文/王玉堂
作者單位:全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站 中國水產(chǎn)學(xué)會(huì)
用藥指導(dǎo)
上接2018年12期
漁用疫苗是通過接種對(duì)象體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答達(dá)到預(yù)防疾病效果的,因而,有可能因接種對(duì)象自身不夠健康而不能達(dá)到預(yù)期的免疫效果。因此,要使?jié)O用疫苗最大限度地發(fā)揮效果,平時(shí)合理的飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生管理是重要的基礎(chǔ)因素。漁用疫苗只有正確使用才能達(dá)到預(yù)期效果。目前,漁用疫苗的免疫接種途徑主要有如下四種:
目前,國內(nèi)外漁用疫苗以注射接種法為主。注射免疫接種根據(jù)接種部位不同,又可分為皮下注射、肌肉注射和腹腔注射3種。其中腹腔注射接種是弧菌疫苗免疫接種最常用的方法。
魚類皮下注射難度較大,國內(nèi)一般采用肌肉注射和腹腔注射。肌肉注射一般采用背鰭基部注射,注射劑量控制在每尾親魚0.1mL~0.2mL,方法為與魚體呈30°~40°,向頭部方向插入注射器針頭,進(jìn)針深度約為0.3cm,根據(jù)魚體大小以不傷及脊椎骨而定。采取肌肉注射疫苗一般以易吸收、無佐劑為宜,否則易形成腫塊,影響魚體正常代謝。腹腔注射,將針頭沿腹鰭基部內(nèi)側(cè)進(jìn)針,斜向胸鰭方向進(jìn)入,與魚體呈30°~40°,向頭部方向進(jìn)針,進(jìn)針深度依魚體大小而定。有的地區(qū)習(xí)慣用胸腔注射,從胸鰭內(nèi)側(cè)基部插入,不過,個(gè)體較小的魚不適用于這種方法。如技術(shù)熟練,采用腹腔注射或胸鰭注射法藥液不易流出,比肌肉注射效果好。
國內(nèi)比較成熟的注射用水產(chǎn)疫苗是珠江水產(chǎn)研究所研制的草魚出血病滅活疫苗,2010年12月獲得國家一類新獸藥證書(證書號(hào):(2010)新獸藥證字51號(hào)),2011年3月獲得生產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào)[(2011)190986013],該疫苗的特點(diǎn)是用量少、效價(jià)高、保護(hù)力強(qiáng)、免疫產(chǎn)生期快、免疫期長、使用安全方便,克服了組織苗(土法疫苗)效果不穩(wěn)定和細(xì)胞滅活疫苗免疫期短的缺點(diǎn)。主要應(yīng)用于養(yǎng)殖草魚的免疫防病,使用濃度為10-2IU/mL,注射劑量0.2mL,免疫時(shí)效1年,免疫保護(hù)率最高可達(dá)100%。
注射法能夠保證適量的抗原準(zhǔn)確地進(jìn)入受體魚體內(nèi),具有用量少和免疫效果好的優(yōu)點(diǎn),但由于注射免疫需將魚從池中撈出,費(fèi)時(shí)、費(fèi)工、增加勞動(dòng)強(qiáng)度,在大規(guī)模養(yǎng)殖情況下不易推廣使用。另外,操作人員在注射前應(yīng)了解魚體內(nèi)臟器官的位置,避免在注射時(shí)損傷魚的內(nèi)臟器官,這也在一定程度上限制了疫苗的推廣應(yīng)用。
