產(chǎn)腸毒素大腸桿菌致使仔豬腹瀉致病機(jī)理的研究進(jìn)展

任敏敏1，徐 娥1，申露露1，王 珍3，項(xiàng) 云4，肖英平2

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所；3.綠城農(nóng)科檢測(cè)技術(shù)有限公司； 4.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧所)

1 仔豬腹瀉概述

仔豬因腸道內(nèi)尚未建立穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)，自身抵抗力較低，對(duì)外界刺激敏感，易受各種病原微生物的侵襲和各種應(yīng)激因素的影響。引起仔豬腹瀉的傳染性因素主要是指?jìng)魅拘圆≡胁《拘院图?xì)菌性。而細(xì)菌性腹瀉主要是由大腸桿菌引起，可引起仔豬黃痢(又稱(chēng)早發(fā)性大腸桿菌病)、白痢(又稱(chēng)遲發(fā)性大腸桿菌病)[2]。仔豬黃痢是初生仔豬的急性、致死性傳染病，主要發(fā)生于1周齡內(nèi)仔豬，以1-3日齡最為常見(jiàn)，發(fā)病率(90%)和死亡率(50%)均很高。臨診癥狀以排黃色或黃白色水樣糞便和迅速死亡為特征，病仔豬精神萎頓，糞便呈黃色漿狀、腥臭，嚴(yán)重者肛門(mén)松弛，排糞失禁，沾污尾、會(huì)陰和后腿部，肛門(mén)和陰門(mén)呈紅色。迅速衰弱，脫水、消瘦、昏迷至死亡。仔豬白痢主要發(fā)生于10-30日齡仔豬。發(fā)病率高，死亡率低，多發(fā)于寒冬、炎熱季節(jié)，氣候突變、陰雨潮濕、母豬飼料質(zhì)量較差、母乳中含脂率過(guò)高等常常是本病的重要誘發(fā)因素。臨床上以排灰白色漿狀、糊狀腥臭味稀糞為特征。仔豬大腸桿菌病是集約化豬場(chǎng)最常見(jiàn)的疾病之一，能夠引起人或動(dòng)物體產(chǎn)生腹瀉的最常見(jiàn)的幾種病原型大腸桿菌根據(jù)不同的生物學(xué)特性可以分為6種類(lèi)型：彌散粘附性大腸桿菌(disperion adhesion Escherichia coli，DAEC)、腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)、腸侵襲性大腸桿菌(enteroinvasive Escherichia coli，EIEC)、腸聚集性大腸桿菌(enteroaggregative Escherichia coli，EAEC)、腸致病性大腸桿菌(enteropathic Escherichia coli，EPEC)和產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)[3]。在這些病原型大腸桿菌中，ETEC為最主要的致病菌，是一種重要的能夠在全球范圍內(nèi)引起疾病的病原，它能夠引起新生仔豬的嚴(yán)重腹瀉，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，且損失日益嚴(yán)重[4]。

2 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌

研究表明ETEC的主要毒力因子是黏附素(被稱(chēng)為菌毛的毛發(fā)狀結(jié)構(gòu))、腸毒素(蛋白質(zhì)或肽類(lèi)物質(zhì))、水腫病毒素、內(nèi)毒素、溶血素和EatA[5]。ETEC的毒力特性強(qiáng)烈依賴(lài)于黏附素(菌毛)和腸毒素的產(chǎn)生[6,7]，ETEC最常見(jiàn)的表面黏附抗原是菌毛(fimbriae)，1990年，人們將其進(jìn)行分類(lèi)[8]，大致分為F1(TyI或普通菌毛)、F2和F3(分別是人類(lèi)ETEC的CFAI和CFAII)，動(dòng)物ETEC的菌毛為F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)、F17(Fy/Att25)、F41和F18。在動(dòng)物ETEC細(xì)菌中，F(xiàn)4(K88)菌毛至少有三種抗原類(lèi)型：ab、ac和ad[9]。F18菌毛是一種受質(zhì)粒調(diào)控的菌毛，斷奶仔豬的水腫和腹瀉疾病分別與它的兩種抗原型ab和ac有密切的關(guān)系[10-12]。

2.1黏附素 黏附素是存在于細(xì)菌表面的某種特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或糖脂成分，存在于細(xì)菌的細(xì)胞壁、外膜蛋白、鞭毛、菌毛等結(jié)構(gòu)中，能夠使細(xì)菌黏附到宿主靶細(xì)胞上，對(duì)細(xì)菌的定植起著重要的作用。黏附素又分為菌毛和非菌毛黏附物質(zhì)，大腸桿菌的17種黏附素主要存在于腸致病性大腸桿菌、產(chǎn)Vero毒素大腸桿菌(verocytotoxin-producing Escherichia coli，VTEC)和腸出血性大腸桿菌(EHEC)中，少數(shù)存在于腸聚集性大腸桿菌(EAEC)和腸產(chǎn)毒素性大腸桿菌(ETEC)中，主要的寄主是人、牛、豬、兔等[13]。

