應(yīng)用噬菌體控制假單胞菌的研究進(jìn)展

劉婷 溫慧 滿都拉 陳忠軍 孫子羽

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特 010018)

假單胞菌屬細(xì)菌是一類在自然界分布十分廣泛的微生物，在自然界以及生物體中都可見到，由其引起的感染在世界范圍內(nèi)對人類造成了相當(dāng)大的發(fā)病率和死亡率。假單胞菌屬細(xì)菌不僅可以感染人類，而且也是密集飼養(yǎng)的皮毛動物、水產(chǎn)養(yǎng)殖類動物和植物的致病菌，也是肉類、乳制品、蛋類等蛋白質(zhì)食物的污染菌。

假單胞菌屬是一個(gè)異質(zhì)性很強(qiáng)的屬，利用傳統(tǒng)的生理生化方法已滿足不了此屬微生物的分類。目前，主要是通過核酸雜交技術(shù)、(G+C)mol%含量測定和核酸序列分析等分子生物學(xué)的手段對其進(jìn)行分類，其中利用16S rRNA序列分析是最常用的分子生物學(xué)方法。根據(jù)16S rRNA 序列的研究對假單胞菌屬分成以下7個(gè)組：銅綠假單胞菌組、熒光假單胞菌組、惡臭假單胞菌組、丁香假單胞菌組、施氏假單胞菌組、綠針假單胞菌組和穿孔素假單胞菌組[1-2]。目前就假單胞菌屬中研究最多的是銅綠假單胞菌。銅綠假單胞菌是條件致病性細(xì)菌，可引起許多嚴(yán)重的急、慢性感染，由其引起的肺炎、感染性休克、尿道、胃腸道感染和燒傷患者皮膚和軟組織等感染對人類造成了非常大的危害[3]，并且也是污染肉制品、涼拌即食食品、飲用水等食品的致病菌和腐敗菌[4]。除銅綠假單胞菌以外，其他假單胞菌也可引起嚴(yán)重的感染[5]。如變形假單胞菌可引起香魚類水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的細(xì)菌出血。熒光假單胞菌是松材線蟲攜帶的主要致病菌[6]，也可引起冷藏食品的腐敗同時(shí)也是一種罕見的人類機(jī)會致病菌[7]。丁香假單胞菌是植物的致病菌，常引起植物的病變[8-9]。惡臭假單胞菌是魚的一種致病菌也會引起食物中毒和人類感染[10-11]。

假單胞菌本身細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和抗生素濫用，導(dǎo)致其抗藥性嚴(yán)重，抗生素防治困難，運(yùn)用噬菌體來控制假單胞菌將是一種新型手段。本文就假單胞菌噬菌體在食品、水產(chǎn)、植物、醫(yī)療領(lǐng)域的研究做一綜述。

