中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)與腫瘤轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展

張欣偉 王勇 李勇

中性粒細(xì)胞是機(jī)體非特異性免疫中的主要組成成分，不但能抵制并殺滅微生物和病原體，并且在組織修復(fù)中也具有重要作用[1]。然而目前研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞能夠經(jīng)過(guò)多種途徑影響惡性腫瘤的增殖、生長(zhǎng)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最為突出的一種生理學(xué)表現(xiàn), 也是癌癥患者的主要死因。其過(guò)程復(fù)雜，大致包括腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離、降解細(xì)胞外基質(zhì)、進(jìn)入血液循環(huán)、發(fā)生免疫逃逸、侵犯遠(yuǎn)處器官等步驟。有觀點(diǎn)認(rèn)為中性粒細(xì)胞及其有關(guān)成分幾乎參與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的每一過(guò)程[3]，能夠分泌體內(nèi)多種物質(zhì)影響腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲[4-6]。中性粒細(xì)胞在多種刺激因子作用下，向胞外釋放稱為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps, NETs）的一種纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[7]，參與機(jī)體非特異性免疫應(yīng)答。最近NETs的相關(guān)研究大量被報(bào)道，包括炎癥、血栓形成及腫瘤等相關(guān)疾病[8]。最新研究[9]表明NETs除了發(fā)揮固有免疫作用外，與腫瘤的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移也關(guān)系密切，可以通過(guò)多種不同機(jī)制參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程。

1 NETs的構(gòu)成及形成機(jī)制

Brinkmann等[7]在2004年初次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，活化的中性粒細(xì)胞向胞外釋放一種網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，即NETs，該結(jié)構(gòu)能夠捕捉并阻止多種病原體在宿主內(nèi)播散，是一種潛在的殺菌機(jī)制。NETs是由去聚化的染色質(zhì)和多種蛋白顆粒構(gòu)成，除了疏松的DNA骨架外、還有基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase, NE）、組織蛋白酶G（cathepsin G, CG）和髓過(guò)氧化物酶等圍繞并附著[7]。當(dāng)NETs的DNA骨架被脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease, DNase）降解時(shí)，就幾乎喪失了這種胞外殺菌的能力，這表示DNA的纖維骨架是形成NETs不可或缺的重要結(jié)構(gòu)。

NETs由中性粒細(xì)胞死亡后釋放胞內(nèi)物質(zhì)而形成，這種死亡有別于細(xì)胞凋亡和壞死，將這種特殊的方式稱為NETosis[10]。NETosis分為細(xì)胞溶解性和自發(fā)性（囊泡釋放）兩種形式。其中細(xì)胞溶解性的方式進(jìn)程發(fā)生十分遲緩，需要3 h-4 h。形成過(guò)程主要表現(xiàn)為：在相關(guān)的適當(dāng)刺激下，中性粒細(xì)胞的細(xì)胞核變形、染色質(zhì)疏松化，核膜與顆粒膜發(fā)生分離，最后，NETs由于細(xì)胞膜裂解而從細(xì)胞內(nèi)釋放到胞外[10]。此外，有研究認(rèn)為除細(xì)胞裂解方式外，NETs也可以自發(fā)性產(chǎn)生，該過(guò)程獨(dú)特、快速并且不依賴還原型輔酶II（NADPH）氧化物。Florian等觀察到中性粒細(xì)胞可以通過(guò)囊泡運(yùn)輸機(jī)制排出核DNA，參與NETs的形成，無(wú)胞核的中性粒細(xì)胞細(xì)胞膜完整，仍保留吞噬等生理特性[11]。

NETs的形成主要與肽?；彼崦搧啺访?（peptidylarginine deimnase 4, PAD4）和活性氧類（reactive oxygen species, ROS）的調(diào)節(jié)相關(guān)。染色質(zhì)疏松化是NETs構(gòu)成的最具特色的變化，Wang等[12]研究認(rèn)為，PAD4催化組蛋白中的精氨酸實(shí)現(xiàn)瓜氨酸化而導(dǎo)致DNA骨架解螺旋，去聚化的DNA與胞質(zhì)內(nèi)蛋白顆粒相融合，形成疏松的NETs纖維網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)。Li等[13]的研究中除去中性粒細(xì)胞的PAD4基因的小鼠無(wú)法產(chǎn)生NETs，實(shí)驗(yàn)組加入野生型中性粒細(xì)胞，NETs又能夠產(chǎn)生，該研究說(shuō)明PAD4是調(diào)節(jié)NETs形成的一個(gè)重要因素。Kerlsson等[14]證明，佛波酯（phorbol myristate acetate, PMA）加入中性粒細(xì)胞中，可導(dǎo)致NADPH氧化產(chǎn)生ROS，進(jìn)而中性粒細(xì)胞釋放出細(xì)胞核、髓化過(guò)氧化物酶等多種NETs的組成成分。慢性肉芽腫病人的NADPH氧化酶發(fā)生基因突變，難以形成ROS，而無(wú)法激活中性粒細(xì)胞死亡途徑和形成NETs[10]。