2.1.1F4(K88)菌毛 F4ac是F4(K88)菌毛的三種病原型F4ab、F4ac和F4ad中最常見(jiàn)的一種類(lèi)型[7]，且目前在世界范圍內(nèi)均是如此。其中“a”抗原區(qū)域相對(duì)保守，但是另一個(gè)抗原區(qū)域是可變的，因此研究者們將其分別定義為“b”、“c”和“d”。F4ab曾經(jīng)是最常見(jiàn)的一種抗原類(lèi)型，F(xiàn)4ad曾于1973年在歐洲出現(xiàn)過(guò)[14]。Choi和Chae等人檢測(cè)了腹瀉豬體內(nèi)44株F4呈陽(yáng)性的E．coli菌株后發(fā)現(xiàn)，有96%的E.coli載有F4ac菌毛基因，僅4%的E.coli載有F4ab菌毛基因[15]。研究者們用PCR的方法研究了從腹瀉的斷奶仔豬體內(nèi)分離到的237株ETEC，發(fā)現(xiàn)0.8%屬于F4ab，1.3%屬于F4ad，而98%屬于F4ac[16]。所有F4菌毛均能夠?qū)⒅嗵呛湍c上皮細(xì)胞的糖綴合物相結(jié)合，并且還能夠和腸道黏液及紅細(xì)胞結(jié)合[17,18]。這三種菌毛的差別表現(xiàn)在抗原類(lèi)型以及和腸上皮細(xì)胞結(jié)合特異性上。這是由于某些豬對(duì)這三種抗原類(lèi)型均易感；有些對(duì)兩種抗原易感(ab和ac，或ab和ad)；有些僅對(duì)一種抗原易感(ad或ab)；有些則對(duì)三種抗原均具有抗性[19]。

2.1.2F18菌毛 相較于F4(K88)、F5(K99)和F6(987P)，F(xiàn)18菌毛是一種發(fā)現(xiàn)較晚的菌毛，是一種1-2 μm長(zhǎng)的柔軟細(xì)絲狀，像頭發(fā)一樣覆蓋在菌體表面。F18菌毛具有特征性的鋸齒形，并出現(xiàn)在F18ab和F18ac兩種抗原中，其中F18ac在體外更容易表達(dá)[16]。F18 ETEC菌株通常能夠產(chǎn)生耐熱腸毒素(heat-stable enterotoxins)，而較少產(chǎn)生不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin，LT)[20]。

2.2腸毒素 大腸桿菌的致病性，并不是由于細(xì)菌本身對(duì)細(xì)胞的致病性引起的，而是由于細(xì)菌在體內(nèi)大量繁殖產(chǎn)生大量的毒素[21]。如腸毒素，主要包括不耐熱腸毒LT(heat-labile enterotoxin)以及耐熱腸毒ST(heat-stable enterotoxin)兩種，其中耐熱腸毒又可分為耐熱腸毒STa(heat-stable enterotoxin a)和耐熱腸毒STb(heat-stable enterotoxin b)。

LT是一種88 kDa的蛋白質(zhì)，它由一個(gè)A亞單位和五個(gè)B亞單位組成，5個(gè)完全相同的B亞單位形成環(huán)狀五聚體，A亞單位位于中央[22]。LT對(duì)熱敏感，60℃加熱30 min即被破壞。不能透析，也不易分離，有抗原性。LT根據(jù)其抗原性可分LT-I和LT-Ⅱ，LT-Ⅱ不具備腸毒素活性，并且不會(huì)引起動(dòng)物的疾病，LT-I和LT-Ⅱ的主要差別在于它們的B亞單位不同[23-24]。LT分子是由一個(gè)約28 ku的酶活性A亞基(LTA)和5個(gè)約11.5 ku的B亞基(LTB)組成，LTA和LTB具有不同的功能。LTA是毒素的毒力活性中心，它能催化細(xì)胞中與調(diào)控腺苷酸環(huán)化酶有關(guān)的一種膜蛋白腺苷二磷酸核糖基化，激活靶細(xì)胞cAMP，使cAMP 含量升高；LTB是毒素的免疫原性中心，可與靶細(xì)胞上的特異性受體GM1結(jié)合，介導(dǎo)LTA的進(jìn)入，以產(chǎn)生毒素活性[25]。目前對(duì)LT的功能進(jìn)行研究的有很多，如Horstman等人研究結(jié)果提示，由于LT在細(xì)菌表面和脂多糖(LPS)相結(jié)合，因此LT可能作為一種黏附素將細(xì)菌和腸上皮細(xì)胞表面的GM1神經(jīng)節(jié)苷脂相結(jié)合[26]。此外Berberov等人的研究發(fā)現(xiàn)，將編碼LT蛋白的基因敲除后，不但能使動(dòng)物腹瀉的程度減輕，而且減少了細(xì)菌向無(wú)菌豬腸道的定植[27]。這些發(fā)現(xiàn)則提示LT可能起著黏附素的作用。

