分子標(biāo)記技術(shù)在甘草中的應(yīng)用△

李珍珍，鄭司浩，尚興樸，鄧庭偉，王繼永*，趙潤懷*

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；2.中國中藥有限公司，北京 100195

甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.(也稱烏拉爾甘草)、脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根及根莖，又名國老、靈通、甜草、棒草[1]。甘草性味甘平，具有清熱解毒、潤肺止咳、緩急止痛、調(diào)和藥性等作用[2]。隨著中醫(yī)學(xué)科的應(yīng)用普及，國內(nèi)外都對甘草的藥理作用進(jìn)行了非常廣泛和深入的研究[3-10]。但不同基原甘草的有效化學(xué)成分含量有顯著的差別，且同一基原不同產(chǎn)地甘草的有效成分也存在差異[11-16]。

隨著分子生物技術(shù)在農(nóng)作物和中藥領(lǐng)域的迅速發(fā)展及應(yīng)用[17-20]，其對甘草的基原鑒定以及遺傳多樣性的研究層出不窮。相對于甘草傳統(tǒng)鑒定方法，如形態(tài)鑒別、顯微鑒別、理化鑒別、紅外鑒別、指紋圖譜鑒別等[21-24]，分子標(biāo)記技術(shù)顯示出迅速準(zhǔn)確的鑒別效果；而在甘草的遺傳多樣性上，不同的分子標(biāo)記又各具特點(diǎn)，本文將對分子標(biāo)記在甘草中的應(yīng)用做出綜述。

1 分子標(biāo)記技術(shù)概述

分子標(biāo)記技術(shù)是研究反映生物個(gè)體、居群以及物種等分類單位間的基因組DNA片段差異的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生物基因組探究、生物分子鑒定、生物遺傳等研究領(lǐng)域。分子標(biāo)記的種類主要有：基于Southern雜交技術(shù)的分子標(biāo)記如RFLP(restriction fragment length polymorphism，限制性片段長度多態(tài)性)、基于PCR的分子標(biāo)記如RAPD(randomly amplified polymo-rphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)、AFLP(amplification fragment length polymorphism，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性)、SSR(simple sequence repeat，簡單重復(fù)序列)、ISSR(inter-simple sequence repeat，內(nèi)部簡單序列重復(fù))、SRAP(sequence-related amplified polymorphism，序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性)、基于DNA序析的SNP(single nucleotide polymorphism、單核苷多態(tài)性)及DNA條形碼(DNA barcoding)等。

2 分子標(biāo)記技術(shù)在甘草中的應(yīng)用

2.1 RFLP

RFLP是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的分析DNA片段的技術(shù)，既能檢測基因組DNA(genome DNA)，又能夠檢測核糖體DNA(ribosome DNA，rDNA)以及葉綠體DNA(chloroplast DNA，cpDNA)，結(jié)果較穩(wěn)定，而且是共顯性表達(dá)。RFLP多應(yīng)用在鑒別菌落和研究菌落的多樣性[25]。谷俊等[26]采用表型數(shù)值分類、16SrDNA PCR-RFLP分析和BOX-PCR指紋圖譜分析的方法對北方地區(qū)的甘草根瘤菌進(jìn)行表型、遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，菌株表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。

