自噬在腦出血中的作用及針刺調(diào)節(jié)機(jī)制研究探析*

李明月，李 響，鄒 偉

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江省中醫(yī)醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

自噬來源于希臘語，早在50多年前，自噬現(xiàn)象就被美國科學(xué)家T. P. Ashford和K. R. Porter通過電子顯微鏡在大鼠肝臟細(xì)胞中觀察到[1]。自噬在生理、病理上的重要功能逐漸被人類認(rèn)識[2]。

1 自噬

1.1 經(jīng)典自噬

自噬一般可分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬[3]，前兩者清除蛋白底物均無選擇性，而分子伴侶介導(dǎo)的自噬要求被降解的蛋白底物必須都含有特定的氨基酸序列，且能被HSC73識別并結(jié)合[4]，進(jìn)而被降解。通常自噬過程分為自噬前體的形成、自噬小體的形成、自噬溶酶體形成3個階段[5]。

1.2 經(jīng)典自噬過程及分子調(diào)控機(jī)制

參與自噬的重要分子雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)上有幾個重要的區(qū)域，分別為激酶區(qū)、FAT區(qū)、FATC區(qū)、HEAT重復(fù)序列區(qū)、FRB區(qū)。其中激酶區(qū)能夠接受自噬起始信號，F(xiàn)AT區(qū)和FATC區(qū)可以調(diào)節(jié)mTOR激酶的活性。在酵母細(xì)胞中營養(yǎng)豐富時TOR激酶與Atg1結(jié)合，將其磷酸化成PAtg1,從而抑制自噬相關(guān)的下游信號；相反在饑餓狀態(tài)時，TOR激酶被抑制，Atg1去磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[6]。

1.2.1 自噬前體形成階段 自噬調(diào)控基因 Atg6 /Beclin1主要參與這個階段。Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(ClassⅢPI3K)是影響其活性的重要激酶。ClassⅢPI3K的催化亞基Vps34與Atg6/Beclin1的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，可以催化質(zhì)膜上的磷脂酰肌醇為磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI3P)，PI3P可以組裝含有PX和FYVE結(jié)構(gòu)域的蛋白到自噬發(fā)生的位置，參與自噬前體膜形成[7]。

1.2.2 自噬小體形成階段 該階段需要Atg5-Atg12-Atg16連接系統(tǒng)和Atg8/LC3連接系統(tǒng)參與。前者主要定位于自噬體外膜，后者在自噬體內(nèi)膜和外膜都有定位。在Atg5-Atg12-Atg16的連接系統(tǒng)中，在類E1泛素激活酶和類E2泛素結(jié)合酶的誘導(dǎo)下，Atg12經(jīng)由Atg7和Atg10最終傳遞至Atg5，形成Atg5-Atg12復(fù)合物，同時Atg16的低聚物可以與大量的Atg5-Atg12復(fù)合物連接，形成更大的復(fù)合物，并連接在自噬前體雙層膜上使其延長[8]。在Atg8/LC3連接系統(tǒng)中，LC3最初是以LC3-I的形式存在，處于一種非活化狀態(tài)，在自噬出現(xiàn)時，LC3-I被Atg7和Atg3依次活化，在Atg5-Atg12-Atg16連接系統(tǒng)的協(xié)助下與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合，轉(zhuǎn)化成具有膜結(jié)合能力的活化的LC3-II，共同參與雙層膜的延長和自噬小體的形成[9]。

1.2.3 自噬溶酶體形成階段 相對于自噬早期階段，該階段的機(jī)制研究較少。首先自噬小體成熟后，大部分Atg蛋白從自噬小體外膜脫落，而LC3-II繼續(xù)停留于內(nèi)膜上。最后自噬小體外層膜成功與溶酶體膜融合形成自噬溶酶體，自噬小體內(nèi)層膜連同被降解底物一同在溶酶體中被降解[10]。

2 自噬在腦出血中的作用

2.1 腦出血中影響自噬的主要因素

腦出血(Intracerebral Hemorrhage，ICH)是一種破壞性的中風(fēng)，導(dǎo)致世界范圍內(nèi)的高死亡率和高致殘率。近幾年越來越多的研究證明自噬在腦出血后的病理損傷中發(fā)揮了重要作用。早在2008年，HeY等[11]在實(shí)驗(yàn)大鼠基底節(jié)自體血注入3天和7天后，利用電鏡在血腫周邊的組織細(xì)胞內(nèi)觀察到自噬小體結(jié)構(gòu)，首次證實(shí)了在 ICH 發(fā)生后自噬的激活。Ren C等[12]運(yùn)用神經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)方法(LC-MS/MS)研究在ICH大鼠模型腦損傷后蛋白質(zhì)的差異表達(dá),證明了出血性腦卒中蛋白確實(shí)參與了自噬過程。

