重組IL-12對人乳腺癌細胞自噬的研究

林艷 林倩 劉婷莉 馬玉華 何春容 梁樹梅 周明莉

摘要：目的? 探討重組人IL-12（rIL-12）對乳腺癌細胞自噬的影響。方法? 兩株乳腺癌細胞（MDA-MB-231和MCF7）分別用rIL-12處理，經(jīng)免疫蛋白印跡技術(shù)和細胞免疫熒光技術(shù)檢測其自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）的變化，以觀察自噬情況;另外，用透射電鏡觀察rIL-12處理乳腺癌細胞前后自噬小體的變化。分別用胰島素樣生長因子1（IGF-1）激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路，再加入rIL-12處理后，蛋白免疫印跡法檢測相關(guān)通路蛋白PI3K/Akt， 哺乳動物雷帕霉素靶點（TOR）磷酸化變化及LC3的表達。結(jié)果? 與空白組相比，rIL-12組細胞的自噬標志蛋白LC3表達增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且增加程度呈時間和濃度依賴性;熒光顯微鏡觀察自噬體形成的結(jié)果顯示，與空白組相比，rIL-12處理組的細胞核周點狀聚集的綠色熒光增多;使用電鏡觀察到rIL-12處理組明顯有自噬小體形成。與rIL-12組相比，IGF-1+rIL-12組的LC3Ⅱ表達減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論? rIL-12可以激活乳腺癌細胞自噬，并通過抑制PI3K/Akt信號通路的機制，促進自噬標志蛋白LC3，特別是LC3Ⅱ的表達。

關(guān)鍵詞：自噬;乳腺腫瘤;重組人IL-12;PI3K/Akt通路

中圖分類號：R737.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.23.018

文章編號：1006-1959（2019）23-0064-06

Study on Autophagy of Human Breast Cancer Cells by Recombinant IL-12

LIN Yan，LIN Qian，LIU Ting-li，MA Yu-hua，HE Chun-rong，LIANG Shu-mei，ZHOU Ming-li

（Department of Clinical Medical Laboratory，Chengdu Third People's Hospital，Chengdu 610031，Sichuan，China）

Abstract：Objective? To investigate the effect of recombinant human IL-12 （rIL-12） on breast cancer cell autophagy. Methods? Two breast cancer cells （MDA-MB-231 and MCF7） were treated with rIL-12， and the changes of autophagy microtubule-associated protein light chain 3 （LC3） were detected by immunoblotting and cell immunofluorescence. Observe autophagy; in addition， observe the change of autophagosomes in breast cancer cells before and after treatment with rIL-12 using transmission electron microscopy. Insulin-like growth factor 1 （IGF-1） was used to activate the phosphatidylinositol-3 kinase / protein kinase B （PI3K / Akt） pathway， and then treated with rIL-12. Western blot was used to detect the related pathway protein PI3K / Akt ， Mammalian rapamycin target （TOR） phosphorylation changes and LC3 expression. Results? Compared with the blank group， the expression of autophagy marker protein LC3 in the cells of the rIL-12 group was significantly increased， the difference was statistically significant （P<0.05）， and the degree of increase was time- and concentration-dependent; The results showed that， compared with the blank group， the green fluorescence around the nucleus in the rIL-12 treated group was significantly increased; it was observed that the autophagic bodies were formed in the rIL-12 treated group. Compared with rIL-12 group， the expression of LC3Ⅱ in IGF-1 + rIL-12 group was significantly reduced，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? rIL-12 can activate the autophagy of breast cancer cells， and promote the expression of autophagy marker protein LC3， especially LC3Ⅱ through the mechanism of inhibiting PI3K / Akt signaling pathway.