2.2 RAPD

RAPD技術(shù)不需要專門設(shè)計(jì)序列的引物，且引物的Tm值比較低，能保證寡聚核苷酸引物與模板穩(wěn)定結(jié)合，允許引物和模板適當(dāng)誤配，因此增大了引物在基因組DNA中配對的隨機(jī)性，提高了對DNA的分析效率。王鳴剛等[27]以不同地區(qū)的3種15組甘草(Glycyrrhizauralensis、G.infleta、G.glebra)種子為材料，研究RAPD分子標(biāo)記在甘草親緣關(guān)系中應(yīng)用的可行性，結(jié)果顯示，根據(jù)RAPD聚類分析方法得出15組甘草植物之間的親緣關(guān)系與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果存在差異。吳霞等[28]應(yīng)用RAPD技術(shù)探討新疆產(chǎn)甘草不同地理群體的遺傳多樣性，此研究證明了同一產(chǎn)地栽培種與野生種具有相似的遺傳特性，反應(yīng)了地理環(huán)境對遺傳特性有一定的影響，為不同產(chǎn)地甘草的遺傳特性比較提供了理論基礎(chǔ)。陸嘉惠等[29]應(yīng)用RAPD技術(shù)，探討甘草屬(GlycyrrhizaL.)13種1變種30個(gè)植物類群的遺傳差異和幾個(gè)爭議種的分類地位，結(jié)果顯示，基于RAPD圖譜建立的系統(tǒng)發(fā)育圖與經(jīng)典分類學(xué)有較好的一致性，由此說明RAPD標(biāo)記可為甘草屬的系統(tǒng)分類探究提供分子生物學(xué)依據(jù)。張?jiān)龈５萚30]以甘草種質(zhì)為試材，采用正交試驗(yàn)法設(shè)計(jì)，對影響RAPD-PCR擴(kuò)增的主要因素dNTPs、引物、Taq酶和DNA模板進(jìn)行優(yōu)化篩選，建立了適合甘草分子研究的RAPD-PCR反應(yīng)體系，為不同產(chǎn)地甘草種質(zhì)的分子學(xué)研究提供方法依據(jù)。以上研究可見RAPD技術(shù)在甘草遺傳多樣性和分類學(xué)上起著重要的作用。

2.3 AFLP

AFLP同時(shí)具有RFLP技術(shù)與PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，即可靠性和高效性。周成明等[31]采用AFLP標(biāo)記技術(shù)研究4個(gè)來源甘草屬植物的遺傳基礎(chǔ)，初步探討了AFLP在甘草品系選育中的應(yīng)用，結(jié)果顯示，“民勤1號”“喀什1號”“阿克蘇1號”形成了獨(dú)特的基因構(gòu)成，為烏拉爾甘草優(yōu)良栽培新品種選育研究奠定基礎(chǔ)。葛淑俊等[32]利用AFLP分子標(biāo)記對甘草主產(chǎn)區(qū)的16個(gè)野生種群320個(gè)單株進(jìn)行遺傳多樣性研究，建立了適合野生甘草遺傳多樣性分析的穩(wěn)定的AFLP體系，篩選出15對引物組合對16個(gè)種群320個(gè)單株共擴(kuò)增出759條譜帶。根據(jù)各指標(biāo)顯示，遺傳多樣性水平從高到低順序?yàn)閷幭?、?nèi)蒙古、新疆、黑龍江、山西、甘肅酒泉，此研究得出的信息為甘草遺傳多樣性的保護(hù)和品種選育研究提供參考依據(jù)。楊全等[33]采用cDNA-AFLP(cDNA amplified fragment length polymorphism)[34]方法分析8種變異類型甘草基因表達(dá)的差異，獲得14條差異表達(dá)基因片段，并首次克隆了不同變異類型甘草特異表達(dá)的基因，篩選出了優(yōu)良變異類型，為新品種選育奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為甘草功能基因的研究累積參考數(shù)據(jù)。

