食品中黃曲霉毒素檢測技術的研究進展

史春悅

（天津市南開區(qū)教育后勤服務中心，天津 300190）

黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFs） 主要是由黃曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉 （Aspergillus paraciticus）產生的次級代謝產物[1]。這類真菌在自然界中，尤其是在高溫高濕的熱帶和亞熱帶地區(qū)分布廣泛、污染范圍廣，谷物、豆類、堅果、油脂、調味品、乳制品等易受其污染[2]。

已知的黃曲霉毒素有20多種，在自然條件下產生的黃曲霉毒素主要包括AFB1，AFB2，AFG1和AFG2[3]。根據其在紫外照射下產生的熒光顏色不同，主要分為黃曲霉毒素B（Blue） 與黃曲霉毒素G（Green）。B族黃曲霉毒素包括黃曲霉毒素B1（AFB1）和黃曲霉毒素B2（AFB2），在紫外照射下呈現(xiàn)藍色熒光，主要由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產生；G族黃曲霉毒素包括黃曲霉毒素G1（AFG1）和黃曲霉毒素G2（AFG2），在紫外照射下呈現(xiàn)綠色熒光，主要由黃曲霉菌產生[4-5]。AFM1由AFB1通過體內代謝產生，泌乳動物食用受AFB1污染的食物或飼料后由乳汁或尿液進行分泌[6]。

黃曲霉毒素具有強致癌性和毒性，世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機構已將其列為I類致癌物。黃曲霉毒素結構類似物的基本結構均有1個氧雜萘鄰酮（香豆素）和1個雙呋喃環(huán)，致癌性主要與香豆素結構有關，毒性主要與二呋喃環(huán)結構有關，其中以AFB1最為常見且毒性最強。我國GB/T 2761—2017國家標準規(guī)定了食品中真菌毒素的限量，分別規(guī)定了谷物、豆類、堅果及其制品等產品中AFB1的限量，限量為0.5～20.0 μg/kg，規(guī)定乳及乳制品中 AFM1的限量為0.5 μg/kg。我國 GB/T 5009.22—2016國家標準規(guī)定了食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定方法，主要包括同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質譜法、高效液相色譜-柱前衍生法、高效液相色譜-柱后衍生法、酶聯(lián)免疫吸附篩查法、薄層色譜法。目前，用于檢測黃曲霉毒素含量的技術基于原理不同，大體上可以分為基于色譜分離、熒光檢測或質譜檢測原理的大型儀器檢測技術和基于免疫學原理的快速檢測技術[7]。

1 儀器分析法

用于黃曲霉毒素檢測的儀器法分析法主要包括高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、超高效液相色譜法（Ultra HP-LC，UHPLC）、液相色譜與質譜聯(lián)用法（HPLC-tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）、氣相色譜與質譜聯(lián)用法（GC-tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS） 等。

通常使用紫外或熒光檢測器配合HPLC進行檢測。Campos W E O 等人[8]對堅果中 AFB1，AFB2，AFG1和AFG2進行檢測，樣品經甲醇提取、免疫親和柱凈化、高效液相色譜熒光檢測及柱后衍生化進行定量檢測。Fu Z等人[9]利用UHPLC-UV法對玉米和花生中的黃曲霉毒素，對AFB1，AFB2，AFG1，AFG2的最低檢出限分別為0.32，0.19，0.32，0.19 μg/kg。

液相或氣相色譜與質譜聯(lián)用適用于對同一樣本中多種待測物質同時進行定量檢測，具有較高的靈敏度。Lattanzio V M T等人[10]利用HPLC-MS/MS對谷物中包括AFB1，AFB2，AFG1和AFG2在內的多種真菌毒素同時進行定量檢測。Vaclavik L等人[11]利用UHPLC-MS/MS對咖啡豆中34種真菌毒素同時檢測。

儀器分析法靈敏度高，能夠進行精確的定量檢測，可進行自動進樣，從而實現(xiàn)自動化檢測，但由于存在樣本前處理復雜、試驗儀器昂貴等問題，難以對大量樣本進行快速檢測。

2 免疫學檢測方法

免疫學檢測方法基于抗原抗體的特異性反應，檢測結果可以通過視覺判斷或者酶標儀讀數，能夠對真菌毒素進行定性或定量檢測。該方法具有高特異性、高靈敏性、便于攜帶、操作簡單等特點，可以用于真菌毒素的現(xiàn)場快速檢測。

