mRNA的N6-甲基腺嘌呤研究進(jìn)展

，， ，林嵩，

(河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453007)

真核生物RNA中已發(fā)現(xiàn)的化學(xué)修飾約150種，主要發(fā)生在tRNA、rRNA及其他非編碼RNA上，這些修飾能夠參與真核生物基因表達(dá)的調(diào)控。真核生物mRNA中也存在多種化學(xué)修飾，如5′端帽子N7-甲基鳥嘌呤(N7-methylguanosine，N7-G)、N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)、N1-甲基腺嘌呤(N1-methyladenosine，m1A)、5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，m5C)、假尿嘧啶核苷(ψ)和2′-O-甲基化修飾(2′-O-methylation)等，其中m6A是mRNA中最常見的一種修飾[1]。m6A修飾廣泛存在于哺乳動(dòng)物和植物的mRNA中[2]，但由于缺乏m6A特異堿基的檢測技術(shù)，其研究較為緩慢，m6A修飾在生物體內(nèi)的具體功能也不清楚。隨著m6A免疫共沉淀高通量測序(MeRIP-seq)技術(shù)的應(yīng)用，m6A的全轉(zhuǎn)錄組水平已在多種生物體內(nèi)被檢測，引起了諸多學(xué)者對(duì)m6A分布特征、甲基化和去甲基化動(dòng)態(tài)調(diào)控以及m6A識(shí)別的關(guān)注，并開展了大量的研究工作，m6A的重要生物學(xué)功能也逐漸被人們所認(rèn)識(shí)?；诖?，綜述了近年來動(dòng)物和植物中關(guān)于m6A的研究進(jìn)展，包括m6A的分布特征、動(dòng)態(tài)調(diào)控、m6A的識(shí)別和對(duì)mRNA的調(diào)控等，以期全面理解m6A修飾在真核基因表達(dá)調(diào)控和生物體生長發(fā)育中的重要作用。

1 m6A修飾的分布特征

目前，采用MeRIP-seq技術(shù)已獲得了酵母、人、鼠、擬南芥和水稻的m6A修飾圖譜，結(jié)果顯示，m6A在真核生物mRNA中的分布具有一定的保守性，主要集中在mRNA的終止密碼子附近和3′非編碼區(qū)(UTR)，并且存在一致的(G/A)(G/A)AC(A/C/U)甲基化靶序列[3-8]。除3′UTR，m6A在mRNA內(nèi)含子中也存在，表明轉(zhuǎn)錄和甲基化修飾可能同時(shí)進(jìn)行[9]。植物和動(dòng)物中m6A在mRNA上的分布存在一定的差異，如擬南芥和水稻中m6A修飾除在3′端富集外，也在mRNA5′端翻譯起始位點(diǎn)附近富集[3,5]；哺乳動(dòng)物mRNA中m6A修飾常存在于長外顯子內(nèi)，而擬南芥和水稻不具有這一特性[3,7]。哺乳動(dòng)物大約1/3的轉(zhuǎn)錄本中可以檢測到m6A修飾，每個(gè)轉(zhuǎn)錄本中m6A修飾位點(diǎn)數(shù)目也不盡相同，大多數(shù)轉(zhuǎn)錄本僅存在1～2個(gè)m6A修飾位點(diǎn)，而少數(shù)基因則有多個(gè)修飾位點(diǎn)[7-8]。植物轉(zhuǎn)錄組中m6A修飾高達(dá)50%，甚至76%[3-5]。

m6A修飾在生物體內(nèi)的分布具有一定的組織特異性，如，哺乳動(dòng)物中m6A在肝臟、腎臟及大腦中的含量明顯高于其他組織[9]；擬南芥的花苞中經(jīng)m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本比例明顯高于根和葉片[4]；水稻的愈傷組織和葉片中m6A修飾圖譜也存在明顯差異[5]。這一組織特異性表明，m6A修飾在生物體組織器官的發(fā)育和分化中發(fā)揮一定的功能。