2.4 SSR

1974年，Skinner等[35]發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)為-(-T-A-G-G-)n-(A-T-C-C)n的重復(fù)序列。后來研究發(fā)現(xiàn)，這種重復(fù)是真核基因組特有的，并稱之為“簡單重復(fù)”。在眾多分子標(biāo)記中，SSR多態(tài)性豐富、數(shù)目多、分布均勻、具有共顯性以及符合孟德爾遺傳等優(yōu)點(diǎn)，且結(jié)果穩(wěn)定[36-39]。已在許多農(nóng)作物的起源、遺傳圖譜建立、多態(tài)性分析、品種鑒定以及輔助育種等方面有了廣泛的應(yīng)用，并且此技術(shù)穩(wěn)定可靠。劉越等[40]在烏拉爾甘草中開發(fā)功能性EST-SSR分子標(biāo)記，分析烏拉爾甘草EST-SSRs特征，為烏拉爾甘草EST-SSR的遺傳分布規(guī)律提供參考，也為進(jìn)一步開發(fā)烏拉爾甘草功能性EST-SSR標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。李曉嵐等[41]通過烏拉爾甘草表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫搜索甘草屬的SSR位點(diǎn)，并使用Primer3.0軟件設(shè)計(jì)引物，分析來自甘草屬4個(gè)種22份材料的EST-SSR指紋圖譜特征和聚類結(jié)果。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)中開發(fā)的15對引物對甘草屬具有很好的適用性，為甘草的種間親緣關(guān)系、種內(nèi)遺傳多樣性研究以及物種鑒定等提供分子依據(jù)。劉亞令等[42]采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)建立了適合甘草SSR-PCR反應(yīng)的最佳體系，利用優(yōu)化體系對69對SSR引物進(jìn)行了篩選，共篩選出33對在4種藥用甘草中均能有效擴(kuò)增且多態(tài)性較好的SSR引物，為利用SSR標(biāo)記對甘草屬植物的遺傳多樣性分析、分子輔助育種、指紋圖譜構(gòu)建和物種鑒定及野生資源保護(hù)等工作提供技術(shù)支撐。

2.5 ISSR

簡單重復(fù)序列區(qū)間(inter-simple sequence repeat，ISSR)也稱錨定簡單重復(fù)序列(anchored inter-simple sequence repeat，ASSR)，是以微衛(wèi)星為引物的PCR(microsatellite-primed PCR，MP-PCR)，或是在SSR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，用SSR為引物擴(kuò)增重復(fù)序列之間區(qū)的DNA分析技術(shù)。ISSR采用的引物具有更強(qiáng)的專一性，與模板結(jié)合的強(qiáng)度提高，重復(fù)性好，并可揭示比RFLP、RAPD、SSR更多的多態(tài)性，此技術(shù)結(jié)合了RAPD標(biāo)記技術(shù)與SSR標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，耗資少，模板用量少，不需要知道靶標(biāo)序列的SSR背景信息，使用通用引物。孫群等[43]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對不同種源烏拉爾甘草的遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，新疆地區(qū)烏拉爾甘草遺傳多樣性最為豐富，其次是西北地區(qū)，最低的為東北地區(qū)，并證明了基于ISSR分子標(biāo)記劃分的組群與地域性沒有明顯關(guān)系。李貝寧等[44]采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)研究來自4個(gè)產(chǎn)地155個(gè)甘草個(gè)體的遺傳多樣性，結(jié)果表明，各產(chǎn)地野生品基本都能夠各自聚為一類，內(nèi)蒙古、寧夏和甘肅甘草遺傳特征較為穩(wěn)定，陜西甘草的變異幅度較大，說明不同道地產(chǎn)區(qū)甘草的遺傳多樣性具有顯著的地域性特征，且甘草道地藥材的形成具有遺傳基礎(chǔ)。

2.6 DNA條形碼

DNA條形碼是利用具有足夠變異的短基因片段對物種進(jìn)行準(zhǔn)確快速鑒定生物身份的識別系統(tǒng)，能夠快速有效率地鑒別物種，因此得到非常廣泛的應(yīng)用。劉春生[45]在研究3種藥用甘草的ITS序列中發(fā)現(xiàn)脹果甘草和其他甘草種類有1個(gè)堿基差異，烏拉爾甘草和其他甘草種類有3個(gè)堿基差異，并篩選出2個(gè)上游引物，成功鑒別了烏拉爾甘草和脹果甘草。陳士林[46]發(fā)表了3種藥用甘草的ITS2序列峰圖以及條形碼consensus序列及種間序列變異情況，提出將ITS2序列作為甘草的通用DNA條形碼序列。趙月梅等[47]分析了刺果甘草與甘草、苦參、黃芪基原植物編碼核糖體RNA的核基因的ITS2序列的K2P距離，且基于K2P距離構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，都證明了ITS2序列可以準(zhǔn)確鑒定這幾種藥材以及不同基原植物，為甘草等藥材及其混偽品的鑒別提供了新的研究方法。楊瑞等[48]利用PCR擴(kuò)增得到了長度為616 bp的ITS序列和389 bp的psbA-trnH序列，在ITS序列中找到4個(gè)變異位點(diǎn)，且確定了2種ITS單倍型，在psbA-trnH序列中找到3個(gè)變異位點(diǎn)，并確定了4種psbA-trnH單倍型，結(jié)合ITS和psbA-trnH兩個(gè)序列的分析，確定了3種基原甘草的分子鑒定方案。