2 腫瘤轉(zhuǎn)移與NETs

多數(shù)研究[15,16]發(fā)現(xiàn)，NETs在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。研究[15]發(fā)現(xiàn)，與健康志愿者相比，結(jié)腸癌患者的NETs水平明顯更高，并且術(shù)前刺激引起NETs增加的患者明顯易出現(xiàn)術(shù)后并發(fā)癥，延長(zhǎng)住院時(shí)間。在尤因肉瘤中，具有高水平的NETs患者在強(qiáng)化化療后易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和早期復(fù)發(fā)，預(yù)后較差[17]。這些結(jié)果表明NETs可能作為一個(gè)潛在的預(yù)后標(biāo)志物，也提示NETs能夠通過(guò)某些途徑促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。

腫瘤轉(zhuǎn)移（tumor metastasis）腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)部位，抵達(dá)遠(yuǎn)處組織或器官繼續(xù)增殖生長(zhǎng)的過(guò)程。腫瘤細(xì)胞先離開(kāi)原發(fā)部位，進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）并與之粘附，然后釋放相關(guān)蛋白酶降解ECM穿過(guò)ECM和基底膜后進(jìn)入循環(huán)，在循環(huán)系統(tǒng)中躲避免疫細(xì)胞的監(jiān)視，隨后通過(guò)血管壁到達(dá)繼發(fā)部位，在新生血管形成的環(huán)境下新的轉(zhuǎn)移灶。腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤患者病情的惡性進(jìn)展，對(duì)治療癌癥提出了巨大挑戰(zhàn)。目前，越來(lái)越多的研究證據(jù)表明NETs可以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[9,18,19]。NETs通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)、捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞、破壞血管完整性、誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）及促進(jìn)血管生成等幾個(gè)方面影響腫瘤侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

2.1 NETs降解細(xì)胞外基質(zhì) ECM網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)在腫瘤細(xì)胞侵襲、進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)過(guò)程中相當(dāng)于一個(gè)屏障作用，因此，降解ECM的過(guò)程能夠有效地促進(jìn)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移。研究顯示，NETs中存有的蛋白降解酶可以通過(guò)溶解ECM的方式來(lái)提高腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。MMP-9是NETs的重要組成成分。多項(xiàng)研究[20,21]表示，MMP-9不只在細(xì)胞增殖和凋亡中扮演重要角色，還可以降解ECM成分，為腫瘤細(xì)胞遷移做好通道準(zhǔn)備，加快了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP）對(duì)MMP具有抑制作用，Aoki等[22]研究證明，TIMP通過(guò)抑制MMP-9的活性來(lái)限制腫瘤細(xì)胞降解ECM和侵襲過(guò)程。因此，NETs有可能通過(guò)其成份MMP-9降解ECM參與腫瘤轉(zhuǎn)移。

研究[23,24]顯示，NETs中的NE與金屬蛋白酶具有協(xié)同作用，并且能夠降解蛋白抑制物。Wislez等[23]研究中性粒細(xì)胞在肺腺癌轉(zhuǎn)移中的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，NE可以作為中心粒細(xì)胞膜的結(jié)合分子與癌細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)而加快腫瘤細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CG具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用[25,26]，但目前對(duì)于NETs中NE和CG在腫瘤轉(zhuǎn)移的具體作用機(jī)制卻鮮有報(bào)道，仍需更多試驗(yàn)研究去進(jìn)行深入了解。

2.2 NETs捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞 循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell, CTC）是指從原發(fā)部位或轉(zhuǎn)移灶脫落，進(jìn)入血液循環(huán)而逃脫機(jī)體免疫攻擊的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)血液游走、粘附后定植于遠(yuǎn)處器官，生長(zhǎng)、增殖，逐步形成腫瘤轉(zhuǎn)移灶。研究[27]證實(shí)CTC在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要臨床意義，可以作為多種轉(zhuǎn)移癌癥的預(yù)后標(biāo)志物。研究表明，NETs能夠通過(guò)捕獲CTC，從而促進(jìn)黏附作用、實(shí)現(xiàn)免疫逃逸等多個(gè)途徑參與腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制。