1 噬菌體

噬菌體被定義為感染細(xì)菌的病毒。1917年加拿大微生物學(xué)家D'Herelle首次提出了噬菌體的概念[12]。到目前為止，噬菌體被認(rèn)為是地球上最豐富最多樣化的微生物[13]。2011年，國際病毒分類委員會根據(jù)噬菌體病毒核酸類型、基因組、基本特性、形態(tài)結(jié)構(gòu)以及宿主菌種類等特征將噬菌體進(jìn)行了最新分類[14]。報(bào)告中所包含的噬菌體絕大多數(shù)是dsDNA噬菌體，而ssDNA、dsRNA和ssRNA噬菌體所占比例則相對較少。噬菌體在大多數(shù)環(huán)境中都普遍存在，包括人體皮膚，口腔和胃腸道等[15]。迄今分離的大多數(shù)噬菌體對其宿主而言具有相對高的特異性，不會觸及其他微生物菌群，這是噬菌體獨(dú)特的性質(zhì)。其次噬菌體可以自我復(fù)制和自我限制，也就是說只要有宿主存在，低或單一劑量的噬菌體會成倍增加，使它們的抗菌素效應(yīng)也成倍增加。噬菌體本身具有的防御機(jī)制，可以不斷地適應(yīng)環(huán)境，在非常惡劣的環(huán)境條件下仍然具有很強(qiáng)的感染性，往往會繼續(xù)繁殖，直至宿主細(xì)菌的種群密度顯著降低[16-17]。噬菌體主要由核酸和蛋白質(zhì)組成，因此噬菌體不會感染真核細(xì)胞[18]。噬菌體的這種優(yōu)勢降低了危害人體天然微生物菌群的風(fēng)險(xiǎn)，并消除了與化學(xué)抗生素相關(guān)的副作用、殘留。無論是噬菌體，還是噬菌體編碼的裂菌蛋白或噬菌體傳送的CRISPR系統(tǒng)都可以用來防控細(xì)菌、耐藥細(xì)菌的感染[19]。除了使用噬菌體來治療人類細(xì)菌性疾病，使用噬菌體制劑來治療由細(xì)菌引起的動物性[20]和植物性[21]疾病也引起了人們的重視，并且也正在開發(fā)一種使用噬菌體控制食物中的致病菌和腐敗菌的新型治療手段[22]。目前，銅綠假單胞菌噬菌體、熒光假單胞菌噬菌體、變形假單胞菌噬菌體和丁香假單胞菌噬菌體等都已經(jīng)在各個(gè)領(lǐng)域中有了一些應(yīng)用。因此運(yùn)用噬菌體來預(yù)防和控制假單胞菌將會有很大的潛力。

2 噬菌體防控假單胞菌屬細(xì)菌的應(yīng)用研究

2.1 在食品領(lǐng)域

微生物是影響食品品質(zhì)的重要因素，在食品加工、運(yùn)輸和貯藏過程中特別容易腐敗變質(zhì)，這不僅影響食品的色香味而且也會導(dǎo)致食品污染甚至引起食品安全事故。目前化學(xué)防腐劑在食品工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最多。但是化學(xué)防腐劑對人體存在很多潛在的危害，并且在食品生產(chǎn)工業(yè)中的應(yīng)用也存在著不足，應(yīng)用于食品工業(yè)中的這些化學(xué)防腐劑大部分沒有經(jīng)過科學(xué)而全面的篩選，而且化學(xué)防腐劑的濫用和過量使用對消費(fèi)者的身體健康造成了很大的危害，這已經(jīng)引起了消費(fèi)者對食品安全的重視[23-24]。所以，在食品領(lǐng)域需要研發(fā)一種綠色的、無毒無害的、應(yīng)用前景良好的產(chǎn)品來防控和抑制微生物的影響。而噬菌體就是一個(gè)很好的選擇。

隨著生活水平的提高，乳制品已經(jīng)是一種不可或缺的食品。假單胞菌是原料乳中一類主要的嗜冷菌，原料乳中的假單胞菌包括熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌等。熒光假單胞菌可以在低溫環(huán)境下生長繁殖，如果低溫冷藏條件下的原料乳被熒光假單胞菌感染[25]，該菌便會大量繁殖，并且逐漸變?yōu)閮?yōu)勢菌群。引起原料乳變質(zhì)，使乳制品的口感與安全受到威脅[26]。Sillankorva等[27]以控制原料乳中假單胞菌為目標(biāo)對熒光假單胞菌噬菌體ΦIBB-PF7A做了生理特性和基因組信息等研究。胡子毅等[28]從原料乳中分離篩選假單胞菌噬菌體，試驗(yàn)結(jié)果顯示，不論在4℃還是在25℃條件下，噬菌體均能有效地在液態(tài)乳體系中控制假單胞菌的生長，同時(shí)還能顯著降低原料乳中的嗜冷菌數(shù)以及細(xì)菌總數(shù)并延緩細(xì)菌的生長速度。Hu等[29]從污水中分離出13種針對13種假單胞菌菌株的新型裂解噬菌體，試驗(yàn)結(jié)果同樣表明，具有不同形態(tài)和生理特征的13種噬菌體可以有效控制生乳中假單胞菌的增長。假單胞菌不僅是乳品中的主要優(yōu)勢菌群。在有氧的條件下，假單胞菌菌也是導(dǎo)致肉品腐敗的主要優(yōu)勢菌群[30]。Greer[31]從冷卻牛肉中分離出假單胞菌噬菌體，試驗(yàn)顯示假單胞菌噬菌體可以有效延長冷卻零售牛肉的貨架期。在國內(nèi)，對肉中假單胞菌生長模型的研究比較多，而對其相應(yīng)噬菌體的研究還比較少有待于進(jìn)一步研究。平菇、雙胞蘑菇等食用菌是我國食用量很大的菇類，但是由于托拉假單胞菌所引起的細(xì)菌性斑點(diǎn)病不僅會降低這些菇類的產(chǎn)量，也會影響食用品質(zhì)[32]。Kim等[33]從污水中分離出來了托拉假單胞菌噬菌體，試驗(yàn)結(jié)果顯示噬菌體可以殺滅蘑菇組織中的病原菌，減少作物損失。食品致病菌和腐敗菌產(chǎn)生的巨大負(fù)面影響使得控制食品微生物污染的需求得到加強(qiáng)。使用噬菌體作為天然抗菌劑在控制食物病原體和腐敗微生物方面具有巨大的潛力。噬菌體適用于從農(nóng)場到餐桌的每個(gè)環(huán)節(jié)，不論是食品加工設(shè)備還是食品運(yùn)輸過程都可以使用噬菌體來進(jìn)行防控，噬菌體也可以作為食品中的天然防腐劑，延長產(chǎn)品的保質(zhì)期，保證食品質(zhì)量[22,34]。噬菌體制劑在食品領(lǐng)域的研究越來越多，并且已經(jīng)有很多噬菌體制劑用于食品中。