2.1 酶聯(lián)免疫分析方法

酶聯(lián)免疫分析方法（ELISA）的原理基于抗體、抗原之間的特異性反應及酶的高效催化作用。由于真菌毒素屬于小分子半抗原，通常采用競爭反應模式。用于標記的酶通常是辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶[12]。競爭法分為直接競爭法和間接競爭法。Lawellin D W等人[13]通過采用辣根過氧化物酶來標記AFB1半抗原，利用直接競爭ELISA法對玉米中AFB1進行檢測，檢出限為10 pg/mL。Zhang Q[14]利用間接競爭ELISA法，對檢測乳制品中AFM1進行檢測，檢出限達3 ng/L，回收率為91%～110%。Li P等人[15]利用單克隆抗體10C9建立的ELISA方法，對花生中黃曲霉毒素總量進行檢測，回收率為87.5%～102.0%，能夠實現(xiàn)花生樣品中黃曲霉總量的快速檢測。

ELISA檢測方法簡單易操作，具有高特異、高靈敏等特性，可對批量樣本中的黃曲霉毒素進行快速檢測，在農產品食品安全檢測領域已有廣泛應用。但在實際檢測中可能會出現(xiàn)重復性差、假陽性率高等情況，樣品中的氧化酶、蛋白酶等也可能會對檢測結果造成影響。

2.2 免疫親和檢測技術

免疫親和技術 （Immunoaffinity Column，IAC）的原理基于免疫化學反應，通過對待測物質進行凈化和濃縮，去除樣品基質干擾，采用高效液相色譜儀、熒光分光光度儀或ELISA進行檢測，可以提高檢 測靈敏度和準確度。免疫親和柱聯(lián)合色譜分析法（IAC-HPLC）將免疫分析方法的快捷、特異性與儀器分析方法的精確性等優(yōu)點結合起來，比傳統(tǒng)的HPLC更穩(wěn)定、可靠，目前已成為黃曲霉毒素定量檢測的重要方法。Fei Ma等人[16]利用單克隆抗體1C11制備出免疫親和柱，利用IAC-HPLC法檢測花生、植物油和茶葉中的黃曲霉毒素含量，AFB1，AFB2，AFG1，AFG2的檢出限分別為 0.25，0.30，0.10，0.18 μg/kg。

2.3 免疫層析法

免疫層析法的原理是將抗原或抗體包被于固相載體硝酸纖維膜上，檢測時將樣品加到試紙上的樣品墊，樣品在毛細管作用下前移與標記探針相互作用形成復合物，可通過肉眼或對借助信號采集儀器對顯色結果進行定性或定量分析。免疫層析試紙條的組分包括樣品墊、標記探針固定墊、硝酸纖維膜（NC膜）、吸水墊和底板。

基于膠體金標記的免疫層析技術（GNP-ICA）將膠體金標記技術、免疫分析技術和層析技術聯(lián)系起來。宋青龍等人[17]利用該方法研制出一種膠體金快速定量檢測試劑盒，用于谷物和飼料中黃曲霉毒素B1的檢測，檢測結果與HPLC檢測結果相符。

免疫層析法具有快捷、靈敏、特異的特點，結果判斷直觀可靠、成本低廉、操作簡單、不依靠大型儀器設備和專業(yè)技術人員，在現(xiàn)場監(jiān)控和大規(guī)模樣品檢測中取得了廣泛應用。

2.4 熒光免疫法

熒光免疫法采用熒光標記取代酶聯(lián)免疫檢測法中的酶標記，通過檢測熒光信號對結果進行測定，具有較高的靈敏度，可實現(xiàn)對微量或超微量樣品的檢測。常用的熒光免疫分析法主要包括熒光免疫分析（Immuno-fluoremetrie Assays，IFMA）、熒光偏振免疫分析 （Fluorescence Polarization Immunoassay，F(xiàn)PIA）、熒光激發(fā)共振能量轉移免疫分析（Fluorescence Resonance Energy Transfer Immunoassay，F(xiàn)RETIA）、時間分辨熒光免疫分析（Time Resolved Fluorescence Immunoassay，TRFIA） 和多組分免疫分析（Multianalyte Immunoassay，MAIA）。

IFMA的原理類似于ELISA，檢測時根據熒光信號的強度對待檢物質的含量進行定性或定量分析。常用的熒光標記物為異硫氰酸熒光素。Zhang Z等人[18]利用基于量子熒光的IFMA法對花生中的AFB1進行檢測，檢出限為0.016 ng/mL。

FPIA的原理基于抗原抗體結合物熒光偏振程度的差異，偏振熒光強度與檢測物質的量呈反比。Beloglazova N V等人[19]利用FPIA法對啤酒中AFB1進行檢測，檢出限為1 ng/mL。

