針刺調(diào)控NRG/ErbB通路對腦梗死后的神經(jīng)保護作用研究進展*

王東巖，麻聰聰,董 旭，楊海永

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

中國卒中發(fā)病率是全世界最高的國家之一，在腦卒中患者中高達67.3%～80.5%的腦卒中病例歸因于缺血性腦卒中(腦梗死)。針刺治療腦梗死的療效越來越得到認可，對其治療機制的探討也成為近年來的研究熱點。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(Neuregulin,NRG)是一類復(fù)雜的因子，在神經(jīng)發(fā)育過程中起著許多作用。實驗表明，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白促進神經(jīng)元的遷移和分化，并調(diào)節(jié)神經(jīng)元和神經(jīng)肌肉接頭處神經(jīng)遞質(zhì)受體的選擇性表達,還調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細胞的增殖、存活和分化。在神經(jīng)元間的突觸，NRG及其ErbB受體在突觸后與PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)合，從而可以調(diào)節(jié)突觸可塑性。研究表明，針刺能夠調(diào)控內(nèi)源性NRG/ErbB信號通路，起到神經(jīng)保護作用和促進腦梗死恢復(fù)。

1 腦梗死后NRG及其受體ErbB的上調(diào)

1.1 腦梗死后NRG的上調(diào)

在正常大鼠大腦中，NRG的免疫反應(yīng)性存在于大腦皮質(zhì)、海馬和尾殼核[1-2]。Parker等[3]用大鼠永久性大腦中動脈阻塞模型(MCAO)來檢測神經(jīng)調(diào)節(jié)素在缺血性卒中發(fā)病后的分布。MCAO后，梗死半球半影的NRG免疫染色與對側(cè)半球相比顯著增加，梗死核心周圍皮質(zhì)的染色顯著高于對側(cè)大腦半球的相應(yīng)區(qū)域，梗死核心區(qū)有少量或無特異性染色。Erlich和Gerecke等[2,4]使用MAP-2(神經(jīng)元細胞體和近端樹突特異的標記)來檢測NRG的神經(jīng)元表達，發(fā)現(xiàn)半影區(qū)NRG的增加主要與神經(jīng)元有關(guān)。在創(chuàng)傷性腦損傷模型中，星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞中NRG和ErbB受體的表達增加，通常不表達神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白。因此，研究NRG在星形膠質(zhì)細胞和巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞中的表達，結(jié)果顯示在高倍率下檢查GFAP陽性區(qū)域與NRG沒有任何顯著的共定位。因此，在缺血發(fā)作后72 h，膠質(zhì)外維酸性蛋白(GFAP)陽性星形膠質(zhì)細胞中沒有誘導(dǎo)NRG。使用ED-1抗體發(fā)現(xiàn)，與同側(cè)半球相關(guān)的巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞數(shù)目顯著增加，而對側(cè)半球很少見到。ED-1陽性細胞分布于梗死中心，與NRG無共同標記；ED-1陽性細胞也存在于半影區(qū)，這些細胞均未表達NRG。因此在星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞中誘導(dǎo)NRG可能是對缺血性損傷的遲發(fā)性反應(yīng)，并且像在創(chuàng)傷性腦損傷模型中那樣可能在后來出現(xiàn)。

由此可見，NRG的增加是神經(jīng)元性的，沒有NRG與星形膠質(zhì)細胞或巨噬細胞共定位。這些結(jié)果表明NRG在缺血性腦卒中后在神經(jīng)元中誘導(dǎo)，可能參與神經(jīng)保護和修復(fù)作用。

1.2 腦梗死后ErbB的上調(diào)

