細(xì)胞自噬與瘢痕疙瘩的研究進(jìn)展*

王其飛 綜述 秦澤蓮 審校

(北京大學(xué)第三醫(yī)院成形外科，北京 100191)

瘢痕疙瘩是一種原因不明的病理性瘢痕。病變范圍超過(guò)最初皮膚損傷界限，外觀表現(xiàn)為高出皮膚表面、質(zhì)硬和充血的結(jié)節(jié)狀或條索狀的病理性瘢痕[1]。作為整形外科、燒傷科和創(chuàng)傷外科的常見(jiàn)病和多發(fā)病，瘢痕疙瘩具有治療抵抗和治療后易復(fù)發(fā)的類腫瘤特征[2]，臨床上以手術(shù)切除聯(lián)合化療或放療為主要治療方案。病理性瘢痕尤其瘢痕疙瘩嚴(yán)重影響外觀和關(guān)節(jié)部位功能[3]，同時(shí)也影響微創(chuàng)治療效果。自噬主要是用于降解異常細(xì)胞蛋白聚集體和受損細(xì)胞器的有效細(xì)胞內(nèi)分解代謝途徑，最初認(rèn)為自噬主要是應(yīng)答細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，但更多證據(jù)表明它在多個(gè)生物過(guò)程中發(fā)揮正常的生理作用[4]，自噬水平異常可導(dǎo)致多種疾病發(fā)生。目前一些研究認(rèn)為自噬水平異常與瘢痕疙瘩發(fā)生發(fā)展有關(guān)，通過(guò)調(diào)控自噬水平抑制瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展，將其縮小一定程度后有利于瘢痕的微創(chuàng)治療。本文對(duì)自噬在瘢痕疙瘩中的可能作用進(jìn)行文獻(xiàn)總結(jié)。

1 細(xì)胞自噬

1.1 定義

“自噬”術(shù)語(yǔ)是由De Duve在1963年溶酶體國(guó)際會(huì)議上首次提出[5]。自噬最初的科學(xué)定義是遞送細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物至溶酶體以降解[6]，是進(jìn)化上高度保守的降解細(xì)胞內(nèi)異常蛋白和受損細(xì)胞器以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和自我更新的過(guò)程[7，8]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中自噬主要有3種類型：巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬[9]，其中巨自噬是研究最廣泛的經(jīng)典自噬類型。它獨(dú)特的特征是雙膜囊泡(自噬體)的形成，含有用于降解的底物并最終與溶酶體融合，若無(wú)特殊注明，文獻(xiàn)中所提的自噬均為巨自噬。微自噬是指不伴有自噬泡的形成，溶酶體直接內(nèi)化并降解受損細(xì)胞器的過(guò)程。特定靶蛋白在分子伴侶介導(dǎo)作用下轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中降解的過(guò)程稱為分子伴侶介導(dǎo)的自噬。

1.2 細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)

許多因素可以刺激誘導(dǎo)自噬形成，主要因素是營(yíng)養(yǎng)缺乏(例如氨基酸和葡萄糖)和生長(zhǎng)因子(例如胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子)的撤離，其他因素有細(xì)胞能量水平降低(例如ATP)、細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、缺氧和氧化應(yīng)激和病原性感染等)[10]。ULK(Unc-51-like kinase)復(fù)合物對(duì)自噬誘導(dǎo)起始至關(guān)重要，主要由ULK1/2、自噬相關(guān)基因13(autophagy related gene 13，ATG13)、ATG101和200 kD家族相互作用蛋白(family-interacting protein of 200 kD，F(xiàn)IP200)組成。ULK1/2是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，負(fù)責(zé)募集ATG蛋白；ATG13可由哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1 (mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)磷酸化并調(diào)控ULK復(fù)合物活性；ATG101結(jié)合并穩(wěn)定ATG13；FIP200為ULK和ATG13提供支架[11]。AMP依賴的蛋白激酶 (adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)和mTOR可催化ULK1的磷酸化。在營(yíng)養(yǎng)充足的條件下，AMPK失活，mTORC活化并磷酸化ULK1和ATG13，從而抑制自噬起始。在饑餓條件下AMPK活化，mTORC失活，活化的AMPK催化ULK1絲氨酸磷酸化從而促進(jìn)自噬。