Amend等于1976年首次采用浸泡法進(jìn)行魚類免疫接種,并采用組織切片法證實(shí)了BSA已經(jīng)進(jìn)入魚體,從而開創(chuàng)了浸泡免疫的先河。隨后,Cror和Amend(1977)用稀釋的弧菌苗直接浸泡免疫大馬哈魚又獲成功。Austin采用浸泡法免疫預(yù)防日本鰻鱺弧菌病均獲成功。Sakai等報(bào)道,用鰻弧菌溶液浸泡免疫虹鱒后,其抗鏈球菌的LD50提高了12倍。Gould等1978年開始采用噴霧免疫,但直到目前為止,對(duì)疫苗進(jìn)入魚體的機(jī)制尚不了解,免疫原是以可溶性狀態(tài)還是以顆粒狀態(tài)進(jìn)入魚體內(nèi)尚存在很大爭議。隨著對(duì)魚體免疫作用機(jī)理的深入研究,會(huì)找到更為便捷有效的疫苗給予途徑。
影響浸泡免疫抗原攝取的因素有許多,如疫苗的濃度、浸泡時(shí)間的長短、魚的大小、佐劑的使用、抗原存在的物理狀態(tài)(顆料狀或可溶性)、水溫等。在這些因素中,抗原的濃度和浸泡時(shí)間的長短對(duì)于抗原的攝入和保護(hù)作用是最為重要的。一般來說,短時(shí)間浸泡的方法效果較差。Thume和Plum(2000)用滲浸泡的方法證明BSA的攝取隨著浸泡時(shí)間的延長而提高,但是,F(xiàn)ender和Amend(2002)則發(fā)現(xiàn),BSA的攝取受到高鹽濃度和時(shí)間的限制,疫苗濃度和浸泡時(shí)間的相互關(guān)系是很復(fù)雜的,并受到抗原類型的影響。Tatner等(1998)曾對(duì)影響浸泡免疫的因素做過研究,采用鰻弧菌疫苗浸泡免疫虹鱒,發(fā)現(xiàn)浸泡時(shí)間超過10秒鐘時(shí),疫苗的吸收量并不隨著時(shí)間的延長而增加,并且,疫苗的吸收量與溫度、魚體的大小有關(guān)。Teruyuki(2002)研究發(fā)現(xiàn)了一種新的免疫給予方式,即利用專門的穿刺接種器,使受體魚在疫苗容器中短時(shí)間浸泡的同時(shí),在魚體兩側(cè)進(jìn)行多孔穿刺處理,2周后感染實(shí)驗(yàn)表明,其免疫效果可完全等同于注射免疫。ZHOU等(2000)利用超聲波疫苗浸泡免疫青石斑魚,免疫效果與腹腔注射效果相當(dāng),且操作方便。國內(nèi)外一些科研工作者試圖使用佐劑來提高魚類浸泡免疫效果的研究,發(fā)現(xiàn)佐劑能非特異性地增強(qiáng)哺乳動(dòng)物和禽類的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和延長免疫應(yīng)答的時(shí)間,但其對(duì)魚類的免疫應(yīng)答有無影響仍有爭議。多數(shù)人認(rèn)為,在注射疫苗中,佐劑能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞的活性,增加抗體的產(chǎn)生,從而能夠增強(qiáng)免疫效果。羅霞等(2007)利用佐劑提高浸泡免疫效果的研究中發(fā)現(xiàn),嗜水氣單胞菌滅活疫苗浸泡免疫后,鱖添加佐劑(IMS1312、葡聚糖、莨菪堿、食鹽)可以提高魚粘液及血清中抗體滴度和相對(duì)免疫保護(hù)率,其中添加IMS1312組的免疫保護(hù)效果最好,達(dá)77.8%。
浸泡和噴霧方法操作方便,尤其適用于魚苗的大規(guī)模大量接種,成為目前魚類免疫接種中最常用的免疫方法之一,并逐漸向生產(chǎn)領(lǐng)域推廣應(yīng)用。近年來,中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所先后分離并確認(rèn)了致病性弧菌100余株,提取了6種病原菌的4種亞單位成份,克隆3種亞單位基因并表達(dá),對(duì)提取和表達(dá)的亞單位成份免疫特性進(jìn)行了分析。獲取的各亞單位成份制備的疫苗免疫保護(hù)性測定,浸泡免疫保護(hù)率為50%~86.7%。生產(chǎn)性應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果顯示:免疫組比對(duì)照組提高成活率5%~37.1%,免疫海水魚類養(yǎng)殖狀態(tài)更趨良好,普遍呈生長穩(wěn)定、發(fā)病少等特點(diǎn)。