2.7 其他分子標(biāo)記在甘草中的應(yīng)用

分子標(biāo)記技術(shù)種類很多，除了以上常見的分子技術(shù)外，也有很多用其他方法對甘草做出了研究和探討。艾鵬飛等[49]采用四因素(Taq酶、Mg2+、dNTP、引物)四水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[L16(44)]對甘草進(jìn)行SRAP-PCR試驗(yàn)，電泳結(jié)果采用軟件SPSS分析，退火溫度和引物篩選采用單因子試驗(yàn)，優(yōu)化了SRAP-PCR，反應(yīng)體系為進(jìn)行甘草資源遺傳分析提供了技術(shù)支持。宋鳳等[50]采用SCoT、EST-SSR分子標(biāo)記對甘草屬8個(gè)自然居群的14個(gè)4種1變種個(gè)體進(jìn)行基因組DNA的多態(tài)性檢測，結(jié)果表明，SCoT和EST-SSR兩種標(biāo)記均可揭示甘草屬種間與種內(nèi)的遺傳多樣性水平以及親緣關(guān)系，是進(jìn)行甘草屬植物自然群體的遺傳結(jié)構(gòu)、種間基因漸滲等研究的有效分子標(biāo)記。其中，SCoT標(biāo)記多態(tài)性高，信息量大，更適于甘草屬植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析，個(gè)體間遺傳差異檢測上EST-SSR標(biāo)記效果更佳，更利于疑難種鑒定及親本分析。沈湛云等[51]采用RT-PCR技術(shù)，擴(kuò)增出甘草bAS編碼區(qū)序列，運(yùn)用DNAman分析軟件找出此序列的SNP位點(diǎn)，分析了甘草β-香樹酯醇合成酶(β-amyrin synthas e，bAS)編碼區(qū)SNP與甘草酸含量之間的相關(guān)性。臧藝玫等[52]采用PCR-SSCP和測序組合技術(shù)檢測了6個(gè)產(chǎn)地甘草的β-香樹脂醇合成酶(β-AS)基因的SNP，探索了甘草道地性形成的分子機(jī)制，結(jié)果證明了甘草β-AS基因94位點(diǎn)的SNP可能是導(dǎo)致甘草道地性形成的機(jī)制之一。

3 展望

由于甘草作為大宗藥材之一，應(yīng)用廣泛，需求量很大，人們大量無節(jié)制采挖導(dǎo)致野生甘草資源遭到嚴(yán)重破壞，人工甘草將成為野生甘草的重要替代資源，導(dǎo)致各地方甘草的種植非?；祀s，種源信息不明，影響著甘草的質(zhì)量評價(jià)[53]。近年來，分子標(biāo)記技術(shù)對甘草的道地性研究、品種鑒定、遺傳多態(tài)性分析等方面的研究層出不窮，為甘草基因上的研究做出了很大的貢獻(xiàn)[54]。但在利用此技術(shù)研究甘草時(shí)會有兩個(gè)問題，一是分子技術(shù)的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性；二是實(shí)驗(yàn)樣品的理想性，即甘草樣品收集時(shí)會出現(xiàn)種源信息不準(zhǔn)確，這些問題嚴(yán)重影響著實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果和結(jié)論。為了得到全面準(zhǔn)確的結(jié)果，已有研究者通過多種方法同時(shí)對同一種中藥材進(jìn)行研究[55-56]。目前，對甘草的分子標(biāo)記的引物設(shè)計(jì)及其反應(yīng)條件都在不斷地改善[33，53]，不管是研究樣品資源的收集還是技術(shù)的改進(jìn)都具有進(jìn)一步的發(fā)展價(jià)值。