憂遁草莖段懸浮培養(yǎng)快繁體系的建立

，興斌，

(大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034)

憂遁草(Clinacanthusnutans)，又稱鱷嘴花、沙巴蛇草等，為爵床科鱷嘴花屬植物[1]，廣泛分布在馬來西亞、印度尼西亞以及我國海南、廣東等地，主要生長環(huán)境以低海拔亞熱帶疏林或灌叢為主。近年來，由于憂遁草在抗腫瘤方面的醫(yī)療價值，以及被列入新資源食品原料目錄的原因，人們對憂遁草的需求急劇增加，僅靠野生資源很難滿足藥食兩用的市場供應[2-5]。

目前，市場上的憂遁草供應以野生資源為主，大田栽培為輔。大田栽培方式存在著與農(nóng)業(yè)爭地、重毒副殘留、季節(jié)和氣候限制以及勞動量大等突出問題。因此，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，規(guī)模化生產(chǎn)憂遁草種苗作為野生或栽培憂遁草的補充和替代品具有一定的意義。但是，傳統(tǒng)植物組織培養(yǎng)方式存在著成本高、勞動量大等瓶頸因素，因此，發(fā)展新型植物組培技術(shù)、降低組培苗的生產(chǎn)成本，將大大促進包括憂遁草在內(nèi)的植物組培技術(shù)的商業(yè)化[6]。液體培養(yǎng)方式具有增殖系數(shù)高、勞動量小、有利于自動化控制等優(yōu)點，可以短時間培養(yǎng)大量的組培苗用以滿足市場的需求[7]。鑒于此，初步優(yōu)化了憂遁草莖段液體培養(yǎng)的條件，在無菌苗固體培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立無菌苗液體高效繁殖體系，為基于生物反應器的憂遁草無菌苗規(guī)模化培養(yǎng)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

大連工業(yè)大學珍稀瀕危藥用植物細胞工程實驗室以馬來西亞憂遁草為材料，制備出無菌苗并繼代保存，作為本研究的試驗材料。

選取生長健壯的馬來西亞憂遁草實生苗莖段，去除葉片，切成5～6 cm長的莖段，每段保留多個節(jié)點，經(jīng)75%乙醇處理30 s、無菌水沖洗2次、10%次氯酸鈉浸泡、無菌水沖洗2次、0.1%氯化亞汞(添加5～6滴吐溫-20)10 min、無菌水清洗4次后，將莖段用無菌濾紙吸干表面水分，然后將莖段切成1～2 cm的莖段，每段需有1個節(jié)點，用鑷子將莖段接種于培養(yǎng)基中，每瓶接入3個莖段，在25 ℃和光照強度1 500 lx(12 h/d)下培養(yǎng)30 d，得到憂遁草無菌苗，作為后續(xù)建立液體培養(yǎng)的試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 植物生長調(diào)節(jié)劑的篩選 采用L9(34)正交表設(shè)計正交試驗，以IBA、6-BA、NAA和KT作為4個因素，每個因素設(shè)置3個水平(表1)，不考慮各因素之間的交互作用。將1～2 cm帶芽的無菌莖段，分別接種到含有不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合的液體培養(yǎng)基中(MS+蔗糖30 g/L，pH值6.0)，每組試驗20瓶，重復3次。將接種后的培養(yǎng)基置于25 ℃和1 500 lx(12 h/d)的培養(yǎng)室中培養(yǎng)30 d，觀察憂遁草芽發(fā)生及生長狀態(tài)，測定無菌苗莖高和根長，統(tǒng)計根數(shù)。

1.2.2 培養(yǎng)基類型的篩選 采用單因素試驗法設(shè)計試驗。選取1～2 cm帶芽的無菌莖段，分別接種到MS、1/2MS、B5、1/2B5和N6等5種液體培養(yǎng)基(IBA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L+KT 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L，pH值6.0)中，其余步驟及參數(shù)分析同1.2.1。

