種細菌中發(fā)現(xiàn)了ISEcp1插入序列，屬于IS1380成員。CASELLA等[33]發(fā)現(xiàn)，插入序列ISEcp1在CTX-M型ESBLs基因的上游較為常見，CTX-M-14型基因的上游都存在ISEcp1，而其他CTX-M型的基因上游也大多存在ISEcp1。FERNANDEZ等[34]研究發(fā)現(xiàn)，ISEcp1序列常常位于CTX-M基因的上游，在特定情況下，可以提供CTX-M表達所需要的啟動子。LARTIGUE等[35]研究發(fā)現(xiàn)，插入序列ISEcp1可以重復(fù)出現(xiàn)在攜帶CTX-M-l、2、3、9、13、14、15、17、19、21型基因上游的42～266 bp位置。其后發(fā)現(xiàn)CTX-M-14型和CTX-M-1型5的上游存在ISEcp1，同時發(fā)現(xiàn)在CTX-M-15型基因的下游也存在ISEcp1序列，這就闡釋了CTX-M型基因的移動是一個較為復(fù)雜的過程[36]。

此外，DIESTRA等[37]發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)CTX-M-14型基因的上游和下游分別存在插入序列ISEcp1和IS903，這與HU等[38]報道的CTX-M-14型基因的上下游分別出現(xiàn)插入序列ISEcp1、IS903相吻合。LARTIGUE等[39]發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)CTX-M-14型基因的上游和下游也分別出現(xiàn)插入序列ISEcp1和IS903?？梢?，2個序列在CTX-M-14型基因的傳播中具有重要的作用，能夠使之進行大量傳播，這揭示了CTX-M型ESBLs基因在腸桿菌科細菌中能夠廣泛傳播。

ISEcp1插入序列，又稱為轉(zhuǎn)座單元，它是CTX-M型基因的重要傳播載體。JIANG等[40]研究發(fā)現(xiàn)，常見的轉(zhuǎn)座單元ISEcp1-CTX-M-IS903-iroN，IS903和iroN在CTX-M型基因的下游。LIU等[41]研究發(fā)現(xiàn)，ISEcp1轉(zhuǎn)座單元中CTX-M型基因的表達水平與ISEcp1中的啟動子(P1)有密切的關(guān)系。WANG等[42]研究發(fā)現(xiàn)，只有79、80、127 bp間距的單元具有P2活性。把二者進行對比，P1活性較強，它在促進下游基因的表達中占主導(dǎo)地位[43]。

6.2 整合子

整合子廣泛存在于革蘭氏陰性菌中。大多Ⅰ、Ⅱ類整合子與耐藥有關(guān)[44]。SABATE等[45]研究發(fā)現(xiàn)，在Ⅰ類整合子(如InS21，In35和In60)中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)CTX-M-9和CTX-M-2型的基因。這些整合子，結(jié)構(gòu)上包含有5′CS和部分或全部3′CS的副本。而對于整合子InS21，產(chǎn)CTX-M-2型的基因位于ORF513的下游，且在3′端保守序列內(nèi)，它是一種非尋常整合子[46]。而對于In60，產(chǎn)CTX-M-9型的基因也位于ORF513的下游，也屬非尋常整合子。

6.3 轉(zhuǎn)座子

轉(zhuǎn)座子是一個能夠復(fù)制、移動的單元，存在于染色體DNA上，包含簡單式和復(fù)合式。一般來說，簡單轉(zhuǎn)座子就是插入序列；而復(fù)合式轉(zhuǎn)座予是一類帶有某些特殊功能基因(如腸毒素基因、耐藥基因、結(jié)構(gòu)基因等)的轉(zhuǎn)座子。在臨床試驗中，大部分CTX-M型基因是由轉(zhuǎn)座子來調(diào)控的，這就加劇了細菌耐藥性的傳播[47]。耐藥質(zhì)粒是導(dǎo)致細菌產(chǎn)生耐藥性的一個至關(guān)重要的因素，而質(zhì)粒上的耐藥基因，可通過耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、接合等方式進行水平傳播，在一定程度上加劇了細菌耐藥性。馬帥等[48]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)ESBLs菌株的同一質(zhì)粒可以攜帶多種耐藥基因，這些質(zhì)粒可介導(dǎo)菌株的多重耐藥特性，分離株的耐藥性與耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