Duffj首次應(yīng)用滅活的殺鮭氣單胞菌口服免疫硬頭鱒獲得成功,開辟了魚類免疫新途徑,為控制魚類微生物感染問題提供了新思路。口服免疫不受時(shí)間、地點(diǎn)和魚體大小的限制,具有方便、省時(shí)、省力、少脅迫作用等優(yōu)點(diǎn),對(duì)魚體也無傷害。與其它免疫接種方法相比,口服法免疫更適合大規(guī)模的養(yǎng)殖魚群,尤其適用于多次重復(fù)免疫操作,不會(huì)造成魚體的應(yīng)激反應(yīng)。但對(duì)于口服法免疫接種的效果,不同的研究者有不同的結(jié)論,有人認(rèn)為有效,也有人的研究結(jié)果恰恰相反。Muroga等(1969)用V.anguillarumPB-15菌株的活菌和經(jīng)0.01%硫酸亞汞滅活菌苗拌餌對(duì)日本鰻鱺每日投喂1次,連續(xù)投喂4個(gè)月后,用活疫苗對(duì)免疫組和對(duì)照組日本鰻鱺注射攻毒,結(jié)果表明,投喂組顯示出了較弱的保護(hù)力。這主要是魚類口服疫苗在實(shí)際應(yīng)用中易被胃腸道蛋白酶的消化,因此,探索一種有效的載體投遞系統(tǒng),能避免蛋白疫苗受胃腸道消化酶及酸環(huán)境的影響。采用海藻酸鹽、PLGA、PELA等可生物降解高分子材料包裹鰻弧菌、溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌等全菌疫苗,口服免疫虹鱒、鱸魚、中華鱉、草魚與銀鯽等均獲得良好的免疫效果??诜⑶蚓忈屢呙绲难芯恳呀?jīng)開始,魚用疫苗口服給予途徑的研究又有了新進(jìn)展,其研究方向是,建立一種能在飼料和水生動(dòng)物胃腸道中保持疫苗抗原穩(wěn)定性的系統(tǒng),尋求簡單、經(jīng)濟(jì)、有效的接種方式。張小江等(2008)采用可微生物降解的合成高分子聚DL-乳酸-聚乙二醇共聚物(DL-polylactide-copolyethyene glycoLPELA),包裹哈維氏弧菌(Vidrio harveyi,Vh)重組外膜蛋白OmpK后,制備成PELA-OmpK微球,口服免疫斜帶石斑魚后的相對(duì)保護(hù)率為62.5%,顯著高于口服OmpK蛋白組(12.5%)。
目前,英國水產(chǎn)養(yǎng)殖公司(AVL)已開發(fā)出Apua Vac抗弧菌口服疫苗和Apua Vac ERM(Enteric Redmouth Disease)口服疫苗??够【诜呙缰饕糜陬A(yù)防鰻弧菌所致的弧菌病,在希臘已獲許可證,為海鯛的提升免疫力疫苗,該疫苗可能對(duì)北歐養(yǎng)殖的鱈魚非常有用,現(xiàn)北歐正在試驗(yàn)??笶RM口服疫苗主要用于預(yù)防魯氏耶爾森氏菌所致的腸紅嘴病。日本預(yù)防鰤魚α,α溶血性鏈球菌癥的滅活疫苗也是通過口服接種,具體做法是:把疫苗充分搖勻后對(duì)平均體重100g~400g的魚體,每日按10mL/kg(體重)的用量將疫苗混合在飼料中,連續(xù)投喂5天。我國漁用口服疫苗的研究工作起步較晚,目前還在試驗(yàn)階段。
漁用疫苗的研究工作正在全世界范圍內(nèi)蓬勃發(fā)展,隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展,漁用疫苗的使用也呈快速發(fā)展勢頭,因?yàn)槠浒踩咝?,易于施予,不?huì)引起水產(chǎn)品質(zhì)量安全問題等。