ICH發(fā)生后紅細(xì)胞裂解，大量游離鐵釋放。為了研究鐵對腦出血后的神經(jīng)損傷是否與自噬相關(guān)，有學(xué)者做了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。在體內(nèi)，通過對大鼠右側(cè)海馬體內(nèi)分別注射生理鹽水和亞鐵進(jìn)行觀察；在體外，將大鼠胚胎的原始培養(yǎng)皮層神經(jīng)元暴露于亞鐵中。并在1、3、7天內(nèi)對LC3進(jìn)行了Western blot分析和MDC染色。結(jié)果在體內(nèi)和體外均有LC3-I轉(zhuǎn)化為LC3-II。MDC標(biāo)記顯示，將神經(jīng)元暴露在鐵元素中，會出現(xiàn)MDC的積累,說明腦出血后鐵的積累可以誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生，參與腦損傷[13]。有研究也支持這一觀點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)大鼠大腦的自噬細(xì)胞死亡中，檢測到鐵含量增加[14]。另外，凝血酶也可在腦出血后大量釋放，并彌散至血腫周圍。研究表明在培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，凝血酶增強(qiáng)了LC3-I到LC3-II的轉(zhuǎn)化，并增加了MDC標(biāo)記的自噬液泡[15]。腦出血后周圍組織由于血腫、水腫形成，占位效應(yīng)明顯，周圍組織繼發(fā)缺氧，研究表明缺氧可以通過激活缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)的途徑來影響自噬在慢性和中度缺氧中產(chǎn)生，進(jìn)而通過調(diào)節(jié)受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的清除起到保護(hù)作用。此外，另外3個氧敏感信號通路也與自噬的激活有關(guān)。包括哺乳動物雷帕霉素靶激酶(mTOR)展開的蛋白質(zhì)反應(yīng)(UPR)和PKCδ-JNK1通路。此外與自噬的保護(hù)作用相反，在快速和嚴(yán)重的氧波動期間，自噬可能是有害的，并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[16]。

自噬的產(chǎn)生不僅與腦出血后的組織病理狀態(tài)有關(guān)，有研究顯示自噬的作用與性別有關(guān)，在探討神經(jīng)元自噬和雌激素介導(dǎo)的保護(hù)作用對抗鐵紋狀體損傷的關(guān)系過程中發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)檸檬酸亞鐵誘導(dǎo)雌性大鼠的自噬程度以及行為缺陷等均較雄性低[17]。另有研究也支持性別在腦出血作用中的差異[18]。在腦出血后，男性的存活率比絕經(jīng)前的女性要低。自噬不僅與性別有關(guān)，自噬的作用與年齡也有關(guān)，有學(xué)者研究了衰老對腦出血后自噬的影響。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)老年大鼠與幼齡大鼠相比，LC3-I/LC3-II的轉(zhuǎn)化率在同側(cè)基底神經(jīng)節(jié)中較高。血腫周圍組織蛋白酶D水平在老年大鼠中也較高。老年大鼠ICH后神經(jīng)功能缺損較嚴(yán)重，功能恢復(fù)較慢[19]。不僅如此，廖遠(yuǎn)生等[20]針對腦出血中醫(yī)辨證的不同證型的自噬差異還做了深入研究，發(fā)現(xiàn)在陽閉、陰閉和脫證中自噬泡數(shù)目和自噬相關(guān)蛋白CathepsinD表達(dá)存在顯著差異，且與病情輕重呈正相關(guān)。

2.2 自噬在腦出血中的作用

2.2.1 自噬的破壞作用 自噬是機(jī)體對環(huán)境變化做出的一種應(yīng)激反應(yīng)，過度自噬會對細(xì)胞造成破壞；自噬不足，不能有效的清除受損的細(xì)胞器和破碎蛋白也會對細(xì)胞功能造成影響。白細(xì)胞介素-33(IL-33)是一種最近發(fā)現(xiàn)的IL-1家族成員，有研究表明 IL-33通過抑制炎癥、凋亡和自噬作用，在膠原酶誘導(dǎo)的ICH模型中提供神經(jīng)保護(hù)[21]。Yang Z等[22]通過研究發(fā)現(xiàn),Toll樣受體-4(TLR4)可能是參與了自噬的激活，進(jìn)而引起小膠質(zhì)細(xì)胞的激活介導(dǎo)了ICH炎癥損傷。陸夢茹等[23]在腦出血與自噬關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)抑制 C57BL/6小鼠的TLR4及自噬可減輕自噬引起的腦出血炎癥損傷。對于腦出血自噬作用的通路，有專家通過在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究中證明，自噬在腦出血模型中造成的神經(jīng)損傷可能與NF-κB通路的調(diào)節(jié)有關(guān)[24]。另有研究表明miRNA-144可以通過mTOR調(diào)控腦出血后誘發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞自噬和炎癥，造成腦損傷。miRNA-144的下調(diào)可以抑制ICH小鼠的炎癥、腦水腫，改善神經(jīng)功能[25]。除此之外，在治療上，Wu Z等[26]研究發(fā)現(xiàn)在大鼠ICH模型中注射米諾環(huán)素可以顯著減少ICH后腦損傷，根據(jù)注射米諾環(huán)素后beclin1、LC3II/I、caspase-3/8均被抑制，推測其保護(hù)作用與抗自噬和抗凋亡有關(guān)。Chang P等[27]在研究中還首次證明了抗壞死性凋亡的抑制劑-1能夠抑制細(xì)胞凋亡和自噬，從而發(fā)揮ICH后神經(jīng)保護(hù)作用。以上研究證實(shí)了自噬在ICH中的破壞作用，并指出有效的抑制自噬，可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