FRETIA的原理基于2個不同熒光基團之間能量的相互轉移。其中，轉移能量的熒光基團為供體，當 2個熒光基團足夠靠近時，通過電偶極作用供體分子和受體分子之間發(fā)生能量共振轉移。Hui L等人[20]利用基于熒光激發(fā)共振能量轉移原理的裝置，實現(xiàn)了牛奶中AFM1的檢測。

TRFIA通常以鑭系稀有金屬離子及其螯合劑作為熒光標記物。利用時間分辨熒光檢測儀檢測待測物質的熒光強度，根據熒光信號的強度確定待檢物質的含量。Tang X等人[21]利用TRFIA對牛奶中AFM1進行檢測，檢出限為0.03 ng/mL，檢測時間只需6 min，與用同樣抗體制作的膠體金試紙條相比靈敏度提高了10倍，與HPLC相比結果一致。

MAIA通常采用光譜不重疊的多標記物，實現(xiàn)樣本中多指標或不同成分的同時檢測。Kanungo L等人[22]利用該方法對黃曲霉毒素進行檢測。

2.5 化學發(fā)光免疫法

化學發(fā)光免疫法（Chemiluminescent Immunoassay，CLIA），以化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體，利用化學發(fā)光檢測儀檢測待測物質的信號強度，根據信號的強度確定待檢物質的含量。根據標記物的不同，可將其分為化學發(fā)光免疫分析、化學發(fā)光酶免疫分析和電化學發(fā)光免疫分析。

化學發(fā)光免疫分析法的原理是通過魯米諾或吖啶酯類等試劑直接標記抗體或抗原，與待測物質發(fā)生特異性反應。裘雪梅等人[23]采用吖啶酯標記AFB1，利用競爭性化學發(fā)光免疫分析法對黍米樣品中AFB1進行檢測?；瘜W發(fā)光酶免疫分析法的原理是基于酶聯(lián)反應，通過加入化學發(fā)光底物實現(xiàn)信號的檢測。王巖等人[24]利用于化學發(fā)光酶免疫分析法檢測乳制品中AFM1的含量。電化學發(fā)光免疫分析法的原理是以電化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體，標記后的抗原或抗體與待測物質中的抗體或抗原結合，形成的復合物在電場作用下發(fā)生電化學發(fā)光反應，根據發(fā)光強度確定待檢物質的含量。汪玉等人[25]利用該原理研制了一種基于磁性納米纖維/碳納米角修飾的電化學發(fā)光免疫傳感器用于黃曲霉毒素的檢測。

CLIA與ELISA法相比，具有更高的靈敏度，可用于痕量樣品的檢測。此外，該方法具有特異性強、線性范圍寬、儀器操作簡單、成本低廉等特點，適合大批量樣本的檢測。

2.6 免疫傳感器法

免疫傳感器法基于免疫學反應與傳感器技術，通過抗體的選擇性檢測待檢物質，同時能夠將檢測的結果轉換成相應數據形式的轉換信號。根據傳感技術原理的不同，可分為電化學免疫傳感器、質量檢測免疫傳感器、熱量檢測免疫傳感器和光學免疫傳感器。運用該方法進行檢測只需少量樣品可獲得多種目標物的檢測結果，檢測限可達pg-ng級水平，并且重復性好、特異性強、自動化程度高，適用于黃曲霉毒素和其他真菌毒素的混合污染檢測。

2.7 免疫芯片檢測法

免疫芯片又稱抗體芯片，基于抗原抗體間的特異性反應，芯片上設置有探針點陣，通過特異性反應捕獲待測樣本中的靶向蛋白質，然后通過激光圖譜掃描進行圖像成像，然后在計算機計算的同時，對結果進行分析，而且可對大量樣本中多種物質進行同時定性或定量分析，分為固相和液相2種模式。免疫芯片技術可用于樣本中包括黃曲霉毒素在內的多種真菌毒素進行同步檢測，具有操作方便、靈敏度高、分析速度快、選擇性強等特點。

3 結語

黃曲霉毒素在一定的濕度和溫度條件下，容易引起食品霉變，對人體健康造成威脅。因此，從源頭發(fā)現(xiàn)控制黃曲霉毒素的危害，加強對食品中黃曲霉毒素的檢測研究十分必要。儀器分析法靈敏度高，能夠進行精確的定量檢測，但存在樣本前處理復雜、對儀器和操作人員的要求較高、難以對大量樣本進行快速檢測等問題。免疫學檢測方法具有靈敏度高、特異性強、方便快捷的特點，適用于現(xiàn)場快速檢測。今后，為實現(xiàn)更方便快捷、高通量、現(xiàn)場檢測的要求，還應在將免疫原理與現(xiàn)代分析技術相結合研究開發(fā)新型食品安全快速檢測技術方面努力。