2 m6A甲基化的動(dòng)態(tài)調(diào)控

已知DNA和組蛋白存在甲基化/去甲基化動(dòng)態(tài)可逆修飾過程，從而影響基因表達(dá)和蛋白質(zhì)功能等重要生命過程，現(xiàn)已證明m6A甲基化修飾也是一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的過程，由甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶共同調(diào)控這一過程[10-11]。人們形象地將m6A的甲基轉(zhuǎn)移酶稱為編碼器(Writer)，將去甲基化酶稱為消碼器(Eraser)[1]。

2.1 m6A的編碼器

RNA中m6A甲基化由復(fù)雜的蛋白質(zhì)復(fù)合體介導(dǎo)完成。METTL3(又稱MTA-70)是第1個(gè)被鑒定的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體成員，首先在HeLa細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[10]，隨后其同源基因在釀酒酵母、果蠅和擬南芥中被報(bào)道[12]。METTL14是m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體中的另一個(gè)核心成員，與METTL3高度同源，可與METTL3發(fā)生互作[12]。在體外METTL3和METTL14形成的異源二聚體比其單個(gè)具有更高的甲基轉(zhuǎn)移酶活性，表明兩者可能協(xié)同發(fā)揮甲基化作用[13-14]。研究表明，METTL3具有S-腺苷甲硫氨酸依賴的RNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性，而METTL14主要負(fù)責(zé)結(jié)合RNA底物[15]。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體中的第3個(gè)關(guān)鍵組分是WTAP，在體外它并不影響METTL3/METTL14的甲基轉(zhuǎn)移酶活性，但是WTAP缺失可明顯降低細(xì)胞內(nèi)m6A水平[16-17]。WTAP被認(rèn)為是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的調(diào)節(jié)亞基，負(fù)責(zé)招募m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體其他成分結(jié)合到目標(biāo)RNA上[17]。KIAA1429和RBM15(或RBM15B)是新發(fā)現(xiàn)的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的成分。KIAA1429是哺乳動(dòng)物m6A甲基化所必需的，主要參與mRNA的3′UTR和終止密碼子的甲基化，KIAA1429沉默可降低m6A水平[18]。在人的胚胎腎細(xì)胞中，敲低RBM15和RBM15B可降低m6A水平，破壞XIST介導(dǎo)的基因沉默[19]。免疫共沉淀分析顯示，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)RBM15和RBM15B可與METTL3互作，并且這一互作依賴WTAP蛋白[20]。最近，另一種m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL16在人體細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，主要負(fù)責(zé)U6 snRNA和MAT2A mRNA的甲基化[15]。

近年來，模式植物擬南芥中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的幾個(gè)亞基也已被鑒定。其中，與人的METTL3同源的蛋白質(zhì)為MTA(At4g10760)，其等位基因無效突變可引起擬南芥植株胚胎致死[4]。在胚胎特異表達(dá)基因ABI3啟動(dòng)子作用下表達(dá)MTA可回補(bǔ)mta突變體的致死效應(yīng)，植物可開花結(jié)實(shí)[21]。擬南芥mta突變體中m6A水平僅為野生型的5%～15%，表明該酶是mRNA m6A甲基化所必需的[21]。擬南芥中與人的METTL14同源蛋白質(zhì)為MTB，mtb突變體的表型與mta類似，如生長延緩、頂端分生組織異常、根生長抑制和向地性異常，這些表型均與m6A水平的降低有關(guān)[22]。擬南芥中FIP37蛋白與人的WTAP同源，可與MTA發(fā)生互作，F(xiàn)IP37突變可引起胚致死和發(fā)育受阻，過表達(dá)FIP37可增加植物毛狀體的分枝[21,23]。MTA和FIP37主要定位于細(xì)胞核，表明m6A修飾主要發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)[4,23]。