耐熱腸毒素STa，是一種小分子量蛋白(約2 KDa)，由18或19個(gè)氨基酸構(gòu)成，具有3個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵；STa可溶于水和甲醇，在100 ℃加熱30 min或121 ℃加熱15 min仍可保持生物活性；耐多種有機(jī)溶劑和表面活性劑：抗各種蛋白酶水解，為肽類(lèi)毒素中最特殊者[28]。

耐熱腸毒素STb，是一種由48個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量約為5 kDa；成熟的STb具有四個(gè)半胱氨酸殘基，可形成兩個(gè)分子內(nèi)二硫鍵；STb對(duì)熱穩(wěn)定，100 ℃加熱30 min仍可保持生物活性；與STa不同，STb對(duì)蛋白酶等比較敏感，經(jīng)胰蛋白酶或β-巰基乙醇處理后便會(huì)失去生物活性[29]。

3 ETEC的致病機(jī)理

3.1粘附素的定植過(guò)程 菌毛粘附素有助于ET EC附著在小腸黏膜上皮細(xì)胞及結(jié)膜層上。 ETEC通過(guò)消化道進(jìn)入動(dòng)物腸道后，不斷繁殖，當(dāng)細(xì)菌在小腸中達(dá)到一定的數(shù)量后，能夠和小腸上皮的受體結(jié)合并黏附在上皮細(xì)胞上，或者利用特殊的菌毛黏附素，而黏附并覆蓋于上皮細(xì)胞的黏液上。ETEC由纖毛抗原介導(dǎo)的粘附作用，使其能牢固地粘附在小腸粘膜上，避免被分泌的粘液、小腸蠕動(dòng)、小腸絨毛的運(yùn)動(dòng)等所清除。

大腸桿菌對(duì)腸道細(xì)胞的粘著分兩步：(1)粘著和定植：首先，菌毛粘附素結(jié)合在豬小腸上皮細(xì)胞刷狀緣的受體上。大腸桿菌的菌毛頂部和周?chē)紳M了受體結(jié)合位點(diǎn)。受體的碳水化合物部分決定菌毛粘附素的特異性。在菌毛粘附素較為松散地結(jié)合于受體上以后，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引發(fā)宿主細(xì)胞的蛋白磷酸化，同時(shí)細(xì)胞間 Ca2+升高，并發(fā)生肌醇三磷酸化，使細(xì)菌與受體以一種高特異性的方式相互結(jié)合，隨后定植在腸道內(nèi)繁殖。而無(wú)菌毛的菌體僅形成一種松散而短暫的結(jié)合，不產(chǎn)生毒素。ETEC定植的程度決定了動(dòng)物的腹瀉是否是由細(xì)菌感染引起的。能夠產(chǎn)生F5、F6和F18型菌毛的ETEC大多定植在空腸和回腸的末端，F(xiàn)4+ETEC通?？梢远ㄖ苍谡慰漳c和回腸。F4菌毛可介導(dǎo)ETEC向各個(gè)年齡段的大部分豬的小腸內(nèi)定植。因此，F(xiàn)4+ETEC向腸黏膜的定植可以發(fā)生在新生和斷奶仔豬體內(nèi)，并且還可能發(fā)生在育肥豬體內(nèi)。并且由F4菌毛介導(dǎo)的黏附是ETEC種特異性的，大多發(fā)生在豬體內(nèi)[28]。(2)促進(jìn)細(xì)菌繁殖和毒素的產(chǎn)生：大腸桿菌一旦粘附在粘膜細(xì)胞，就開(kāi)始大量繁殖。細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中，產(chǎn)生大量的毒素不斷釋放到腸道內(nèi)。

3.2腸毒素導(dǎo)致腹瀉的機(jī)理 ETEC的兩種腸毒素進(jìn)人腸道后，首先與腸壁上皮細(xì)胞受體GM1結(jié)合。LT與神經(jīng)節(jié)苷酯GM1結(jié)合后激活腸上皮細(xì)胞的腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞質(zhì)中的cAMP含量持續(xù)增加；ST與GM1結(jié)合后，激活腸上皮細(xì)胞的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，促使細(xì)胞漿中cGMP的水平上升，且兩種腸毒素致病機(jī)理有異[30]。