2 細(xì)胞自噬在正常皮膚中水平變化和作用

成纖維細(xì)胞是瘢痕疙瘩發(fā)生過(guò)程中主要效應(yīng)細(xì)胞，研究正常皮膚成纖維細(xì)胞中自噬水平變化及其導(dǎo)致病理改變對(duì)瘢痕疙瘩的預(yù)防和治療有一定啟示作用。衰老和物理因素可導(dǎo)致正常皮膚成纖維細(xì)胞中自噬水平發(fā)生變化，同時(shí)自噬水平異常可導(dǎo)致纖維化病理改變。

2.1 衰老時(shí)正常皮膚細(xì)胞自噬水平變化

衰老常伴隨著細(xì)胞自噬水平改變[12]。目前研究表明，就細(xì)胞自噬水平而言，體內(nèi)皮膚組織標(biāo)本細(xì)胞與體外培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞衰老表型不同。Tashiro等[13]利用不同年齡女性的皮膚組織和培養(yǎng)的真皮成纖維細(xì)胞驗(yàn)證細(xì)胞自噬和皮膚老化之間的關(guān)系，透射電鏡顯示隨著年齡增長(zhǎng)，皮膚組織中新生雙膜自噬體的數(shù)量增加；免疫熒光顯微鏡示老年真皮成纖維細(xì)胞中LC3-Ⅱ量較年輕真皮成纖維細(xì)胞顯著增加。Demirovic等[14]體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞系(來(lái)源40歲女性眼瞼)，衰老細(xì)胞(第55代)LC3熒光強(qiáng)度是年輕細(xì)胞(第14代)的5倍，但是在健康年輕人(25～30歲)和老年人(60～65歲)的全厚度皮膚切片中未檢測(cè)到LC3熒光強(qiáng)度有明顯差異(P=0.418)。Kim等[15]比較15例年輕人(年齡9～18歲，平均12.7歲)包皮皮膚成纖維細(xì)胞和中老年人(年齡50～94歲，平均67歲)軀干皮膚成纖維細(xì)胞自噬活性，透射電子顯微鏡顯示年輕人和老年人成纖維細(xì)胞每1 μm2細(xì)胞質(zhì)區(qū)域的自噬體數(shù)量相似(年輕細(xì)胞：0.17±0.06，老年細(xì)胞：0.32±0.21，P=0.154)；蛋白質(zhì)印跡分析示2組LC3-Ⅱ(年輕細(xì)胞：0.31±0.23，老年細(xì)胞：0.20±0.76，P=0.087)表達(dá)無(wú)明顯差異;ELISA分析顯示2組細(xì)胞p62基礎(chǔ)水平差異無(wú)顯著性(年輕細(xì)胞：11.3±5.13，老年細(xì)胞：13.4±4.97，P=0.293);RNA測(cè)序分析顯示主要的自噬調(diào)節(jié)基因無(wú)年齡差異表達(dá)(與年輕細(xì)胞相比，老年細(xì)胞中自噬調(diào)節(jié)基因上調(diào)為FBXL2、HTR2B、MAPT、RAB33A，下調(diào)基因?yàn)镠K2、SOGA3、BNIP3，P>0.05)。皮膚組織和體外培養(yǎng)細(xì)胞的自噬水平隨衰老變化不同，原因可能為體內(nèi)外培養(yǎng)環(huán)境差異和標(biāo)本來(lái)源不同等。

2.2 物理因素作用時(shí)正常皮膚細(xì)胞自噬水平變化

氧化應(yīng)激、缺氧和紫外線照射是影響細(xì)胞自噬水平的常見(jiàn)物理因素[16～18]，然而關(guān)于氧化應(yīng)激和缺氧對(duì)正常皮膚成纖維細(xì)胞自噬水平影響研究較少。紫外線對(duì)自噬水平的影響與照射劑量有關(guān)，中小劑量促進(jìn)自噬而高劑量抑制自噬。Wu等[19]使用不同劑量(0、2、4、8、12 J/cm2)長(zhǎng)波紫外線(ultraviolet A，UVA)照射原代人真皮成纖維細(xì)胞，Western blot結(jié)果顯示自噬相關(guān)蛋白ATG5和LC3-Ⅱ的表達(dá)以及電鏡下自噬溶酶體的數(shù)量均隨照射劑量遞增而先增加后降低。張青松等[20]探討中波紫外線(ultraviolet B，UVB)對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞自噬水平影響，采用不同劑量(100、200、300、400 mJ/cm2)UVB照射培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞并于不同時(shí)間點(diǎn)觀察，結(jié)果與Wu等基本一致。中小照射劑量的UVB促進(jìn)成纖維細(xì)胞自噬，照射劑量進(jìn)一步增加時(shí)細(xì)胞自噬呈下降趨勢(shì)。中小劑量UVB照射的直接效應(yīng)是上調(diào)細(xì)胞的自噬功能, 大劑量UVB使細(xì)胞損傷嚴(yán)重, 形態(tài)和生理功能發(fā)生改變, 自噬功能下降。