2.2 m6A的消碼器

m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5的發(fā)現(xiàn)揭示了mRNA中m6A甲基化是一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的過程。FTO和ALKBH5均屬于AlkB家族，是一類雙加氧酶，盡管兩者均可結(jié)合單鏈RNA使m6A去甲基化，但它們的反應(yīng)途徑并不相同，主要的組織定位也不相同。ALKBH5可直接將m6A轉(zhuǎn)變?yōu)锳，F(xiàn)TO則需要催化生成2個(gè)中間物hm6A和fm6A之后才使m6A去甲基化[11]。ALKBH5主要在哺乳動(dòng)物的睪丸中表達(dá)，參與精子的形成；FTO主要在腦組織中表達(dá)，尤其是神經(jīng)組織中[24]。最近研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO主要使mRNA的1號(hào)和2號(hào)帽子上的m6A脫去甲基[25]。過表達(dá)FTO或ALKBH5的細(xì)胞中m6A水平下降，但是敲低FTO和ALKBH5或敲除兩者之一時(shí)，m6A的水平僅略微增加，表明尚有未知的其他去甲基化酶存在，它們可能與FTO和ALKBH5協(xié)同作用[26]。

擬南芥基因組可編碼13個(gè)AlkB家族蛋白質(zhì)，其中ALKBH9B和ALKBH10B與人的ALKBH5同源，均有m6A去甲基化酶活性[27-28]。敲低ALKBH9B可降低病毒對(duì)植物的入侵，但m6A修飾在宿主和病原體互作中的作用機(jī)制目前還不清楚[27]。擬南芥alkbh10b缺失突變體表現(xiàn)為開花延遲和生長受到抑制，反之，過表達(dá)ALKBH10B的擬南芥植株出現(xiàn)早花的表型[28]，表明m6A可逆甲基化修飾參與植物的花期控制。

3 m6A的讀碼器

與DNA和組蛋白的甲基化相似，m6A修飾的RNA可被特異蛋白質(zhì)或讀碼器(Reader)識(shí)別，從而將信息傳遞給下游的應(yīng)答因子。以甲基化的RNA作為探針誘餌，在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)m6A結(jié)合蛋白，如YTHDF2和YTHDF3[8]。隨后其他YTH家族蛋白質(zhì)包括YTHDF1、YTHDC1和YTHDC2也被鑒定[29-30]。生化結(jié)構(gòu)分析表明，YTH家族蛋白質(zhì)在C端具有保守的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域內(nèi)由幾個(gè)色氨酸和酪氨酸殘基構(gòu)成的芳香環(huán)可識(shí)別m6A[30-31]。通常，YTHDF1/2被認(rèn)為是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)m6A讀碼器，YTHDC1為細(xì)胞核內(nèi)m6A讀碼器。最近，研究發(fā)現(xiàn)了一種不含YTH結(jié)構(gòu)域的m6A讀碼器IGF2BP1/2/3，可以提高mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率[32]。

擬南芥有13個(gè)含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，包括ECT1—12和CPSF30。SCUTENAIRE等[22]對(duì)植物中含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)YTH結(jié)構(gòu)域均有1個(gè)典型的芳香環(huán)，因而有一個(gè)疏水空穴可以容納并識(shí)別m6A。與動(dòng)物不同的是，植物中YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)并非完全功能冗余，它們與m6A有不同的親和能力[21]。ECT2是新被鑒定的擬南芥中m6A讀碼器，屬于YTH家族蛋白質(zhì)，主要在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，負(fù)責(zé)識(shí)別3′非編碼區(qū)的m6A，具有植物特有的m6A識(shí)別靶序列UGUA[33]。與野生型擬南芥相比，ect2突變體的毛狀體分枝明顯增加[21,33]。與動(dòng)物中YTHDF2蛋白促進(jìn)mRNA降解不同，ECT2提高細(xì)胞質(zhì)中mRNA的穩(wěn)定性[33]。隨后發(fā)現(xiàn)，ECT3在擬南芥中也有較高的表達(dá)量，并與ECT2共同參與了植物毛狀體的早期發(fā)育過程，ect2ect3雙突變體出現(xiàn)新的表型，延遲第一片真葉的出現(xiàn)[33]。ECT2的同源基因ECT4缺失的突變體第一真葉延遲出現(xiàn)的表型更加明顯，表明ECT2、ECT3和ECT4對(duì)維持植物正常的葉片形態(tài)較為重要[33]。

4 m6A修飾對(duì)mRNA的調(diào)控

2012—2016年，隨著全轉(zhuǎn)錄組水平m6A檢測技術(shù)的發(fā)展，m6A修飾在許多細(xì)胞活動(dòng)中的功能研究取得突破。早期的研究預(yù)測到m6A修飾在轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控作用，可能參與mRNA的剪切加工、轉(zhuǎn)運(yùn)及儲(chǔ)存，甚至影響從mRNA到蛋白質(zhì)的翻譯過程。