2.2.2 自噬的保護(hù)作用 自噬是一種溶酶體參與的細(xì)胞代謝途徑，自噬的適度激活可使受損的細(xì)胞器和錯誤折疊的蛋白質(zhì)被降解和回收，以維持細(xì)胞正常穩(wěn)態(tài)。據(jù)研究證實(shí)，腦出血后可產(chǎn)生大量活性氧自由基，進(jìn)而激活自噬，吞噬氧化應(yīng)激產(chǎn)物，減輕ICH后腦損傷[28]。另有研究表明可以通過BECN1和ATG5激活小膠質(zhì)細(xì)胞自噬為ICH提供保護(hù)作用[29]。不僅如此，有文章顯示自噬的保護(hù)作用，與大腦損傷的不同部位有關(guān)[30]，有學(xué)者利用腦卒中的動物模型，評估自噬在大腦皮層和海馬區(qū)的神經(jīng)保護(hù)作用[31]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)和大腦皮層之間的自噬標(biāo)記存在顯著差異。在造模后的3 h內(nèi)，自噬體和自噬通量在大腦皮層中有所增加。在海馬區(qū)未觀察到明顯增加。仇志富等[32]利用補(bǔ)陽還五湯灌藥研究自噬在腦出血中的作用發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯能夠通過CXCR4-PI3K信號通路激活自噬，起到腦保護(hù)作用。

3 針刺對腦出血自噬過程的雙向調(diào)節(jié)作用

針刺作為一種綠色有效的治療手段，已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可。世界衛(wèi)生組織推薦針灸作為改善中風(fēng)治療的替代和補(bǔ)充策略[33]。關(guān)于針刺對自噬的影響，Luo D等[34]廣泛搜索了PubMed、Embase、Science和CNKI,結(jié)果發(fā)現(xiàn)針刺對動物模型的自噬具有潛在的治療作用。Li HQ等[35]對于針刺選穴百會治療急性腦出血動物模型做了前瞻性的回顧和薈萃分析，最后得出，針刺百會是治療急性腦出血的一種可選治療方法。Liu H等[36]利用頭針進(jìn)行針刺，發(fā)現(xiàn)頭針治療可降低TNF-α和NF-κB 的表達(dá)，改善腦出血大鼠神經(jīng)功能缺陷。牛明明等[37]采用自體血注入法制作腦出血大鼠模型，利用“百會”透“曲鬢”針刺法對其進(jìn)行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白LC3A/B在針刺組表達(dá)最高，且針刺組神經(jīng)功能改善最明顯，提示頭穴透刺可以促進(jìn)自噬作用，參與神經(jīng)修復(fù)。包宇等[38]觀察針刺“百會”透“曲鬢”對腦出血急性期大鼠P13K和P-AKT表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)針刺可以提高兩種蛋白表達(dá)水平，減輕腦出血后繼發(fā)性損傷。鄒偉等[39]研究發(fā)現(xiàn)頭針透穴法可能對β-catenin表達(dá)有作用，進(jìn)而激活 Wnt信號通路參與自噬。Niu M等[40]針對ICH后自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)做了相關(guān)性研究，得出自噬能夠在ICH后清除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的錯誤蛋白聚集，對細(xì)胞提供保護(hù)作用。而早期研究已經(jīng)證實(shí),PERK通路是激活自噬相關(guān)基因誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激恢復(fù)穩(wěn)態(tài)的主要通路之一[41]。相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)對針刺在實(shí)驗(yàn)性大鼠腦出血模型中自噬作用影響做了進(jìn)一步研究得出，隨著大鼠腦組織損傷加重，PERK蛋白表達(dá)增加，自噬作用增強(qiáng)，而針刺“百會”透“曲鬢”可以明顯緩解3-MA抑制劑對自噬的抑制作用和對PERK通路活躍度減低情況[42]。進(jìn)一步驗(yàn)證針刺治療可以通過激活PERK通路激活自噬，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)。以上研究均說明針刺可以適度激活自噬起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。