表1 液體培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑及其質(zhì)量濃度配比設(shè)置Tab.1 Experimental design of plant growth regulator and mass concontration combination in liquid medium

1.2.3 培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量濃度的篩選 采用單因素試驗法設(shè)計試驗。選取1～2 cm長的帶芽無菌莖段，分別接種到含有0、10、20、30、40、50 g/L蔗糖的1/2MS液體培養(yǎng)基(IBA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L+KT 0.2 mg/L，pH值6.0)中，其余步驟及參數(shù)分析同1.2.1。

表2 液體培養(yǎng)基中值設(shè)置Tab.2 Experimental design of ratio in liquid medium

1.2.5 培養(yǎng)基中磷源濃度的篩選 采用單因素試驗法設(shè)計試驗。選取1～2 cm長的帶芽無菌莖段，分別接種到含有0、0.2、0.625、1.5、3、5 mmol/L磷酸根離子的1/2MS液體培養(yǎng)基(IBA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L+KT 0.2 mg/L+蔗糖20 g/L，pH值6.0)中，其余步驟及參數(shù)分析同1.2.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長調(diào)節(jié)劑及其質(zhì)量濃度對液體培養(yǎng)下憂遁草莖段懸浮生長的影響

如表3所示，6-BA能夠促進腋芽增殖，IBA和NAA共同作用誘導根的生成；同時，NAA也有促進憂遁草生長的作用。以莖高作為評價指標，極差分析結(jié)果表明，組合7培養(yǎng)基中憂遁草的莖高最大，達到11.37 cm，即最優(yōu)組合為IBA 1.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L+KT 0.2 mg/L；以憂遁草生根數(shù)作為評價指標，組合9的根數(shù)最多，為3.55個，即最優(yōu)組合為IBA 1.5 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 0.1 mg/L；以根的長度作為評價指標，組合6中憂遁草的根長最長，達5.98 cm，即最優(yōu)組合為IBA 1.0 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 0.2 mg/L。本試驗以憂遁草莖高為主要指標，最終確定憂遁草液體培養(yǎng)的最優(yōu)組合為IBA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L+KT 0.2 mg/L。

表3 植物生長調(diào)節(jié)劑及其質(zhì)量濃度對液體培養(yǎng)下憂遁草莖段懸浮生長的影響Tab.3 Effects of plant growth regulators and its mass concentration on suspension growth of Clinacanthus nutans segments in liquid culture

2.2 培養(yǎng)基類型對液體培養(yǎng)下憂遁草莖段懸浮生長的影響

從圖1可以看出，1/2MS液體培養(yǎng)基表現(xiàn)最優(yōu)，其莖高為11.83 cm，根數(shù)為3.59 個，根長為5.73 cm，葉片展開充分,葉色翠綠,莖粗壯,根系發(fā)達,根毛茂密；其次是1/2B5培養(yǎng)基，但葉片有枯黃脫落現(xiàn)象；MS和B5培養(yǎng)基中，根系較少、短而粗，但植株表現(xiàn)健壯；N6培養(yǎng)基中的憂遁草生長狀態(tài)最差，植株低矮，葉片短、窄小，根部褐化嚴重。