2.3 細(xì)胞自噬在正常皮膚中病理作用

細(xì)胞自噬水平上調(diào)可導(dǎo)致皮膚成纖維細(xì)胞纖維化。周行等[21]報(bào)道2-甲氧雌二醇可以下調(diào)自噬水平從而抑制纖維化達(dá)到預(yù)防瘢痕的目的。2-甲氧雌二醇是雌二醇的代謝產(chǎn)物，能顯著抑制正常皮膚成纖維細(xì)胞活性，降低膠原表達(dá)。周行等[21]在低氧(1%)條件下給予不同濃度(0、5、10、25 μmol/L)2-甲氧雌二醇干預(yù)成纖維細(xì)胞，Western blot檢測(cè)示HIF-α、Ⅰ型膠原和LC3-Ⅱ蛋白質(zhì)水平降低，p62蛋白質(zhì)水平升高，且效應(yīng)呈劑量依賴性，結(jié)果表明可以通過(guò)調(diào)控自噬水平抑制纖維化預(yù)防瘢痕形成。

3 細(xì)胞自噬在瘢痕疙瘩發(fā)生和治療中的機(jī)制進(jìn)展

3.1 細(xì)胞自噬的發(fā)生機(jī)制

細(xì)胞自噬過(guò)程發(fā)生較為復(fù)雜，簡(jiǎn)而言之，當(dāng)誘導(dǎo)信號(hào)抑制mTOR1時(shí)，隨著ATG1/ULK復(fù)合物的形成觸發(fā)巨自噬過(guò)程[22]。激活的ULK 復(fù)合物作用于 Bcl-2 凋亡蛋白復(fù)合體，釋放出 Beclin-1 蛋白，游離的 Beclin-1 蛋白再與空泡分選蛋白 VPS34 (vacuolar protein sorting 34)、VPS15和ATG14L 等結(jié)合為磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基Ⅲ型(class Ⅲ phosphatidylinositol 3-kinase, PI3KC3)復(fù)合物。ULK復(fù)合物與PI3KC3復(fù)合物相結(jié)合形成哺乳動(dòng)物前自噬體結(jié)構(gòu)。ULK 復(fù)合物、PI3KC3復(fù)合物、WIPI2b(WD-repeat domain Phosphoinositide Interacting)和輕鏈蛋白3(light chain 3，LC3)等共同結(jié)合于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上特定的區(qū)域，催化產(chǎn)生磷脂酰肌醇-3-磷酸(phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P)。 PI3P可以特異性地結(jié)合多種效應(yīng)蛋白如 WIPIs、鋅指蛋白等，促進(jìn)孤立膜結(jié)構(gòu)形成。吞噬細(xì)胞伸長(zhǎng)取決于2個(gè)泛素樣綴合級(jí)聯(lián)，即ATG5-ATG12和微管相關(guān)輕鏈3(MAP-LC3/ATG8/LC3)綴合系統(tǒng)[4]。當(dāng)吞噬細(xì)胞伸長(zhǎng)時(shí)，逐漸吞噬一部分細(xì)胞質(zhì)，通過(guò)自身融合形成雙膜自噬體。最后，自噬體與溶酶體的融合導(dǎo)致自溶酶體的形成和內(nèi)容物降解[23]，降解產(chǎn)生的大分子被釋放回細(xì)胞胞質(zhì)中以供再利用。