ErbB受體在正常成年大鼠腦中差異表達。在腦大部分區(qū)域的神經(jīng)元胞體中可見ErbB2、ErbB3、ErbB4的標記，而腦白質(zhì)中膠質(zhì)細胞中存在ErbB3和ErbB4，而灰質(zhì)中不存在ErbB3和ErbB4。Xu等[5]使用MCAO模型來檢測缺血性卒中后ErbB受體的分布，在缺血區(qū)觀察到ErbB4蛋白的上調(diào)。Davies和Liu[6-7]研究發(fā)現(xiàn)ErbB4蛋白在梗死周圍皮層和紋狀體中均顯著升高,梗死周圍皮質(zhì)的染色明顯高于對側(cè)皮質(zhì)的相應(yīng)區(qū)域。在單個細胞中，標記的細胞數(shù)量和標記強度都有所增加，且觀察到ErbB4陽性細胞萎縮和三角形，這是受損神經(jīng)元的特征。同側(cè)梗死周皮層ErbB4陽性細胞胞漿和胞核均有免疫反應(yīng)性。正常腦組織ErbB2和ErbB3免疫陽性細胞較少，輕度染色，缺血后受體無明顯改變。用FJB染色(Fluoro-Jade B)作為神經(jīng)退行性變的標志，在FJB陽性細胞中ErbB4上調(diào)，提示ErbB受體在受損神經(jīng)元中誘導(dǎo)。在神經(jīng)元和巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞亞群中可見ErbB受體增加,沒有ErbB與GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞共定位。

這些結(jié)果表明ErbB受體在缺血性腦卒中后在神經(jīng)元和巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞中上調(diào)，可能與NRG一樣參與神經(jīng)保護和修復(fù)作用。

2 NRG/ErbB在腦梗死的保護作用機制

在MCAO模型中發(fā)現(xiàn)，腦梗死后梗死起始于紋狀體的皮層下。皮層下梗死發(fā)生在MCAO后幾分鐘內(nèi)，由谷氨酸依賴性興奮毒性神經(jīng)元損傷介導(dǎo)。損傷隨后擴展到包括同側(cè)大腦皮層的大區(qū)域。這種延遲的細胞死亡階段在接下來的幾個小時內(nèi)發(fā)生。延遲、缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡是由炎癥和凋亡機制介導(dǎo)的。

NRG是一個生長和分化因子家族，與酪氨酸激酶受體EGF家族的成員結(jié)合[8]。EGF可促進培養(yǎng)的新生大鼠腦端腦神經(jīng)元的生長，并保護神經(jīng)元免受缺氧引起的損傷和氰化鉀的神經(jīng)毒性。除了這些體外發(fā)現(xiàn)外，EGF還具有缺血腦的神經(jīng)保護功能。神經(jīng)營養(yǎng)素-1β(NRG-1β)是一種已知參與神經(jīng)細胞存活和功能的生長因子家族成員。NRG-1β及其受體ErbB受體在創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)細胞中被誘導(dǎo)[9-10]，在MCAO大鼠梗死周圍(半暗帶)也被誘導(dǎo)[11-12]。在體內(nèi)外具有抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的特性，并參與對腦梗死的保護作用。雖然NRG/ErbB的神經(jīng)保護作用已被證明，但其確切機制仍不清楚。