Key words：Autophagy;Breast tumor;Recombinant human IL-12;PI3K/ Akt pathway

乳腺癌（breast carcinoma）是導致世界女性因癌癥死亡的重要原因[1]。在乳腺癌患者中，近50%的病例和60%的死亡率發(fā)生在發(fā)展中國家[2]。自噬是一種通過溶酶體來降解受損細胞器以及錯誤折疊的蛋白質(zhì)的自我消化機制[3]，在合成、降解和大分子與細胞器的循環(huán)之間保持平衡。自噬被認為具有抑制腫瘤和促進腫瘤生長的功能[4，5]，這可能和不同的腫瘤類型和發(fā)展階段有關(guān)[6，7]。在對乳腺癌細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，自噬能夠抑制腫瘤的發(fā)生，自噬標記基因 beclin 1的過表達會抑制乳腺癌細胞的生長[8]，40%～75%的人乳腺癌細胞、卵巢癌和前列腺癌細胞存在beclin 1缺陷[9，10]。在體內(nèi)外實驗中，beclin 1能夠抑制腫瘤細胞增殖和腫瘤形成[11]，許多抗癌藥物，包括他莫西芬、雷帕霉素、三氧化二砷和組蛋白去乙酰化酶抑制劑會導致細胞因自噬而死亡。因此，激活自噬可能是抑制乳腺癌細胞發(fā)生的重要方式。先前研究已經(jīng)證實了IL-12的抗腫瘤效應[12]。IL-12 通過活化大量T細胞、巨噬細胞、樹突細胞來抑制腫瘤細胞生長[13]，通過抑制血管的生長來減少營養(yǎng)和氧的供給，從而抑制腫瘤細胞生長[14]，能夠刺激或抑制腫瘤細胞分泌腫瘤相關(guān)細胞因子。有研究表明IL-12能夠通過上調(diào)巨噬細胞集落刺激因子1受體的表達和磷酸化誘導單細胞腫瘤細胞向巨噬細胞樣細胞極化[15]。然而，IL-12的抗腫瘤作用機制仍有待闡明。此外，IL-12對腫瘤細胞自噬的影響及其機制的報道較少。本文探討了IL-12誘導人乳腺癌細胞自噬的可能信號通路，旨在為IL-12介導的抗腫瘤作用機制提供新的參考。

1材料與方法

1.1細胞及試劑? 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231和MCF-7細胞來源于ATCC;DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;胎牛血清購自杭州四季青公司;人重組IL-12購自美國peprotech公司;重組人IGF-1細胞因子購自美國R&D公司;兔抗人LC3A/B抗體購自美國NOVUS公司;兔抗人p-Akt（473）/Akt抗體和兔抗人p-mTOR /mTOR均購自美國CST公司;兔抗人多克隆β-actin抗體購自美國Immunoway公司;辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP） 標記的羊抗兔 IgG（二抗）和FITC標記的羊抗兔二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;SDS-PAGE及免疫熒光相關(guān)試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;化學發(fā)光試劑購自德國Merck Millipore 公司;熒光顯微鏡來自日本Nikon Corporation。

1.2細胞培養(yǎng)? 乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7細胞均分別用含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，含100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素。當細胞融合率約80%時， 用0.25%胰酶消化并傳代，置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)? 箱中培養(yǎng)。將MDA-MB-231和MCF-7細胞（約1×106/孔）接種于6孔板，待其在6孔板中長到約60%融合時，開始實驗處理。

1.3實驗處理分組? ①將MDA-MB-231和MCF-7細胞分為空白組（B）、rIL-12組（1、2、3、5、12）、陽性對照組（P），其中rIL-12組，分別用5 ng/ml的rIL-12培養(yǎng)1， 2， 3， 6， 12 和 24 h。另外另將細胞分? ? 為空白組（B）、rIL-12組分別用0.1， 0.5， 1， 5， 10 和 20 ng/ml的rIL-12培養(yǎng)乳腺癌細胞12 h，Western blot檢測細胞內(nèi)LC3蛋白，特別是LC3Ⅱ的表達情況。②將細胞分為空白組，rIL-12組和陽性對照組，rIL-12組用5 ng/ml的rIL-12培養(yǎng)人乳腺癌細胞24 h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞LC3的表達情況。③將細胞分為空白組，rIL-12組，rIL-12組用? 5 ng/ml的rIL-12 培養(yǎng)乳腺癌細胞12 h，用透射電子顯微鏡觀察空白組和rIL-12自噬小體。④Akt通路實驗：包括rIL-12+IGF-1組和IL-12 組。rIL-12+IGF-1組：先用 100 ng/ml的IGF-1 培養(yǎng) 2 h，再加入 5 ng/ml的rIL-12 培養(yǎng) 4 h。IL-12 組：5 ng/ml的rIL-12培養(yǎng)4 h。⑤本實驗所有的空白組（圖中分組表示為B）為10%胎牛血清培養(yǎng)基，陽性對照組（圖中分組表示為P）為含1%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基饑餓3 h 。