另外針刺也可以適度抑制自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Li HQ等[43]研究發(fā)現(xiàn)電針百會穴治療腦出血可以通過干擾Caveolin-1介導(dǎo)的分子途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Caveolin-1已被證明參與自噬途徑[44]。另外Zou W等[45]發(fā)現(xiàn)針刺抑制腦出血大鼠基底神經(jīng)節(jié)Notch1和Hes1蛋白表達(dá)，參與腦神經(jīng)保護(hù)。Notch1被證明可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[46]。Li X等[47]研究證實(shí)芬戈莫德通過mTOR/P70S6k途徑抑制自噬過度激活，可以緩解腦缺血再灌注損傷,證明了mTOR/P70S6k途徑對于自噬的負(fù)性調(diào)控作用。而詹谷文[48]在腦出血大鼠實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)，電針聯(lián)合BMSCs移植治療可以激活mTOR/P70S6k信號通路,提高突觸可塑性，促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù);為針刺抑制腦出血后自噬作用，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。張國威等[49]在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)針刺“百會”透“曲鬢”可能在腦出血急性期通過抑制內(nèi)源性 MMP-9表達(dá)的途徑發(fā)揮拮抗腦損傷作用。Li WD等[50]在研究二甲雙胍抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)過程中證明，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9可以通過AMPK/mTOR自噬途徑降低。而針刺對腦出血腦損傷的拮抗作用，是否通過影響了自噬途徑從而抑制MMP-9的產(chǎn)生，還有待于進(jìn)一步研究。姜桂美等[51]在ICH急性期運(yùn)用針刺進(jìn)行干預(yù)治療，結(jié)果針刺顯著降低了血腫腦組織周圍炎性細(xì)胞因子IL-1β 與 IL-6的表達(dá),減輕了對腦組織的繼發(fā)性損傷。Zhao X等[52]研究發(fā)現(xiàn)臭氧在大鼠軟骨細(xì)胞中刺激IL-1β產(chǎn)生可以激活A(yù)MPK/mTOR信號通路誘發(fā)自噬;為IL-1β與自噬之間的關(guān)系提供了依據(jù)，也為針刺抑制IL-1β誘導(dǎo)的自噬提供了理論基礎(chǔ)。

4 討論

腦出血是中風(fēng)的一種亞型，其發(fā)病機(jī)制和治療手段已被廣泛研究。自噬作為細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制，在ICH中的作用也逐漸被認(rèn)識。但研究相對較少，自噬對ICH后內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用還有待于進(jìn)一步探討，在ICH病理損傷的不同階段和不同影響狀態(tài)下，自噬所發(fā)揮的作用可能不是單一性質(zhì)的。正如Duan XC等[53]研究發(fā)現(xiàn)，在ICH后6 h,過度的自噬參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腦組織損傷，而在ICH后7天，自噬可能通過清除早期自噬通量損傷產(chǎn)生的代謝廢物，發(fā)揮腦保護(hù)作用。所以動態(tài)觀察腦出血后自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)變化能更好的闡明自噬的作用。另外自噬是一把雙刃劍[54]，如何適度的激活自噬發(fā)揮自體修復(fù)作用仍然很模糊，過度自噬不僅不能有效清除受損蛋白，還會對細(xì)胞造成損傷。但目前研究對于干預(yù)自噬程度的探討不足，缺乏可供參考的文獻(xiàn)。針刺在治療ICH過程中發(fā)揮了一定作用。針刺可以直接影響自噬過程，也可以通過激活炎癥因子、腫瘤壞死因子、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路等其他機(jī)制間接干預(yù)自噬。盡管在實(shí)驗(yàn)研究中針刺治療ICH已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但目前針對自噬這一作用機(jī)制，探討針刺對ICH治療作用的研究甚少。已有研究也多集中在對某一自噬相關(guān)基因或蛋白的影響，缺乏針對自噬經(jīng)典通路或線粒體自噬等選擇性自噬的研究。針刺的良性雙向調(diào)節(jié)與自噬的正面和負(fù)面作用的關(guān)系如何體現(xiàn)，針刺如何調(diào)節(jié)自噬穩(wěn)態(tài)，仍然存在疑惑。

針刺作為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分在腦出血治療上療效顯著，關(guān)于針刺良性調(diào)節(jié)腦出血后自噬穩(wěn)態(tài)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞自體修復(fù)這一重要作用希望能通過后續(xù)大量研究更好的闡明。同時更應(yīng)該增加實(shí)驗(yàn)研究手段，不能單純局限于western blot、PCR等，為臨床針刺治療腦出血效果顯著提供更加深刻的理論支持。自噬在腦出血中作用研究可以為臨床腦出血的治療提供新的方向。