2.1 改善神經(jīng)功能和降低腦梗死體積研究

為了評價NRG-1的神經(jīng)保護作用，Shyu等[13]采用腦內(nèi)注射NRG-1蛋白，通過阻塞大腦中動脈(MCAO)誘導(dǎo)局灶性腦缺血，測定腦缺血48 h后各實驗大鼠的運動功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用NRG-1預(yù)處理的大鼠的運動活動，包括水平活動和垂直活動，明顯高于對照組。通過TTC染色以及梗死的發(fā)病率(用發(fā)生梗死的動物數(shù)量除以研究的動物總數(shù)來表示)研究發(fā)現(xiàn)，在NRG-1預(yù)處理之后，給定截面的最大梗死面積顯著地從對照值(22.3±3.9)mm2減少到(9.0±1.1)mm2。此外，NRG-1大鼠的梗死節(jié)段數(shù)從每只對照大鼠的(6.4±0.5)節(jié)減少到(3.0±0.3)節(jié)。以上數(shù)據(jù)表明，在腦缺血前30 min用NRG-1預(yù)處理不僅可減少缺血大鼠腦的體積，而且可減少梗塞的程度。Li等[14]建立MCAO/R動物模型,通過NRG-1治療組與對照組來評估腦缺血后的神經(jīng)功能。在MCAO/R后24 h，以Longa等的標準[15]進行行為評估，得出對照組大鼠出現(xiàn)多種神經(jīng)癥狀和體征，不良反應(yīng)評分為1。NRG-1治療后，神經(jīng)癥狀改善，評分明顯降低,與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);缺血1 h，治療組神經(jīng)功能明顯改善(P<0.01);NRG-1治療組與對照組相比，梗死面積減小(P<0.05)，尤以缺血1 h減少明顯(P<0.01)。Guo等[16]采用大鼠局灶性腦缺血模型研究發(fā)現(xiàn)，與載體治療組動物相比，接受NRG-1治療的大鼠在再灌注24 h的神經(jīng)功能缺損明顯改善。NRG-1治療后神經(jīng)功能評分較治療前的2.5(SEM：0.48)提高到1.22(SEM：0.43)，與模型組比較P<0.05。用TTC評價大鼠MCAO及再灌注后神經(jīng)元的損傷。MCAO作用90 min,再灌注24 h,造成實驗動物大腦皮質(zhì)和紋狀體廣泛梗死。與對照組相比，NRG-1預(yù)治療梗死體積縮小(P<0.01)。這些研究結(jié)果表明，NRG體內(nèi)外治療均能改善腦梗死后的神經(jīng)功能，起到保護作用。

張昕垚等[17]通過觀察兩種不同頻次針法治療腦梗死患者，即1日1次和隔日1次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同頻次針法腦梗死患者總體神經(jīng)功能缺損、日常生活能力及預(yù)后均有明顯改善,且兩組均能提高患者臨床療效,但每日針刺1次改善程度及臨床療效更明顯。張銘銘等[18]觀察頭針電刺激不同時間點對急性腦梗死大鼠血清CD62P和CD63水平、神經(jīng)功能缺損的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明頭針電刺激能降低CD62P、CD63表達,改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能。

2.2 抗凋亡機制研究

2.2.1 降低缺血誘導(dǎo)的細胞凋亡 相關(guān)動物實驗研究[16,19]表明用TUNEL分析觀察NRG-1預(yù)處理和對照組大鼠腦缺血后腦細胞凋亡的變化。用NRG-1預(yù)處理的缺血大鼠缺血核心周圍的半影區(qū)幾乎不含TUNEL陽性細胞，類似于正常腦。然而，從注射了載體的動物的缺血腦組織中，在半影區(qū)和缺血核心區(qū)確實含有許多TUNEL陽性細胞。在數(shù)量上，用載體預(yù)處理的動物比用NRG-1預(yù)處理的動物具有更多的TUNEL陽性細胞。TUNEL陽性細胞主要分布于大腦皮質(zhì)缺血核心區(qū)，標記主要見于神經(jīng)元細胞核。在同側(cè)半球的其他區(qū)域或?qū)?cè)沒有發(fā)現(xiàn)TUNEL陽性細胞。這些發(fā)現(xiàn)表明NRG-1能保護神經(jīng)元免受凋亡。

2.2.2 抑制caspase-3及 caspase-3mRNA的表達 Caspase-3是凋亡級聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵蛋白酶。線粒體介導(dǎo)的、細胞表面介導(dǎo)的和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在caspase-3的激活中匯聚。MCAO可激活caspase-3介導(dǎo)的細胞死亡以及caspase無關(guān)的凋亡信號通路，導(dǎo)致梗死核心壞死，而選擇性caspase-3抑制劑可阻止短暫MCAO后的細胞凋亡。Guo等[16]的實驗，大鼠在MCAO前10 min用NRG-1或載體治療。用RT-PCR法檢測RNA和caspase-3 mRNA的表達。結(jié)果表明，腦缺血誘導(dǎo)同側(cè)腦組織caspase-3表達較強，而對側(cè)腦組織caspase-3表達較少,與載體治療組相比，NRG-1治療組大鼠缺血誘導(dǎo)的caspase-3 mRNA水平降低。NRG-1既不影響同側(cè)缺血半球β-肌動蛋白水平，也不影響對側(cè)完整側(cè)caspase-3 mRNA水平。類似的結(jié)果也見于Shyu等[13]的實驗中，為研究NRG-1的神經(jīng)保護機制，12只大鼠MCA結(jié)扎后8 h處死進行caspase-3免疫反應(yīng)性試驗。經(jīng)NRG-1治療的大鼠的缺血核周圍的半影有少量caspase-3細胞表達。然而，對照組動物的缺血腦組織在半暗帶和缺血核心中含有許多caspase-3陽性的細胞。這些結(jié)果提示NRG-1抗腦缺血凋亡機制可能與抑制caspase-3的活化有關(guān)。