草魚是我國的“四大家魚”之一,也可謂是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖第一魚,是從南到北、從東到西的主要養(yǎng)殖品種,2015年的養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)568萬噸。因草魚發(fā)病嚴(yán)重,且難治愈,本世紀(jì)初的草魚養(yǎng)殖過程中,從苗種到成魚的成活率只有30%左右。所以,為提高草魚的養(yǎng)殖成活率,早在上世紀(jì)80年代,我國就開始了草魚疫苗的研制,到2015年前后,我國南方部分省市如廣東等在魚種放養(yǎng)時(shí)普遍注射疫苗,已將草魚的成活率提高到了80%以上。
隨著我國第一個(gè)漁用疫苗——“草魚出血病活疫苗(GCHV-892株)”的研制成功,注射疫苗的范圍不斷擴(kuò)大,現(xiàn)多個(gè)省份推廣注射疫苗都取得較好效果。目前我國已應(yīng)用于草魚的疫苗主要有:土法組織苗、出血病弱毒活疫苗、出血病滅活疫苗及細(xì)菌性爛鰓病、赤皮、敗血癥三聯(lián)苗等,但多數(shù)疫苗還處于中試和示范應(yīng)用階段,尚無明確的使用、操作技術(shù)規(guī)范等?,F(xiàn)以草魚為例介紹魚類免疫操作的基本要求、程序及注意事項(xiàng)等。
頭腎作為草魚的主要免疫器官,在65日齡后的組織形態(tài)發(fā)育與成魚接近,草魚的體長一般在孵化出膜后的1個(gè)~2個(gè)月內(nèi)可長至10cm左右,因此,對(duì)草魚魚種的免疫注射應(yīng)在其體長10cm以上的當(dāng)年或隔年魚種上進(jìn)行,且要求魚種健康,質(zhì)量符合GB11776—2006標(biāo)準(zhǔn)要求。出現(xiàn)下列任何癥狀時(shí),均不可進(jìn)行免疫操作:游泳無力,頭部及體色發(fā)黑,尾鰭末端發(fā)白,口腔、鰓蓋、鰭條、肌肉充血,眼睛下陷,鰓絲腐爛,體表局部出血發(fā)炎,鱗片脫落,“蛀鰭”,肛門紅腫,腸道充滿白色的絳蟲,肝膽綜合癥,隱性帶毒,未經(jīng)密集鍛煉和消毒,處于“浮頭”狀態(tài)。
區(qū)域使用的疫苗應(yīng)是經(jīng)由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)的獸藥GMP證書的生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn),并通過安全檢驗(yàn)合格和有效,包裝完整,注有標(biāo)號(hào)、說明、出廠日期和保存期等標(biāo)識(shí)的產(chǎn)品,須符合獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或水產(chǎn)行業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。疫苗瓶標(biāo)簽上應(yīng)標(biāo)定可免疫的特定年齡魚種、免疫途徑、一次接種疫苗量等。根據(jù)區(qū)域流行病學(xué)調(diào)查確定的病原種類、血清型的檢測結(jié)果,選擇相應(yīng)的疫苗。當(dāng)前已上市的疫苗可用于各種養(yǎng)殖場所所養(yǎng)殖的草魚。