2.2.1 NETs利于CTC黏附 NETs的去聚集狀態(tài)、立體的DNA纖維狀網(wǎng)絡(luò)能夠有效捕獲循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞，并幫助CTC錨定在組織，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞粘附于組織的數(shù)量增加[19]，而腫瘤細(xì)胞的粘附機(jī)制在腫瘤轉(zhuǎn)移途徑中極其重要，故NETs可以通過(guò)捕獲CTC利于其粘附組織而促進(jìn)轉(zhuǎn)移[9,19,25]。Cools-Lartigue等[19]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)熒光共聚焦試驗(yàn)證實(shí)并且在掃描電子顯微鏡下直接觀察到，在PMA刺激下，中性粒細(xì)胞在A549肺癌細(xì)胞周圍產(chǎn)生網(wǎng)狀DNA結(jié)構(gòu)，NETs的網(wǎng)狀DNA結(jié)構(gòu)通過(guò)與A549肺癌細(xì)胞的細(xì)胞膜直接接觸，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在組織上粘附從而發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移；并且這種粘附作用可在DNase作用下被消除。而中性粒細(xì)胞并不能直接與腫瘤細(xì)胞接觸，這提示CTC粘附于組織的機(jī)制主要與NETs的網(wǎng)狀DNA誘捕功能有關(guān)[19]。

NETs除了具有促進(jìn)CTC粘附于組織的作用，也可直接促進(jìn)CTC對(duì)血管壁的粘附。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[28]表明，NETs捕獲腫瘤細(xì)胞后使其粘附于血管壁，進(jìn)一步破壞內(nèi)皮細(xì)胞，可以使血管的滲透性增加，腫瘤細(xì)胞突破血管壁抵達(dá)遠(yuǎn)隔器官形成新轉(zhuǎn)移灶。Najmeh等[29]研究發(fā)現(xiàn)，β1-integrin在介導(dǎo)NETs與CTC相互粘附的過(guò)程中具有重要作用。通過(guò)構(gòu)建肺癌小鼠模型模擬術(shù)后炎癥環(huán)境發(fā)現(xiàn)，炎癥狀態(tài)下β1-integrin表達(dá)上調(diào)，肺腺癌細(xì)胞粘附NETs的數(shù)量明顯增加，并且這種效應(yīng)可通過(guò)使用DNase或PAD4抑制劑所消除。其他研究[30]也證實(shí)，在手術(shù)應(yīng)激狀態(tài)下，能夠誘發(fā)機(jī)體NETs的產(chǎn)生，促進(jìn)CTC的粘附和微小轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng)。

2.2.2 NETs促進(jìn)免疫逃逸 CTC在轉(zhuǎn)移過(guò)程中進(jìn)入血液循環(huán)不一定能夠存活，免疫系統(tǒng)能夠?qū)ρh(huán)腫瘤細(xì)胞監(jiān)視并進(jìn)行殺滅，因此，躲避免疫系統(tǒng)監(jiān)視是腫瘤轉(zhuǎn)移的形成的重要過(guò)程。多數(shù)研究認(rèn)為NETs可以促進(jìn)免疫逃逸[15,31]。在血液循環(huán)中，NETs可以網(wǎng)捕并錨定CTC，在免疫細(xì)胞和CTC之間形成一道不易穿過(guò)的物理屏障[32]；同時(shí)，NETs和溶解后相關(guān)成分阻止免疫細(xì)胞在機(jī)體中的生理作用，因此免疫系統(tǒng)對(duì)循環(huán)中腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺死能夠被躲避[25,32]。

2.3 NETs改變血管完整 血管的完整性的維持和穩(wěn)固主要依靠于血管的內(nèi)皮細(xì)胞緊密的相互連接，完好的血管壁對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移起到了屏障作用。血管內(nèi)的NETs通過(guò)破壞內(nèi)皮細(xì)胞之間的正常連接提高局部血管滲透性，破壞完整性，使腫瘤細(xì)胞更易溢出，利于種植到遠(yuǎn)隔器官并形成微小轉(zhuǎn)移灶[33]。Pieterse等[34]報(bào)道VE-cadherin在參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的銜接與穩(wěn)固具有重要功能，NETs相關(guān)蛋白酶通過(guò)引起VE-cadherin表達(dá)下調(diào)進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞與細(xì)胞之間連接完整性破壞，造成血管泄漏，導(dǎo)致大量腫瘤細(xì)胞突破血管壁的基底膜流至循環(huán)系統(tǒng)。