7 CTX-M型ESBLs的基因突變

7.1 CTX-M型ESBLs的殘基

細菌攜帶的CTX-M型ESBLs基因在發(fā)生不斷的突變，就是為了適應(yīng)更多更新的抗菌藥物。一些常見的殘基如下。

殘基77：第77位殘基發(fā)生了A77→V的變化，雖然位于活性中心的遠端，也能夠?qū)Ξa(chǎn)CTX-M型β-內(nèi)酰胺酶起到一定的催化作用，具有一定的溫度耐受性。如CTX-M-55型在CTX-M-15基礎(chǔ)上發(fā)生了A77→V突變，結(jié)果就表現(xiàn)出了對溫度變化有一定的耐受性[49]。

殘基109：經(jīng)T109→A突變導(dǎo)致的，細菌攜帶的CTX-M-14型基因在109位的氨基酸是丙氨酸(Ala)，而CTX-M-140型是由CTX-M-14型突變而來，研究發(fā)現(xiàn)，109位的丙氨酸(Ala)對含CTX-M-14型基因水解頭孢菌素起到了非常重要的作用[50]。

殘基169：第169位殘基位于A類β-內(nèi)酰胺酶上，與酶對羧基、氨基、青霉素、頭孢他啶的作用有很大的關(guān)系。

殘基237和276：研究人員用點突變技術(shù)發(fā)現(xiàn)，突變后細菌對頭孢噻肟的水解作用減弱。因此，推測Ser237和Arg276殘基對頭孢噻肟的水解作用具有特殊的增強作用[51]。

殘基240：第240堿基主要是發(fā)生了D240→G突變。

7.2 產(chǎn)CTX-M型ESBLs的嵌合突變體

最近幾年來，因相互發(fā)生嵌合作用出現(xiàn)了一些新的突變體，如CTX-M-14型和CTX-M-15型的嵌合體CTX-M-64型、CTX-M-123型、CTX-M-132型和CTX-M-137型是在CTX-M-14型和CTX-M-15型的基礎(chǔ)上發(fā)生突變的。而在CTX-M-123型基礎(chǔ)上，通過若干個堿基突變或替換，這就衍變成了CTX-M-64型β-內(nèi)酰胺酶，但它對頭孢類藥物的作用強于CTX-M-123型。與CTX-M-14型相比，而CTX-M-64型對頭孢類藥物的水解能力較強，同時也對酶抑制劑如克拉維酸、舒巴坦卻表現(xiàn)出了一定的增加作用[52]。此外，CTX-M-14型和CTX-M-15型的嵌合體還有CTX-M-137型[53]。

8 CTX-M型ESBLs菌株的流行原因及治療措施

CTX-M型ESBLs的流行傳播機制，主要包含水平傳播和垂直傳播兩種形式。而水平傳播主要是針對耐藥基因來說的，通常是耐藥基因在質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、噬菌體、整合子等相關(guān)可移動元件的協(xié)助下來完成的，這也是引起臨床耐藥菌暴發(fā)和流行的主要原因，使得ESBLs的菌株能夠通過一定的形式轉(zhuǎn)移或傳遞給敏感的非產(chǎn)ESBLs型的菌株，這給臨床的防控帶來了一定的難度。

8.1 CTX-M型ESBLs菌株的流行原因

產(chǎn)ESBLs臨床菌株，其所在的質(zhì)粒不僅攜帶β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥基因，而且還同時存在其他耐藥基因如氟喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類藥物的耐藥基因，在這種情形下，就不可避免地出現(xiàn)了多重耐藥，鑒于此，在臨床中應(yīng)及時地去檢測產(chǎn)ESBLs菌株，協(xié)同相關(guān)藥物的耐藥表型，去判斷是否為多重耐藥菌株，這對于指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。再者，CTX-M型基因的本身理論特性在一定程度上也加劇了CTX-M型ESBLs菌株的廣泛流行，其原因主要體現(xiàn)在以下兩個方面：第一，這主要是在于CTX-M型耐藥基因大多存在于可接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒上，為流行傳播提供了前提條件；第二，該移動質(zhì)粒上攜帶的不同遺傳元件(如插入序列、轉(zhuǎn)座子和整合子等)在參與CTX-M型基因傳播與表達中也起到了一定的不容忽視的作用。因此，在多種因素共同作用下，導(dǎo)致了菌株的耐藥性傳播越來越嚴重，目前，已達到一發(fā)不可收拾的地步，全世界耐藥性問題變得日趨嚴峻。