3.2 自噬在瘢痕疙瘩發(fā)生中的機(jī)制進(jìn)展

瘢痕疙瘩分為缺氧中心區(qū)和常氧邊緣區(qū)，兩部位因氧濃度不同而表現(xiàn)生理功能有所差異。低氧作為常見(jiàn)的應(yīng)激因素可導(dǎo)致自噬水平變化[24]。Okuno等[25]報(bào)道瘢痕疙瘩缺氧中心區(qū)成纖維細(xì)胞中自噬水平較高，他們基于HE染色標(biāo)本的形態(tài)和CD31的表達(dá)觀察，將瘢痕疙瘩分為缺氧中心和常氧邊緣區(qū)，然后使用免疫組織化學(xué)分析和雙標(biāo)記免疫熒光方法檢測(cè)人類瘢痕疙瘩樣品中自噬蛋白(LC3和泛組織蛋白酶)和轉(zhuǎn)錄因子HIF同種型的表達(dá)和細(xì)胞定位。在中心區(qū)域中成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出比邊緣區(qū)成纖維細(xì)胞更多的自噬現(xiàn)象，HIF-1α表達(dá)水平也更高。相反，HIF-2α的表達(dá)在外周區(qū)的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào)。這些結(jié)果表明瘢痕疙瘩缺氧區(qū)成纖維細(xì)胞中自噬上調(diào)，該研究首次報(bào)道瘢痕疙瘩不同區(qū)域成纖維細(xì)胞中自噬標(biāo)志物差異表達(dá)，對(duì)瘢痕疙瘩的治療提供新思路。

3.3 細(xì)胞自噬在瘢痕疙瘩治療中的機(jī)制進(jìn)展

3.3.1 細(xì)胞自噬在光動(dòng)力療法(photodynamic therapy，PDT)治療瘢痕疙瘩中的作用機(jī)制

PDT是一種具有微創(chuàng)和定位準(zhǔn)確的治療瘢痕疙瘩的方法[26]。5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)是血紅素生物合成的前體，可以酶促轉(zhuǎn)化為原卟啉Ⅸ，后者又與組織穿透光相互作用產(chǎn)生最終誘導(dǎo)細(xì)胞破壞的活性氧。Liu等[27]以5-ALA-PDT(5-ALA劑量1 Mm/ml，激光功率密度為2 J/cm2)處理瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞后細(xì)胞活性降低，說(shuō)明該方法治療瘢痕疙瘩具有可行性。電子顯微鏡下觀察到自噬體和自噬溶酶體在處理后均在細(xì)胞中顯著積累，蛋白質(zhì)印記顯示LC3-Ⅱ表達(dá)增加而p62顯著降低；經(jīng) mRFP-GFPLC3B轉(zhuǎn)染細(xì)胞后5-ALA-PDT處理組細(xì)胞自噬潮明顯增加。給予自噬抑制劑3-MA明顯抑制5-ALA-PDT誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，表明5-ALA-PDT通過(guò)促進(jìn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞自噬水平而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

研究證實(shí)SIRT1-SIRT3-SOD2-mROS通路上調(diào)抑制自噬水平[27]。SIRT1和SIRT3是沉默信息調(diào)節(jié)因子2(Sir2)蛋白家族的2個(gè)成員[28，29]。5-ALA-PDT以時(shí)間依賴性方式誘導(dǎo)SIRT1蛋白降解,而 SIRT1可能抑制SIRT3-SOD2通路的活性。SOD2是主要的線粒體氧化清除劑，在ROS的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[30]。Liu等[27]研究表明5-ALA-PDT以時(shí)間依賴性方式顯著增加SIRT3蛋白水平和SOD2活性，而不改變SOD2蛋白水平。ROS增強(qiáng)細(xì)胞自噬水平，給予線粒體抗氧化劑Mito-TEMPO(線粒體靶向SOD模擬物)處理后mROS明顯下降，LC3-Ⅱ表達(dá)水平下降。SIRT1-SIRT3-SOD2-mROS依賴性自噬途徑下調(diào)影響5-ALA-PDT對(duì)瘢痕疙瘩的治療效果。