4.1 m6A修飾對(duì)mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控

多個(gè)研究證實(shí)，m6A修飾可以降低mRNA穩(wěn)定性[7,12,34]。敲低小鼠胚胎干細(xì)胞中的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶基因METTL3或METTL14，m6A水平降低，同時(shí)靶向mRNA穩(wěn)定性增加[15,34]。但是DOMINISSINI等[7]比較了非靶向siRNA對(duì)照和敲低METTL3的細(xì)胞中m6A修飾的mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)m6A可增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性，可能由于m6A是mRNA正確拼接需要的。另一個(gè)研究表明，讀碼器YTHDF2可結(jié)合m6A，并將結(jié)合的mRNA由翻譯裝置運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)處理小體(P-bodies)，促進(jìn)mRNA的降解[35]。ZHANG等[36]研究發(fā)現(xiàn)，m6A通過YTHDF2介導(dǎo)Notch1ɑmRNA的穩(wěn)定性，以維持內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化(EHT)過程中內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞基因表達(dá)的平衡，進(jìn)而調(diào)控造血干細(xì)胞的命運(yùn)決定。體外研究表明，m6A可能通過阻止mRNA穩(wěn)定因子HuR(Human anigen R)與mRNA的結(jié)合，降低mRNA的穩(wěn)定性[12]。

m6A修飾對(duì)植物mRNA穩(wěn)定性的影響尚無定論。LUO等[3]發(fā)現(xiàn)，m6A修飾水平與mRNA的豐度存在正相關(guān)；而WAN等[4]發(fā)現(xiàn)，擬南芥不同組織中m6A修飾水平與mRNA的豐度存在負(fù)相關(guān)，間接說明了m6A修飾可降低mRNA穩(wěn)定性。最近的研究表明，擬南芥中m6A的讀碼器ECT2可提高細(xì)胞質(zhì)中mRNA的穩(wěn)定性，推測ECT2可能參與m6A介導(dǎo)的3′非編碼區(qū)的可變多聚腺苷酸化[33]。

4.2 m6A修飾對(duì)mRNA拼接的調(diào)控

早期的研究發(fā)現(xiàn)，mRNA前體平均含4個(gè)m6A位點(diǎn)，而成熟的mRNA平均只有2個(gè)位點(diǎn)，表明m6A修飾可能主要發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，內(nèi)含子的剪切導(dǎo)致成熟mRNA中m6A修飾的減少[37]；應(yīng)用PAR-CLIP技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，METTL3的結(jié)合位點(diǎn)主要是在內(nèi)含子內(nèi)[17]；在能產(chǎn)生多個(gè)轉(zhuǎn)錄本的基因中，METTL3的結(jié)合位點(diǎn)和m6A修飾位點(diǎn)明顯高于只有1個(gè)轉(zhuǎn)錄本的基因，表明m6A修飾與mRNA拼接及可變剪切關(guān)系密切[17]。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體METTL3/METTL14/WTAP、去甲基化酶FTO和ALKBH5及m6A讀碼器YTHDF2和YTHDC1主要定位或部分定位于mRNA前體拼接的主要亞核結(jié)構(gòu)——核斑點(diǎn)(Nuclear speckles)[38]，表明m6A在mRNA拼接中可能發(fā)揮調(diào)控作用。敲低METTL3或WTAP會(huì)產(chǎn)生不同的mRNA轉(zhuǎn)錄本，且現(xiàn)已知WTAP是一種拼接因子[16,39]。動(dòng)物中，ALKBH5可影響拼接效率[24]。RNA結(jié)合蛋白HNRNPC負(fù)責(zé)mRNA前體加工和可變剪切，最近研究表明，m6A介導(dǎo)的mRNA結(jié)構(gòu)重排可影響HNRNPC與mRNA的結(jié)合[39]，且mRNA的這種結(jié)構(gòu)重排常常在外顯子附近調(diào)控拼接。在敲除FTO的3T3-L1前脂肪細(xì)胞中，伴隨5′和3′側(cè)翼區(qū)m6A水平的增加，RNA結(jié)合拼接因子SRSF2的能力增加，其靶向外顯子的概率增加[40]。體外試驗(yàn)表明，mRNA前體的拼接因子SRSF3和SRSF10可競爭性地與核讀碼器YTHDC1結(jié)合，而在體內(nèi)YTHDC1可通過促進(jìn)SRSF3、抑制SRSF10在核斑點(diǎn)的定位及與pre-RNA的結(jié)合參與調(diào)控mRNA的拼接[30]。