1.4蛋白免疫印跡分析? 實驗完成后，收集6孔板中MDA-MB-231和MCF-7細胞，提取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白后，濕轉(zhuǎn)至0.45 μm 的PVDF膜，5%小牛血清封閉1 h，分別加入一抗，LC3，p-mTOR/mTOR，p-Akt（473）/Akt抗體的稀釋比例均為1∶1000;β-actin的稀釋比例為1∶2000），4℃過夜;用TBST洗膜，加入二抗（稀釋比例為1∶1000），37℃反應2 h;用TBST洗膜后按照電化學發(fā)光試劑盒說明進行顯影。采用Quantity One 4.5.2軟件對各組電泳條帶進行灰度值分析，以其與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值來評估各相關(guān)分子的蛋白相對表達水平。

1.5免疫熒光? 在24孔培養(yǎng)板中置入8×8 mm的滅菌爬片，再加入MDA-MB-231和 MCF-7 兩株乳腺癌細胞懸液（約2×105/孔），當其生長約60%融合時，開始實驗組處理。實驗處理完畢后用預冷的PBS洗3次，用4%的多聚甲醛室溫固定20 min后再次用預冷PBS洗3次。爬片用0.1%的Triton透膜15 min后，預冷PBS洗3次。10%山羊血清（PBS稀釋）室溫封閉30min。之后加入LC3一抗4℃ 孵育過夜（LC3一抗用10% 山羊血清1∶200稀釋），洗滌后用FITC標記的羊抗兔二抗（山羊血清1∶200稀釋）室溫避光孵育2 h。再次洗滌后，用10% 用PBS稀釋的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）室溫孵育5 min，洗滌3次后用甘油封片4℃避光保存，在熒光顯微鏡野下（×800）觀察LC3綠色熒光點表達。

1.6透射電子顯微鏡? MDA-MB-231和MCF-7 兩株乳腺癌細胞用濃度為rIL-12（5 ng/ml）的10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h后用預冷PBS洗3次，用0.1%胰蛋白酶消化收集細胞，用4℃離心機1，500 xg 離心10 min，棄去微量離心管上清液，沿管壁加入1.5 ml的2.5% 戊二醛放于4℃固定至少2 h。及時送重慶醫(yī)科大學生命科學院電鏡室進行制樣和拍片（×30000）。

1.7統(tǒng)計學方法? 應用SPSS 19.0軟件對各實驗結(jié)果數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，各實驗均獨立重復3次統(tǒng)計結(jié)果，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，多組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 Western blot檢測rIL-12與人乳腺癌細胞中LC3蛋白的表達關(guān)系? Western blot結(jié)果顯示，rIL-12能夠增加人乳腺癌細胞中LC3蛋白表達，經(jīng)rIL-12組的乳腺癌細胞相對空白組中的自噬標記蛋白LC3表達增加，特別是LC3Ⅱ的表達，且呈時間和劑量的依賴性，見圖1A、1B。

2.2 免疫熒光檢測rIL-12與人乳腺癌細胞中LC3蛋白表達關(guān)系? 免疫熒光結(jié)果顯示，rIL-12能夠增加人乳腺癌細胞中LC3蛋白表達與空白組相比，陽性對照組和rIL-12組LC3Ⅱ蛋白的表達增加，在顯微鏡下表現(xiàn)，rIL-12組的細胞核周圍聚集的顆粒狀綠色熒光增加，見圖2。

2.3 rIL-12與乳腺癌細胞自噬小體形成的關(guān)系? 透射電子顯微鏡結(jié)果顯示，rIL-12能夠增加人乳腺癌細胞自噬小體形成，經(jīng)rIL-12處理后的乳腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)許多自噬小體（黑色箭頭），空白對照組乳腺癌細胞不易找到自噬小體，見圖3。

2.4 rIL-12通過抑制Akt通路誘導乳腺癌細胞自噬 Western blot和免疫熒光結(jié)果顯示，與rIL-12組相比，IGF-1+rIL-12組的p-PI3K/Akt增加，p-mTOR表達也增加， LC3Ⅱ表達明顯減少，見圖4、圖5。說明Akt的活化能夠抑制rIL-12誘導乳腺癌細胞? ?p-mTOR，從而抑制LC3特別是LC3Ⅱ表達的能力，提示rIL-12能通過抑制PI3K/Akt來抑制下游的mTOR磷酸化來誘導乳腺癌細胞的自噬。

（29）：3303-3308.

[15]Ma TT，Wu BT，Lin Y，et al.IL-12 could induce monocytic tumor cells directional differentiation[J].Mol Cell Biochem，2015（402）：157-169.

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收稿日期：2019-9-2;修回日期：2019-9-14

編輯/肖婷婷