3.3.2 細(xì)胞自噬在藥物治療瘢痕疙瘩中的作用機(jī)制

雷帕霉素作為常見(jiàn)的自噬誘導(dǎo)劑，在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼中研究較為深入[31～33]，對(duì)瘢痕疙瘩治療機(jī)制和效果不甚明確。作為一種大環(huán)內(nèi)酯類化合物，可通過(guò)與mTOR 結(jié)合阻斷mTOR 信號(hào)通路，激活細(xì)胞自噬，促進(jìn)異常蛋白質(zhì)或病變細(xì)胞的吞噬、凋亡，已成為臨床上治療及預(yù)防多種疾病的靶向新途徑。陳琳等[34]利用蛋白質(zhì)印記和免疫組化檢測(cè)瘢痕疙瘩和正常皮膚真皮成纖維細(xì)胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3的表達(dá)水平的差異，并用雷帕霉素干預(yù)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞檢測(cè)Collagen Ⅰ和SMA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示瘢痕疙瘩中LC3表達(dá)高于正常皮膚，雷帕霉素可降低瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中Collagen Ⅰ和SMA的表達(dá)，表明自噬參與瘢痕疙瘩發(fā)病過(guò)程，雷帕霉素誘導(dǎo)自噬進(jìn)而調(diào)控成纖維細(xì)胞合成膠原及向肌成纖維細(xì)胞分化來(lái)抑制瘢痕疙瘩的發(fā)生。高景等[35]用不同濃度的雷帕霉素處理人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，MTS檢測(cè)法顯示雷帕霉素抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。透射電鏡觀察處理組自噬小體的雙層膜結(jié)構(gòu)較對(duì)照組明顯增多，Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)增加，mTOR信號(hào)通路下游基因4EBPl(10、50、100 nmol/L雷帕霉素處理組的基因表達(dá)與未處理組的比值分別為0.87±0.03、0.38±0.07、0.22±0.09，P<0.05)和p70S6K(10、50、100 nmol/L雷帕霉素處理組的基因表達(dá)與未處理組的比值分別為0.68±0.03、0.55±0.03、0.31±0.06，P<0.05)的表達(dá)均有下調(diào)，參與調(diào)控細(xì)胞自噬的miR-885-3p、miR-204、miR-101、miR-376b(10、50、100 nmol/L雷帕霉素處理組以上4種miRNA基因表達(dá)與未處理組的比值分別1.56±0.24、5.25±0.72、10.10±0.58，1.97±0.42、2.94±0.22、4.16±0.36，1.71±0.23、3.29±0.35、5.02±0.33，1.49±0.16、2.74±0.12、3.73±0.19，50、100 nmol/L處理組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05)表達(dá)水平上升，miR-30a(0.73±0.07、0.50±0.07、0.22±0.05，50、100 nmol/L處理組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05)表達(dá)水平下降。以上結(jié)果表明自噬參與雷帕霉素抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的活性，通過(guò)雷帕霉素干預(yù)細(xì)胞自噬可能是一種有效的治療瘢痕的途徑。

苦參堿是從豆科植物中分離獲得的生物堿，具有抗腫瘤[36]和抗纖維化[37，38]功能，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞分化、抑制侵襲和遷移達(dá)到抗腫瘤效果，通過(guò)抑制肺間質(zhì)細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原合成從而抑制肺纖維化的發(fā)展。然而，該藥對(duì)具有類腫瘤和纖維化增生特性的瘢痕疙瘩作用機(jī)制研究甚少。徐志山等[39]對(duì)體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞給予0、10、20 μmol/L濃度的苦參堿處理，結(jié)果顯示苦參堿以劑量依賴性抑制成纖維細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)顯示抗自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ的表達(dá)下降，促自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)升高，表明苦參堿能夠影響自噬相關(guān)蛋白表達(dá)促進(jìn)自噬，進(jìn)而影響瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞功能。

4 小結(jié)

瘢痕疙瘩具有治療抵抗和術(shù)后易復(fù)發(fā)的特征，深入研究發(fā)病機(jī)制更有利于瘢痕疙瘩的預(yù)防和治療。細(xì)胞自噬是細(xì)胞應(yīng)激時(shí)的一種生理變化，當(dāng)水平異常時(shí)可以導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，因此，對(duì)細(xì)胞自噬的研究具有重要的理論意義。細(xì)胞自噬與瘢痕疙瘩發(fā)生和治療關(guān)系的報(bào)道較少，僅有光動(dòng)力療法、雷帕霉素和苦參堿對(duì)瘢痕疙瘩的治療，但這些治療方案都不是治療瘢痕疙瘩的主流。期望今后更多研究探討放射治療、抗腫瘤藥物、激素和硅凝膠等臨床常用方案對(duì)瘢痕疙瘩自噬活性的影響并更加深入研究 PI3K/AKT/mTOR和AMPK/mTOR等自噬相關(guān)通路的作用。