2006年，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)為了控制單增李斯特菌的污染批準(zhǔn)了ListShieldTM噬菌體產(chǎn)品可作為食品添加劑，相繼又有許多其他噬菌體雞尾酒產(chǎn)品(單增李斯特菌屬，沙門菌屬和大腸埃希菌屬等)被批準(zhǔn)應(yīng)用[35-36]。市售的假單胞菌噬菌體有 Omnilytics有限公司針對丁香假單胞菌的Agriphage噬菌體產(chǎn)品。Brimrose科技公司的針對銅綠假單胞菌的Pyo-bacteriophage和Intesti-bacteriophage噬菌體產(chǎn)品。我國雖然沒有批準(zhǔn)應(yīng)用的噬菌體產(chǎn)品，但是在使用噬菌體制劑來保障食品品質(zhì)和安全方面已經(jīng)有了不錯(cuò)的成績。

2.2 在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人類對海洋食品需求的增加，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，但是由細(xì)菌和病毒感染所引起的疾病越來越嚴(yán)重，導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖部門遭受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的大量使用，對人類和動物的健康以及對環(huán)境的破壞也日益嚴(yán)重[37]。在這種情況下，高效環(huán)保的噬菌體療法正發(fā)揮著作用。

影響水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要假單胞菌屬細(xì)菌有變形假單胞菌和銅綠假單胞菌。變形假單胞菌是革蘭陰性菌，在自然環(huán)境中常見。變形假單胞菌可引起香魚、大黃魚等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的細(xì)菌出血性敗血病，造成非常大的損失[38]。

Park等[39]在患有敗血病的香魚組織內(nèi)和養(yǎng)殖香魚的池水中篩選出了兩株變形假單胞菌的噬菌體。在噬菌體治療試驗(yàn)中，香魚被喂養(yǎng)含有變形假單胞菌的飼料，然后再分成4組分別喂食含有單一噬菌體、2種噬菌體混合制劑和不含有噬菌體浸漬的飼料。香魚的死亡率分別為53.3%、40.0%、20.0%和93.3%。試驗(yàn)表明2種單一噬菌體對變形假單胞菌的抑制效果不同，但是含有2種噬菌體的混合制劑效果最佳。隨后Kawato等[40]對Park等[39]之前篩選出的變形假單胞菌噬菌體的基因組序列進(jìn)行分析，結(jié)果再次驗(yàn)證了之前Park等[39]的試驗(yàn)結(jié)果，這兩種裂解噬菌體可以用作噬菌體制劑。因此，運(yùn)用噬菌體制劑來有效控制香魚細(xì)菌性出血性敗血病是一種較好的選擇。而引起鯰魚物種潰瘍性病變的致病性細(xì)菌是銅綠假單胞菌。Khairnar等[41]運(yùn)用噬菌體療法在8～10d內(nèi)有效的治愈了被感染魚的潰瘍性病變，與未治療的魚相比感染降低了7倍。由此可知噬菌體療法也可以用于治療魚類潰瘍性病變。作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素處理的替代或補(bǔ)充，噬菌體治療可能很快就會有潛在的應(yīng)用。