2.2.3 上調(diào)XIAP表達抑制線粒體凋亡途徑 X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)是一種內(nèi)源性凋亡抑制蛋白，被認為是caspase最有效的抑制劑。越來越多的證據(jù)表明，XIAP不僅可以干預(yù)線粒體caspase通路的發(fā)展，而且可以調(diào)節(jié)與神經(jīng)存活相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的次級活性[6]。XIAP被證明在細胞凋亡復(fù)合物中有結(jié)合和抑制具有活性的caspase-9和caspase-3的功能。Li等[14]實驗研究表明缺血誘導(dǎo)細胞凋亡和XIAP的表達。NRG-1可顯著增加XIAP蛋白的表達，尤其在缺血1 h時更為明顯，提示NRG-1可能通過上調(diào)XIAP活性而抑制線粒體凋亡途徑的形成，在腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用。

韓林等[20]通過實驗表明“醒腦開竅”針刺法對腦缺血再灌注損傷大鼠有明顯的腦保護作用,其機制可能與減輕神經(jīng)細胞凋亡密切相關(guān)。武曉娜等[21]從促進神經(jīng)組織再生、抑制神經(jīng)細胞凋亡等方面進行綜述，表明針刺能夠抑制缺血半暗帶神經(jīng)細胞的凋亡,對梗死灶周圍缺血的神經(jīng)組織有保護作用。

2.3 抑制缺血誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

2.3.1 抑制缺血誘導(dǎo)的膠質(zhì)反應(yīng) 缺血損傷導(dǎo)致以興奮毒性為特征的早期發(fā)病神經(jīng)元死亡，由此導(dǎo)致的缺血性腦損傷在受傷的大腦中引發(fā)炎性級聯(lián)反應(yīng)，并在癥狀出現(xiàn)后持續(xù)數(shù)天。這種炎癥反應(yīng)導(dǎo)致小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞的浸潤和激活，星形膠質(zhì)細胞的激活，以及隨后的凋亡神經(jīng)元死亡。NRG-1能抑制巨噬細胞浸潤，阻斷巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞表達促炎基因。Xu等[22]使用鑒定巨噬細胞和活化小膠質(zhì)細胞的ED-1抗體，觀察到MCAO/再灌注后，同側(cè)半球的巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞數(shù)量眾多，而對側(cè)半球未見到巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞。ED-1陽性細胞呈阿米巴狀(活化巨噬細胞和分枝小膠質(zhì)細胞的特征)，分布于外側(cè)皮質(zhì)和紋狀體。然而，在使用NRG-1β時，幾乎沒有看到ED-1陽性細胞。在NRG-1β處理的組織中發(fā)現(xiàn)的罕見的ED-1陽性細胞是圓形的，類似于單核細胞，而不是活化的巨噬細胞或分支小膠質(zhì)細胞。

2.3.2 抑制缺血誘導(dǎo)的IL-1表達 IL-1是一種促炎性細胞因子，已被證實是缺血性腦損傷誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的重要介質(zhì)。IL-1β在嚙齒動物腦缺血的腦中迅速誘導(dǎo)，給予外源性IL-1β會增強缺血性腦損傷[23]。相反，通過給予IL-1β受體拮抗劑會阻斷IL-1β，可抑制缺血引起的神經(jīng)元損傷和炎癥[23-24]。此外，缺乏caspase-1基因(它將不活躍的前IL-1裂解為成熟的活性形式)的小鼠也顯示出減輕缺血性腦損傷[25]。IL-1β/IL-1α雙敲除小鼠在MCAO后表現(xiàn)出梗死面積減少[26]。Xu等[22]研究發(fā)現(xiàn)RT-PCR檢測IL-1β mRNA，顯示腦缺血后同側(cè)腦組織IL-1β明顯升高，而對側(cè)腦組織IL-1β很少見到。NRG-1與經(jīng)載體處理的動物相比，缺血誘導(dǎo)的IL-1β mRNA水平降低了50%。這些研究表明，NRG-1誘導(dǎo)的神經(jīng)保護機制可能涉及抑制IL-1的產(chǎn)生。