疫苗由其生產(chǎn)單位根據(jù)疫苗使用說明書規(guī)定的保存溫度入庫,并按生產(chǎn)批號(hào)的前后有序存放,以先進(jìn)先出的原則發(fā)放。各區(qū)域根據(jù)當(dāng)?shù)夭蒴~免疫注射時(shí)間提前向疫苗供應(yīng)單位提交疫苗使用計(jì)劃,供苗單位根據(jù)區(qū)域使用計(jì)劃提供疫苗。疫苗運(yùn)輸途中采用箱壁厚度為3cm~4cm的泡沫箱作為保溫包裝,內(nèi)放冰塊,保證72小時(shí)內(nèi)到達(dá)使用地時(shí)箱內(nèi)溫度小于20℃。疫苗的接收單位應(yīng)仔細(xì)檢查疫苗外包裝是否完好,標(biāo)簽和說明書是否一致,保溫箱內(nèi)溫度是否符合要求,疫苗瓶蓋是否嚴(yán)密而緊實(shí)、無破裂、未過期或污染等。不同劑型的疫苗應(yīng)在適當(dāng)溫度條件下保存:滅活水劑等保存溫度為2℃~8℃,弱毒凍干苗等保存溫度-10℃~20℃,同時(shí)要避光。在允許的保存期內(nèi),草魚出血病活疫苗應(yīng)保持疏松的固體狀態(tài),嗜水氣單胞菌滅活疫苗不應(yīng)有搖動(dòng)不散的絮狀物或凝集塊沉淀,無惡臭或霉變現(xiàn)象。
1.口服免疫
口服免疫的發(fā)展相對(duì)滯后,目前還處于理論研究階段,現(xiàn)階段國內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)均沒有商業(yè)化的口服疫苗應(yīng)市。口服免疫時(shí),所用疫苗必須是活疫苗,按動(dòng)物頭(只)數(shù)計(jì)算采食量,停喂半天,然后按實(shí)際頭(只)數(shù)采食量的150%~200%量加入疫苗于飼料中,以保證喂疫苗時(shí),每個(gè)動(dòng)物個(gè)體能攝入一定量的飼料,從而獲得充分免疫。
2.浸泡免疫法
浸泡免疫是水生動(dòng)物中魚類特有的免疫方法,主要針對(duì)1齡以內(nèi)的小規(guī)格批量魚種免疫而推介的生物制品。其原理是通過魚體皮膚或口服接觸疫苗而接受免疫接種,可使苗種產(chǎn)生抗體,增強(qiáng)苗種的群體免疫功能。其特點(diǎn)是使用方便,方法簡單,能避免一魚一針注射的繁瑣操作過程。每年秋末至翌年3月初,當(dāng)水溫穩(wěn)定在10℃~15℃時(shí)即可進(jìn)行浸泡免疫接種,將浸泡疫苗倒入免疫容器中,按說明書要求放入清水,攪拌均勻,并加入少許食鹽攪拌均勻,每次按浸泡苗種數(shù)量配制疫苗,每條魚所用的疫苗量以說明書為準(zhǔn);浸泡時(shí)間為20分鐘~25分鐘,浸泡期間需持續(xù)充氧,并設(shè)專人現(xiàn)場監(jiān)督,如果魚苗出現(xiàn)嚴(yán)重應(yīng)激反應(yīng),應(yīng)馬上停止浸泡。浸泡接種后的苗種必須在12℃~18℃水溫中飼養(yǎng)20天以上,以提高接種免疫保護(hù)率。在浸泡接種過程中,要防止水溫急劇上升,使受免疫魚種發(fā)生急性感染而發(fā)病。對(duì)于用過的疫苗液,可在疫苗液中加入一定量的生石灰或強(qiáng)氯精,浸泡1小時(shí)以上來進(jìn)行無害化處理。
3.注射免疫法
注射免疫法是目前國內(nèi)草魚免疫的主要方法,有腹腔注射和背部肌肉注射兩種。腹腔注射時(shí),在魚的腹鰭基部或胸鰭基部腹腔處進(jìn)針,針頭與魚體呈45度角斜刺入魚腹,進(jìn)針深度為0.4cm~0.5cm;肌肉注射時(shí),在魚有背鰭肌肉處進(jìn)針,針頭與魚體呈45度角斜向刺入,進(jìn)針深度為0.4cm~0.5cm。注射免疫操作時(shí),要在池塘中開啟增氧機(jī)增氧,或?qū)⒓~網(wǎng)箱移到有流水處,以保證有充足的溶氧。注射免疫劑量以說明書為準(zhǔn)。在高溫季節(jié)或魚較活躍的情況下注射疫苗時(shí),應(yīng)先將魚種進(jìn)行麻醉,一般每次麻醉魚種80尾左右,在5分鐘~8分鐘內(nèi)注射完畢。注射時(shí)要搖勻疫苗液,一支注射器只能用于一種疫苗的注射,不得與其它疫苗注射混用或重復(fù)使用,吸出的疫苗不得回注瓶內(nèi),針筒排氣溢出的疫苗應(yīng)用酒精棉球吸掉。使用過的疫苗空瓶、酒精棉、一次性注射器以及廢棄疫苗,應(yīng)及時(shí)進(jìn)行生物安全處理,用100℃水浴處理20分鐘。