2.3 在植物領(lǐng)域

植物細(xì)菌性疾病一直是影響農(nóng)業(yè)發(fā)展的災(zāi)害之一，而由丁香假單胞菌引發(fā)的植物病害發(fā)生率居十大細(xì)菌性植物病害之首[42]。

丁香假單胞菌是獼猴桃細(xì)菌潰瘍的致病因子，它給獼猴桃種植帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，然而采用傳統(tǒng)方法未能充分控制丁香假單胞菌的感染。Lallo等[43]從受感染的葉子和污水中分別分離篩選出噬菌體fPSA1和fPSA2，其中fPSA2是毒性噬菌體，可以感染所有丁香假單胞菌測試菌株。試驗(yàn)結(jié)果為噬菌體治療獼猴桃細(xì)菌性潰瘍提供了一定的研究基礎(chǔ)。

丁香假單胞菌也是引起韭菜細(xì)菌性枯萎的致病因子，由于缺乏有效的控制措施，導(dǎo)致韭菜栽培出現(xiàn)了嚴(yán)重的問題。Rombouts等[44]從受感染的田中分離出5種新的噬菌體分別為vB_PsyM_KIL1、vB_PsyM_KIL2、vB_PsyM_KIL3、vB_PsyM_KIL4和vB_PsyM_KIL5。試驗(yàn)中又加入另一種噬菌體vB_PsyM_KIL3b。經(jīng)特異性生物測定結(jié)果證明了噬菌體vB_PsyM_KIL1、vB_PsyM_KIL2、vB_PsyM_KIL3和vB_PsyM_KIL3b在植物治療中的功效。此外，使用6種噬菌體混合物在田間試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示噬菌體混合物可以控制韭菜細(xì)菌性枯萎病。

以上這些都可以表明噬菌體療法在植物病害防治方面有一些潛力，但后期需要在配方和應(yīng)用方法上面進(jìn)行優(yōu)化。噬菌體具有替代抗生素和化學(xué)藥品的潛力，商業(yè)化的丁香假單胞菌噬菌體產(chǎn)品已被用于植物疾病的防治[45]。

2.4 在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域

出于安全性的考慮，假單胞菌噬菌體的試驗(yàn)主要在動物模型中進(jìn)行。在皮膚，角膜炎，肺部等感染模型中的治療都已經(jīng)有了非常顯著的效果。Debarbieux等[46]使用生物熒光銅綠假單胞菌菌株監(jiān)測和量化噬菌體治療急性肺部感染小鼠的功效。結(jié)果顯示噬菌體治療不僅能有效地使動物免受致命性感染，而且在細(xì)菌感染前24h注入還可以預(yù)防肺部感染。Furusawa等[47]使用噬菌體來治療馬細(xì)菌性角膜炎，在角膜炎小鼠模型中，3h內(nèi)施用噬菌體可以殺死細(xì)菌并抑制角膜炎。研究結(jié)果顯示噬菌體可完全預(yù)防由銅綠假單胞菌引起的角膜炎。除了使用小鼠做試驗(yàn)，Beeton等[48]使用的蠟螟模型試驗(yàn)也取得了成功。他們使用實(shí)驗(yàn)室銅綠假單胞菌菌株P(guān)A01去感染蠟螟幼蟲，并且在感染前2h和感染后2h把不同感染復(fù)數(shù)的噬菌體注射到幼蟲血淋巴中。結(jié)果表明，感染24h后，噬菌體使血淋巴中的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量比未處理組低1000倍。Gu等[49]從水貂中分離純化出YH30噬菌體。宿主范圍測定顯示YH30對所有測試的銅綠假單胞菌菌株都具有感染性，試驗(yàn)結(jié)果也顯示YH30噬菌體可以有效治療銅綠假單胞菌引起的出血性肺炎。這些試驗(yàn)均擴(kuò)大了噬菌體作為治療藥物的潛在用途。