2.4 NETs誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 EMT是內(nèi)皮細(xì)胞失去細(xì)胞頂端極性而轉(zhuǎn)變成間質(zhì)細(xì)胞表型的過(guò)程。EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移中具有重要地位，它顯著提高了腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)移和侵襲能力。在體內(nèi)，微循環(huán)中的NETs能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，促使內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞機(jī)制將NETs攝入細(xì)胞內(nèi)，胞內(nèi)的NETs能夠使β-catenin的核移位，并導(dǎo)致細(xì)胞間連接蛋白VE-cadherin表達(dá)下調(diào)而促使EMT的發(fā)生，同時(shí)，這一機(jī)制也有利于被NETs捕獲的腫瘤細(xì)胞向組織內(nèi)轉(zhuǎn)移[34]。另外，NETs誘導(dǎo)EMT過(guò)程也依賴于蛋白水解酶的活性。其他研究結(jié)果表明，MMP-9表達(dá)上調(diào)除了可以降解ECM，也能夠促進(jìn)EMT的進(jìn)程和腫瘤細(xì)胞的侵襲作用[35]。

2.5 NETs促進(jìn)血管生成 研究[36]表明，惡性腫瘤需要了擁有血管生成能力才能發(fā)生惡性生長(zhǎng)增殖和完成轉(zhuǎn)移。故腫瘤轉(zhuǎn)移灶的順利產(chǎn)生離不開(kāi)血管生成。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是一種具備多功能的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能夠加快血管內(nèi)皮移動(dòng)、提高血管滲透性及促進(jìn)血管生成等，是參與腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素。研究[37]發(fā)現(xiàn)，NETs中的多種成分可以通過(guò)影響VEGF的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管生成。Bergers等[38]發(fā)現(xiàn)在胰腺癌的轉(zhuǎn)基因小鼠中毛細(xì)血管的血管開(kāi)關(guān)處于靜止?fàn)顟B(tài)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MMP-9通過(guò)刺激VEGF去激活血管開(kāi)關(guān)，促進(jìn)血管生成。NETs中也存MMP-9，多數(shù)證據(jù)表明MMP-9除了可降解ECM，還可進(jìn)一步影響血管生成和提高腫瘤侵襲能力[9,31,37]。另外，Wilson等[26]認(rèn)為CG不僅具有降解ECM的功能，而且能夠刺激VEGF來(lái)促使新生血管產(chǎn)生，使轉(zhuǎn)移灶擁有豐富營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)而繼續(xù)生長(zhǎng)；在體內(nèi)骨髓侵襲模型的小鼠中加入CG抑制劑，與對(duì)照組相比，加入CG抑制劑的實(shí)驗(yàn)組微血管血管密度明顯減少，由此證明CG對(duì)血管生成具有促進(jìn)作用。研究[37]發(fā)現(xiàn)，NETs的成分NE不僅可以降解蛋白酶抑制物來(lái)發(fā)揮促轉(zhuǎn)移效應(yīng)，也能夠通過(guò)激發(fā)VEGF的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和血管生成等多重作用。NETs中多種蛋白成分對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移作用仍值得進(jìn)一步研討。在手術(shù)刺激下，NETs能導(dǎo)致庫(kù)普弗細(xì)胞排出TNF-α、IL-6、CXCL-10等多種細(xì)胞因子和趨化因子[39]，這些因子都對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)效應(yīng)。研究[40]認(rèn)為TNF-α在腫瘤微環(huán)境中可以促進(jìn)髓樣祖細(xì)胞分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起血管生成；不少證據(jù)闡明IL-6能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、刺激血管生成等途徑，顯著地加快惡性腫瘤的進(jìn)展并促進(jìn)其轉(zhuǎn)移[41]；CXCL-10不僅是鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤中一個(gè)自分泌侵襲因子[42]，而且在結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移中也具有促進(jìn)作用[43]。

3 總結(jié)

NETs是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，尤其在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用值得關(guān)注，研究表明NETs與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)并具有重要的臨床研究?jī)r(jià)值。NETs能夠通過(guò)不同機(jī)制去參與并促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移途徑，但當(dāng)前相關(guān)的實(shí)驗(yàn)和研究報(bào)道非常有限，僅僅局限在表淺機(jī)制的探討。因此，深入具體作用機(jī)制的了解仍有待更進(jìn)一步研討與補(bǔ)充。在惡性腫瘤實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用脫氧核糖核酸酶或PAD4抑制劑等藥物，能夠阻止NETs的形成進(jìn)而消除NETs促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的效應(yīng)。因此，深入探究NETs及其抑制劑在腫瘤治療中的作用具有一定臨床研究前景。但是，NETs是否能夠成為治療癌癥的新靶點(diǎn)，仍需要大量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究和探討。