4.3 m6A修飾對(duì)mRNA翻譯的調(diào)控

mRNA是蛋白質(zhì)合成的直接模板，m6A在起始密碼子、外顯子和終止密碼子附近的富集表明，其可能參與蛋白質(zhì)翻譯的調(diào)控。最近研究表明，m6A讀碼器YTHDF1可與蛋白質(zhì)合成起始因子eIF3互作，提高經(jīng)m6A修飾的mRNA的翻譯效率[33]。隨后研究顯示，細(xì)胞受到脅迫如熱休克時(shí)mRNA 5′UTR的m6A修飾增多并伴隨著翻譯效率的提高[41]。另一研究表明，METTL3可通過直接與翻譯起始因子eIF3互作促進(jìn)mRNA的翻譯，而不依賴METTL3甲基轉(zhuǎn)移酶活性或與YTHDF1或YTHDF2的結(jié)合[42]。但是最近一些體外翻譯和報(bào)告基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究表明，腺苷甲基化會(huì)導(dǎo)致翻譯效率降低[43]。盡管m6A修飾不影響堿基配對(duì)，CHOI等[44]利用大腸桿菌核糖體系統(tǒng)并結(jié)合生化、結(jié)構(gòu)和單分子的方法研究m6A修飾在mRNA/tRNA互作時(shí)發(fā)現(xiàn)，m6A修飾可干擾tRNA的選擇和翻譯的延伸，且這種干擾依賴密碼子內(nèi)m6A修飾所在的位置及密碼子的序列，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的翻譯。因此，m6A對(duì)不同mRNA翻譯的影響可能有所不同。

5 展望

目前，多個(gè)物種的m6A全轉(zhuǎn)錄組圖譜已被揭示，但要進(jìn)行精確定位和定量分析仍需位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄圖譜，而測序技術(shù)仍需不斷探索改進(jìn)。近年來，動(dòng)物中參與m6A修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的組分陸續(xù)被鑒定，但m6A編輯復(fù)合體的確切組成、調(diào)控和保守性尚未完全研究清楚。此外，研究表明，并非所有的mRNA均發(fā)生甲基化，且并非所有潛在的共有靶序列均發(fā)生甲基化，m6A選擇性的機(jī)制及調(diào)控基礎(chǔ)目前還不清楚。動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶主要有FTO和ALKBH5，但研究表明可能還有其他去甲基化酶的存在，有待進(jìn)一步鑒定。m6A的讀碼器主要是一類含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，該類蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物中已被發(fā)現(xiàn)5個(gè)，此外新發(fā)現(xiàn)的不含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)IGF2BP1/2/3也可結(jié)合m6A，因此可能還有其他的含有YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)或不含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)能夠結(jié)合識(shí)別m6A，這有待證實(shí)。與動(dòng)物相比，植物mRNA中m6A修飾研究還僅僅處于一個(gè)起始階段，m6A修飾僅在擬南芥和水稻中被報(bào)道，植物mRNA中m6A修飾的分布特點(diǎn)、甲基轉(zhuǎn)移酶的組分、去甲基化酶及識(shí)別蛋白均需進(jìn)行大量研究。

已知m6A修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的過程，什么情況下m6A修飾受動(dòng)態(tài)調(diào)控;在生物體的不同發(fā)育階段或者病理、逆境脅迫下，基因表達(dá)的調(diào)控是否依賴于甲基化的轉(zhuǎn)錄本;從整個(gè)表觀遺傳學(xué)角度看，RNA修飾如何與DNA甲基化、組蛋白修飾協(xié)同作用調(diào)控基因的表達(dá)，都有待于進(jìn)一步探討。