此外，NRG抑制缺血誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)還可能涉及其他炎性因子，這些細胞因子誘導(dǎo)粘附分子、下游促炎分子和應(yīng)激基因的表達，因此NRG的抗炎機制很可能是使這些細胞因子失活或阻斷細胞因子受體，從而減輕缺血損傷。

3 針刺調(diào)控NRG/ErbB通路對腦梗死后的神經(jīng)保護作用研究

研究發(fā)現(xiàn)電針能夠上調(diào)NRG-1和ErbB2的表達，NRG-1和ErbB2受體結(jié)合并激活下游信號通路，NRG-1/ErbB2信號通路對施旺細胞生存信號傳導(dǎo)非常重要，該通路能夠促進施旺細胞分化、增殖和遷移，增強施旺細胞生存[27-28]。張麗麗等[29-30]探討醒腦開竅針法對缺血/再灌注大鼠大腦皮層NRG-1及其受體ErbB4蛋白表達的影響。結(jié)果顯示針刺組大腦皮層缺血半暗帶NRG-1的表達高于正常組、假手術(shù)組、模型組和非穴位組(P<0．05) ，穴位組 ErbB4 表達也高于正常組和假手術(shù)組(P<0．05)，提示電針刺激水溝和內(nèi)關(guān)使皮層缺血半暗帶內(nèi)源性NRG-1的表達增加更顯著，在缺血性腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

在腦缺血的發(fā)展中凋亡起著重要的作用。神經(jīng)元凋亡的數(shù)目直接決定著梗死區(qū)域的面積和缺血后繼發(fā)性損害的程度，所以及時遏制凋亡是挽救凋亡前期神經(jīng)元的關(guān)鍵。針刺通過調(diào)控NRG/ErbB通路，上調(diào)內(nèi)源性NRG及其受體ErbB的表達水平，一方面，在一定程度上抑制了神經(jīng)元的凋亡，另一方面，通過增加NRG及ErbB的表達，抑制炎癥因子釋放和表達，抑制單核細胞浸潤、星形膠質(zhì)細胞活化后與細胞因子產(chǎn)生，從而抑制腦梗死后的炎癥反應(yīng)，起到神經(jīng)保護作用。

4 結(jié)語

腦梗死的病理生理機制十分復(fù)雜，NRG/ErbB信號通路對腦梗死的神經(jīng)保護機制可能涉及干擾NJFB，NJFB是介導(dǎo)許多炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。也可能通過激活磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信號通路發(fā)揮其神經(jīng)保護作用，該信號通路已被證明可促進細胞存活。NRG/ErbB信號通路還可能參與缺血后皮質(zhì)神經(jīng)元的可塑性，從而促進功能恢復(fù)。針刺調(diào)控NRG/ErbB信號通路對腦梗死的保護作用機制，涉及抑制凋亡、炎癥反應(yīng)和膠質(zhì)反應(yīng)以及調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子等，其作用具有特異性，是一種遲發(fā)的神經(jīng)保護作用，而針刺調(diào)控的內(nèi)源性NRG/ErbB信號通路與外源性的NRG-1對腦梗死的神經(jīng)保護作用機制是否相似，仍然需要深入研究。此外，進一步研究，還應(yīng)當闡明針刺調(diào)控NRG/ErbB通路神經(jīng)保護途徑背后的信號機制及分子機制，探討針刺調(diào)控腦梗死后NRG/ErbB通路的時間窗，推進針刺治療腦梗死的機制研究，為臨床腦梗死患者的治療提供理論依據(jù)。