2.3 蔗糖質(zhì)量濃度對液體培養(yǎng)下憂遁草莖段懸浮生長的影響

由圖2可知，當蔗糖質(zhì)量濃度為20 g/L時，莖高最大，為11.83 cm，其植株葉片生長充分、葉色翠綠，根莖粗壯；隨著質(zhì)量濃度繼續(xù)增大，蔗糖反而抑制植株的生長，表現(xiàn)為憂遁草植株開始變得矮小，部分產(chǎn)生褐化現(xiàn)象；與植株莖生長表現(xiàn)相反，當質(zhì)量濃度達到40 g/L時，蔗糖植株的生根數(shù)及根長均達到最大，生根數(shù)為4.28個，根長為5.23 cm；但如果蔗糖質(zhì)量濃度再升高，3種指標反而下降。總之，隨著質(zhì)量濃度的增大，蔗糖對憂遁草的生長呈現(xiàn)先促進后抑制的趨勢。由此可以發(fā)現(xiàn)，在液體培養(yǎng)條件下，憂遁草莖段的生長，首先以根的生長發(fā)育為主，其次是莖葉的生長，由于高質(zhì)量濃度(40 g/L)的蔗糖促進了根的生長，相對于莖葉的發(fā)育存在一定的抑制作用；當質(zhì)量濃度過高(50 g/L)時，蔗糖對憂遁草的整體發(fā)育都存在抑制作用。綜合考慮，液體培養(yǎng)過程中，憂遁草生長的最佳蔗糖質(zhì)量濃度為20 g/L。

圖1 培養(yǎng)基類型對液體培養(yǎng)下憂遁草莖段懸浮生長的影響Fig.1 Effect of liquid medium type on suspension growth of Clinacanthus nutans segments in liquid culture

圖2 蔗糖質(zhì)量濃度對液體培養(yǎng)下憂遁草莖段懸浮生長的影響Fig.2 Effect of sucrose mass concentration on suspension growth of Clinacanthus nutans segments in liquid culture

圖值對液體培養(yǎng)下憂遁草莖段懸浮生長的影響Fig.3 Effects of ratio on the suspension growth of Clinacanthus nutans segments in liquid culture

2.5 磷源對液體培養(yǎng)下憂遁草莖段懸浮生長的影響

由圖4可知，隨著磷酸根離子濃度的增大，液體條件下憂遁草各指標的生長呈現(xiàn)先揚后抑的現(xiàn)象。當磷酸根離子濃度為1.5 mmol/L時，莖高為11.63 cm，根數(shù)為4.96 個，根長為5.27 cm。該處理植株的葉片展開充分，葉色翠綠，莖粗壯，根部發(fā)達，主根粗壯，根毛較多，為最佳處理。

圖濃度對液體培養(yǎng)下憂遁草莖段懸浮生長的影響Fig.4 Effect of concentration on suspension growth of Clinacanthus nutans segments in liquid culture

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基類型、蔗糖濃度、氮元素形態(tài)、磷元素等參數(shù)影響液體培養(yǎng)條件下憂遁草的生長，通過優(yōu)化這些參數(shù)可以改善憂遁草的生長狀態(tài)。最佳培養(yǎng)條件為：改良的1/2MS培養(yǎng)基(20 mmol/L KNO3+5 mmol/L NH4NO3+1.5 mmol/L KH2PO4)+IBA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L+KT 0.2 mg/L+蔗糖20 g/L，pH值6.0，其生根數(shù)為4.09 個，根長為5.47 cm，莖高為11.79 cm。

利用懸浮培養(yǎng)方式進行植株無菌苗的繁殖，具有操作環(huán)節(jié)少、勞動量低、單位時間和空間內(nèi)繁殖系數(shù)高等優(yōu)點。通過莖段繁育的無菌苗比體細胞胚分化的無菌苗健壯、成苗率高。在本研究中，采用改良的液體1/2MS培養(yǎng)基和優(yōu)化的植物生長調(diào)節(jié)劑配比培養(yǎng)的憂遁草無菌植株健壯，葉色深綠，葉片展開充分。與憂遁草的傳統(tǒng)固體培養(yǎng)相比，培養(yǎng)基中不需要加入瓊脂，接種簡便，不僅節(jié)省成本，而且繁殖系數(shù)高于固體培養(yǎng)。在憂遁草懸浮培養(yǎng)過程中，可以隨時續(xù)加培養(yǎng)基和調(diào)整植物生長調(diào)節(jié)劑配比，保證憂遁草無菌苗始終處于旺盛的生長狀態(tài)。另外，以懸浮培養(yǎng)方式獲得的憂遁草無菌苗，不但可以為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供種苗，還可以直接食用或者入藥，而且無“重毒副”殘留。