免疫前的準(zhǔn)備工作主要有以下幾點(diǎn):一是徹底清塘消毒??衫枚靖商敛遏~之機(jī)進(jìn)行徹底的清塘消毒。二是準(zhǔn)備接種器械和藥品。洗凈并消毒塑料盤(直徑60cm)、捕魚網(wǎng)、盛魚盆以及注射器、針頭、疫苗稀釋瓶等所有器具(高壓滅菌或水浴蒸煮消毒20分鐘);準(zhǔn)備鹽酸丁卡因或含量90%的晶體敵百蟲作為魚體麻醉劑(也可用其它麻醉劑),2%~3%食鹽水或用10mg/L漂白粉加8mg/L硫酸銅作為魚體消毒劑;一般選用連續(xù)注射器,以減少注射器加液的麻煩,為防止進(jìn)針太深而傷及魚體,可將針頭磨短至0.5cm~0.6cm,或在針頭根部套上一小截塑料管而只露出0.5cm~0.6cm的針頭;體長10cm~13cm的魚種可選用5號(hào)針頭,體長17cm以上的魚種應(yīng)選用6或7號(hào)針頭。三是待免疫苗種的選擇。待接受免疫的草魚苗種應(yīng)為健康苗種:體色正常、體型較好、無病無傷、游動(dòng)活潑、規(guī)格均勻,并應(yīng)抽樣檢查無特定病原。苗種選擇好后,在注射免疫前1天投喂日投餌量的50%,第2天停食,第3天拉網(wǎng)鍛煉,第4天在拉網(wǎng)鍛煉后移入集魚網(wǎng)箱中,適當(dāng)密集1小時(shí)~2小時(shí),用2%~3%的食鹽水浸浴5分鐘或用10mg/L的漂白粉加8mg/L硫酸銅溶液藥浴10分鐘~20分鐘,以殺滅魚種體表的細(xì)菌和寄生蟲等,具體浸泡消毒時(shí)間應(yīng)視養(yǎng)殖種類、水溫高低、藥物濃度、苗種體質(zhì)等而靈活掌握。四是稀釋疫苗。按說明書要求配制,疫苗宜現(xiàn)配現(xiàn)用,剩余疫苗不再使用。五是麻醉魚種。魚種接種疫苗前要先將魚種麻醉。
草魚是變溫動(dòng)物,免疫應(yīng)答在水溫10℃以下受到抑制,對(duì)疫苗的免疫臨界溫度在10℃。在免疫臨界溫度以上,免疫應(yīng)答隨水溫的升高而增強(qiáng),但當(dāng)水溫超過32℃,其應(yīng)答反應(yīng)反而下降。因此,草魚的免疫適宜溫度為10℃~28℃。生產(chǎn)上一般選擇在魚種放養(yǎng)時(shí)進(jìn)行免疫操作,此時(shí)的水溫約為10℃~28℃,較為適宜,但活疫苗要求10℃~20℃的水溫環(huán)境。高溫季節(jié)免疫時(shí),要選擇在清晨及通風(fēng)、陰涼處進(jìn)行。
草魚出血病活疫苗(GCHV-892株)一年免疫接種一次即可,而嗜水氣單胞菌滅活疫苗、草魚出血病滅活疫苗根據(jù)產(chǎn)品說明書使用,組織漿疫苗一般一年接種2次~3次。免疫操作按說明書進(jìn)行。
免疫后的管理工作主要有以下幾點(diǎn):一是免疫后觀察與放養(yǎng)。免疫接種后30分鐘內(nèi),應(yīng)注意觀察魚種的活力、狀態(tài)等有無異常。免疫注射后的麻醉魚種要暫養(yǎng)于池塘中的網(wǎng)箱內(nèi),等魚種復(fù)蘇恢復(fù)游泳能力后方可放養(yǎng),不得在注射免疫操作的池塘邊放養(yǎng)。注射免疫后的魚種停食1天,并將待放養(yǎng)魚種的池塘消毒1次。二是科學(xué)投喂,魚種放養(yǎng)后,按“四定”原則投喂。三是做好水質(zhì)管理和調(diào)節(jié)工作。四是及時(shí)殺滅寄生蟲。五是認(rèn)真做好日常工作管理工作。