銅綠假單胞菌是醫(yī)院內(nèi)獲得性感染的重要致病菌。據(jù)估計(jì)，由燒傷所引起的死亡中至少有一半是因?yàn)楦腥玖算~綠假單胞菌，并且感染銅綠假單胞菌的患者大多不可治愈[50]。銅綠假單胞菌一般情況下對多種抗生素耐藥，已被加入了“超級細(xì)菌”的行列[51]。抗生素已經(jīng)無法達(dá)到理想的治療效果。而且在過去的30多年里，也一直沒有開發(fā)出新型的抗生素來治療銅綠假單胞菌所引起的病變。因此，需要制定新的預(yù)防和治療策略來控制燒傷患者的細(xì)菌性感染和銅綠假單胞菌耐藥性日益增多的現(xiàn)象，其中一種安全有效的方法就是噬菌體療法[52]。

1958年，我國第一位細(xì)菌學(xué)博士余?教授[53]在上海應(yīng)用自制的銅綠假單胞菌噬菌體成功治愈了全國著名勞模邱財(cái)康的大面積燒傷，保全了他的肢體。這為我國銅綠假單胞菌噬菌體療法用于臨床中提供了研究依據(jù)。Marza等[54]用噬菌體成功治療了由銅綠假單胞菌感染的燒傷患者，并且在患者傷口感染處沒有分離出銅綠假單胞菌。銅綠假單胞菌不僅可以引起燒傷患者感染也是引起慢性中耳炎的病原菌。Wright等[55]使用噬菌體制劑治療銅綠假單胞菌引起的慢性中耳炎，試驗(yàn)選取了24位持續(xù)患有慢性中耳炎2～58年的患者。參與者被隨機(jī)分為兩組，每組12人進(jìn)行對照試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明噬菌體治療組患者的臨床各項(xiàng)指標(biāo)得到改善且銅綠假單胞菌數(shù)量明顯降低，且并未發(fā)現(xiàn)任何的不良反應(yīng)。對于治療多重耐藥性銅綠假單胞菌的感染，噬菌體制劑的臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示出了很好的療效同時(shí)也具有安全性。

3 總結(jié)與展望

目前，抗生素類藥品在防治腐敗菌和致病菌方面仍占有主導(dǎo)地位，但是由于抗生素的大量使用，也使得細(xì)菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，甚至出現(xiàn)了“超級細(xì)菌”。而噬菌體作為一種新型的抗菌制劑與抗生素等抗菌劑相比在抗菌方面更適合長期的使用。噬菌體在替代化學(xué)防腐劑和抗生素方面有很多的優(yōu)點(diǎn)，也取得了巨大的成功，但是在食品、水產(chǎn)、植物甚至醫(yī)藥行業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用還是有很大的阻礙。例如噬菌體的抑菌譜比較窄、以及噬菌體的安全性等問題都需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證，但是隨著基因工程技術(shù)的不斷成熟，以及噬菌體與其他抗菌制劑的聯(lián)合使用[56]。使得噬菌體的研究和應(yīng)用得到了進(jìn)一步的發(fā)展，也解決了很多噬菌體可能帶來的安全隱患問題。國外商業(yè)化的噬菌體生物制劑在不斷增多，并且我國近些年來對噬菌體的關(guān)注也越來越多，噬菌體在不同領(lǐng)域的研究也取得了很多成果，我們應(yīng)進(jìn)一步深入地去研究并促進(jìn)噬菌體制劑在各個(gè)領(lǐng)域中的發(fā)展應(yīng)用。最后需要強(qiáng)調(diào)的是，如果有一天噬菌體被廣泛用于不同領(lǐng)域的時(shí)候，我們應(yīng)該注意不要過度使用，抗生素就是一個(gè)很好的例子。