另外，長期加量、濫用藥物尤其是β-內(nèi)酰胺類藥物在一定程度上對動物機體產(chǎn)生了很大的危害，不僅會導(dǎo)致機體內(nèi)的腸道菌群失調(diào)、紊亂甚至產(chǎn)生多重耐藥性，而且還嚴重影響公共衛(wèi)生的安全。臨床中長期加量、濫用藥物，而機體內(nèi)代謝、吸收是有一定限度的，甚至有些藥物不可能被完全吸收，導(dǎo)致其在體內(nèi)蓄積，日積月累，蓄積的藥物量增加。同時，因長期、大劑量使用藥物，機體內(nèi)不可避免地會出現(xiàn)耐藥基因，這在一定程度上降低了藥物的臨床療效，此外，還伴有一定的毒副作用。由于惡性循環(huán)的作用，機體內(nèi)存在的耐藥基因通過多種途徑，可擴散、傳播到環(huán)境(水、土壤、食品中等)中，進一步將耐藥范圍擴大，形成惡性循環(huán)式的全球性耐藥問題。

8.2 CTX-M型ESBLs菌株的治療措施

我國動物源CTX-M型ESBLs的菌株的分離率呈現(xiàn)增長趨勢。在臨床實踐中，通過開展藥物敏感性試驗，選用較為敏感的藥物去治療相關(guān)動物疾病的感染。目前，碳青霉烯類抗生素如亞胺培南、美羅培南，本身具有特殊的空間結(jié)構(gòu)特征，不容易被β-內(nèi)酰胺酶降解，可治療產(chǎn)ESBLs菌株的感染。目前，在臨床實踐中，抗菌活性最強、應(yīng)用最為廣泛的是美羅培南、亞胺培南。目前，針對產(chǎn)ESBLs菌株的感染，根據(jù)臨床實踐經(jīng)歷，選用β-內(nèi)酰胺類和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑聯(lián)用、頭孢菌素類及碳青霉烯類抗生素去治療較為合適。在其他類抗生素方面，氨基糖苷類和氟喹諾酮類抗生素可用來治療產(chǎn)CTX-M型ESBLs菌株的感染，具有一定的敏感性，但由于氟喹諾酮類抗生素對軟骨發(fā)育有影響及氨基糖苷類抗生素的耳、腎毒性作用，在臨床實踐應(yīng)用中受到一定的限制。

為有效控制細菌產(chǎn)生ESBLs和治療產(chǎn)酶菌株的感染，第一，應(yīng)當(dāng)減少臨床中抗生素的使用頻次及注意合理科學(xué)用藥，在一定程度上減少攜帶產(chǎn)CTX-M型的菌株[54]；第二，目前已有β-內(nèi)酰胺酶抑制劑(如棒酸、他唑巴坦、舒巴坦等)應(yīng)用于臨床，可考慮聯(lián)合應(yīng)用β-內(nèi)酰胺酶抑制劑；第三，加大研發(fā)力度，研制更多的中藥、新藥應(yīng)用于臨床[55]；第四，政府及監(jiān)管部門應(yīng)加強對感染菌、敏感程度的監(jiān)測力度，在一定程度上降低或減少耐藥菌株的出現(xiàn)。目前，隨著CTX-M型ESBLs多重耐藥菌株的出現(xiàn)，積極尋找新型、更加有效降低細菌耐藥性的方案顯得十分有必要。

9 小結(jié)

近年來，臨床中攜帶CTX-M型β-內(nèi)酰胺酶基因菌株顯示出愈發(fā)流行的趨勢。當(dāng)前，伴隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，新型檢測技術(shù)層出不窮，如脈沖場凝膠電泳、MLST、RAPD等新型分型技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因檢測與基因分子分型中[56]。了解不同地區(qū)產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的流行趨勢，有效掌握CTX-M型β-內(nèi)酰胺酶的亞型及分類特點，然后適當(dāng)選用不同的抗菌藥物進行治療是很有必要的，對臨床指導(dǎo)合理用藥具有重要現(xiàn)實意義。

總之，隨著對CTX-M型ESBLs的不斷認識，且耐藥性是一個世界性熱點問題，在臨床實踐中，應(yīng)重視ESBLs菌株的臨床檢測和加強該酶型的監(jiān)測力度。不同類型ESBLs基因的獲得和傳播，在一定程度上，與相關(guān)的整合子、轉(zhuǎn)座子和接合性質(zhì)粒等可移動遺傳元件有著很大的關(guān)聯(lián)，而這些元件可以在不同菌株間進行快速的傳播和轉(zhuǎn)移，這就導(dǎo)致了攜帶的ESBLs基因檢出率高。一些可移動的遺傳元件可以快速有效地傳遞ESBLs基因，而且各種可移動遺傳元件之間可能也會發(fā)生相互作用、相互影響，這些都會使對可移動遺傳元件的研究變得更為復(fù)雜。鑒于此，可移動遺傳元件對ESBLs基因、其他基因傳播的影響及其傳播擴散機制還需要進行深入細致研究。