LT的致病機(jī)理：?jiǎn)为?dú)的亞單位沒(méi)有生物學(xué)活性，只有結(jié)合在一起才具有全毒素的生物學(xué)和化學(xué)特性。經(jīng)典的LT致病機(jī)理為：首先B亞單位與上皮細(xì)胞膜GM1受體緊密結(jié)合，通過(guò)胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞，并經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被轉(zhuǎn)運(yùn)。其具有ADP-核糖基化轉(zhuǎn)移酶活性的A 亞單位從NAD上把一個(gè)ADP-核酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到GTP捆綁蛋白的a亞基上，激活細(xì)胞基底膜上的腺苷酸環(huán)化酶，從而引起細(xì)胞內(nèi)cAMP 濃度升高，cAMP依賴(lài)性蛋白激酶被激活，造成上皮細(xì)胞膜氯離子通道的超常磷酸化及離子通道囊性纖維變性損傷，最終使上皮細(xì)胞分泌氯離子亢奮和絨毛頂端吸收NaCl受到抑制而引起分泌性腹瀉[31]。近年來(lái)的研究還提出了一些新的LT致病機(jī)制，如LT可能通過(guò)促進(jìn)花生四烯酸代謝產(chǎn)物的合成和釋放，刺激腸道神經(jīng)系統(tǒng)及激發(fā)腸道炎癥反應(yīng)等影響腸上皮細(xì)胞的分泌。

STa的致病機(jī)理：STa的激活作用具有專(zhuān)一性，這是由于STa對(duì)小腸粘膜顆粒性酶比可溶性酶具有更高的親和力，同時(shí)小腸粘膜本身以顆粒性酶為主。研究發(fā)現(xiàn)，STa能夠激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(guanylate cyclase)系統(tǒng)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cGMP增多[32]。有關(guān)STa激活酶的作用機(jī)理主要有兩種學(xué)說(shuō)[33]：一是“瀑布”學(xué)說(shuō)，認(rèn)為STa結(jié)合到細(xì)胞膜表面，打開(kāi)鈣離子通道，鈣攝取增加，激活調(diào)鈣蛋白，觸發(fā)磷酸脂酶A，膜磷脂釋放花生四烯酸, 后者的過(guò)氧化物及過(guò)氧化氫代謝物使鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶激活。但也有的學(xué)者認(rèn)為，STa并不引起小腸細(xì)胞花生四烯酸的釋放及改變膜脂成分。二是“直接偶聯(lián)”學(xué)說(shuō)，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為STa激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶是直接的，不需要介導(dǎo)酶，即與已知腺苷酸環(huán)化酶激活機(jī)理相似，依靠ST受體復(fù)合物系統(tǒng)激活。 S.A.Waldman進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)了小腸粘膜顆粒性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶與ST受體偶聯(lián)的新模式，即兩者可能通過(guò)細(xì)胞骨架成分緊密相連。這種偶聯(lián)可抵抗各種離子、非離子去垢劑、鹽及尿素等的溶解，而其他組織上的酶可被上述物質(zhì)所溶解，但ST受體抵抗溶解作用，說(shuō)明其他組織中酶與受體無(wú)特殊偶聯(lián)關(guān)系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), 位于刷狀緣的25 kD蛋白磷酸化后，在小腸可介導(dǎo)STa毒素誘導(dǎo)的離子轉(zhuǎn)移[34]。推測(cè)ST的作用可能與霍亂腸毒素通過(guò)cAMP升高使Na泵磷酸化、Na 吸收障礙導(dǎo)致水瀉的機(jī)理相似[30]，即cGMP使Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白磷酸化，CI-主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)受抑制，進(jìn)而腸腔內(nèi)電解質(zhì)與水儲(chǔ)留引起腹瀉，使水、鈉離子、碳酸根離子大量喪失，造成脫水、代謝性酸中毒、高血鉀癥，使心力衰竭，有部分病例還會(huì)急性死亡。

STb的致病作用：STb的作用機(jī)理尚不清楚，它不能激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶和腺甘酸環(huán)化酶，也不能利用環(huán)化酶激活旁路，但有研究認(rèn)為STb在被胞飲之前是非特異性地結(jié)合到靶細(xì)胞膜上的[35]，STb會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，但對(duì)cAMP或cGMP的濃度并沒(méi)影響[36]。

4 展望

ETEC的毒力因子多而復(fù)雜，抗原性也不同， ETEC的研究方向是進(jìn)一步從分子角度闡明其致病機(jī)理，明確毒力因子產(chǎn)生與致病性的關(guān)系，深入對(duì)各個(gè)毒力因子基因的研究，以期制定出更為有效的預(yù)防和防疫措施。