Exosomes在骨代謝疾病中作用的研究進(jìn)展

高坤 朱文秀 李全 李亨 余偉吉 王立新 曹亞飛*

1.深圳市中醫(yī)院骨傷科，廣東 深圳 518000 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518100

骨代謝疾病尤其是骨質(zhì)疏松癥是高發(fā)的老年疾病之一，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。骨代謝過程中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞扮演重要的角色。調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在分化礦化方面的平衡是治療類似于骨質(zhì)疏松癥的系統(tǒng)性骨代謝疾病的先決條件[1]。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間存在信息交流機(jī)制，該機(jī)制錯綜復(fù)雜，大量的信號分子、細(xì)胞因子參與調(diào)控。深入研究不同信號分子的調(diào)控作用對于骨代謝疾病的診斷和治療具有重要的臨床意義。

外泌體(Exosomes)是細(xì)胞內(nèi)部的胞內(nèi)體與細(xì)胞膜融合釋放到細(xì)胞外，直徑大小為30～120 nm的膜性囊泡[2]。在過去的幾年中，這些納米級別的顆粒已經(jīng)在癌癥進(jìn)展、免疫應(yīng)答、藥物載體的研究方面取得了顯著的成果，但在骨代謝疾病方面研究匱乏。Exosomes可以轉(zhuǎn)運基因物質(zhì)以進(jìn)行細(xì)胞與細(xì)胞之間的交流，能夠從新的角度揭示疾病的發(fā)病機(jī)制，從而為疾病的診斷治療提供新的思路。近期有部分研究人員對骨代謝相關(guān)Exosomes進(jìn)行了研究，包括成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)等，取得了一些研究成果。因此，本文對Exosomes在骨代謝過程中的作用及角色進(jìn)行總結(jié)及分析，以期能夠?qū)谴x疾病的基礎(chǔ)研究和臨床防治提供新的方向和參考。

1 Exosomes的定義

大部分的真核細(xì)胞都能分泌具有細(xì)胞間交流能力的胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)，這些不均勻封閉的膜結(jié)構(gòu)具有影響臨近和遠(yuǎn)處細(xì)胞的能力。根據(jù)起源及生物特性可以將胞外囊泡分為3類：凋亡小體(apoptotic bodies)、微粒(microvesicles)和外泌體(exosomes)[2]。1970年Rose Johnstone在網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并首次提出Exosomes一詞，然后Laulagnier等從細(xì)胞系中剝離到有蛋白酶活性的微粒。1990年之前，Exosomes一直被當(dāng)作細(xì)胞代謝產(chǎn)物的運輸體，直到β-cell分泌的Exosomes發(fā)現(xiàn)具有轉(zhuǎn)運抗原的功能才被引起重視。其包含有大量的蛋白分子、DNA、RNA、mRNA及microRNA，能夠通過細(xì)胞間的傳遞發(fā)揮重要作用。在腫瘤免疫調(diào)控、炎性通路調(diào)節(jié)、分子標(biāo)志物、藥物裝載等方面研究及應(yīng)用廣泛[3]。

2 骨組織Exosomes的提取過程及成分組成

在Exosomes的研究中，為了能夠更好地進(jìn)行免疫實驗、診斷標(biāo)志物研究，或作為治療和生存率的預(yù)測分子，其提取過程至關(guān)重要，不能在提取過程中降低其純度和損失其生物活性[4]。目前很多的商業(yè)試劑盒能夠?qū)w液中Exosomes進(jìn)行分離和富集，包括超速離心法、透析膜過濾法、磁珠分選法、流式分選法[5-7]，各種不同的收集方法都具有一定的優(yōu)缺點[8]。超速結(jié)合差速離心是利用Exosomes密度進(jìn)行分離的經(jīng)典方法[9]，在血清、血漿、尿液等體液中應(yīng)用廣泛。在骨組織的研究中，骨細(xì)胞來源的Exosomes可以應(yīng)用超速結(jié)合差速離心直接提取，而在骨組織內(nèi)部的，如骨髓來源的Exosomes，則需要將骨髓先提取出來再進(jìn)行下一步分離。光學(xué)方法是最常用來精準(zhǔn)地觀測Exosomes的運動的，最常用的光學(xué)方法是納米粒子跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)，能夠?qū)σ后w樣本內(nèi)的Exosomes尺寸大小及密度進(jìn)行測量。動態(tài)光散射(dynamic light scattering，DLS)也被用作測量骨來源的Exosomes的尺寸大小。DLS通過激光檢測顆粒的布朗運動，分析懸浮粒子及其強(qiáng)度散射光的波動。電鏡是被廣泛應(yīng)用于檢測Exosomes特征的非光學(xué)的儀器。電鏡的作用原理是在光學(xué)顯微鏡的基礎(chǔ)上，用電代替光線從而產(chǎn)生圖像。然而，由于電鏡要在真空中進(jìn)行，Exosomes的檢測需要固定和脫水，而該過程會影響其尺寸及形態(tài)[10]。在軟骨和骨膜內(nèi)的近期研究中，研究者發(fā)現(xiàn)幾個被轉(zhuǎn)移的內(nèi)源性的蛋白缺少胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的信號肽段。比較顯著的就是兩個ER常駐蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白-78(glucose regulatory protin-78，GRP-78)和TGF-β受體II相互作用蛋白1(TGF-beta receptor II interacting protein1，TRIP-1)，這兩個蛋白是定位于ECM而不含信號肽段[11]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的Exosomes被明確鑒定的存在標(biāo)志物蛋白CD9/CD63/CD81(27、28)。骨髓基質(zhì)細(xì)胞來源的Exosomes則含有熱休克蛋白90(heat shock protein 90，Hsp90)、熱休克蛋白70(heat shock protein 70，Hsp70)、閥蛋白-1(flotillin-1)[12]。最近有研究用質(zhì)譜檢測了成骨細(xì)胞分泌的外泌體的1 536個蛋白，發(fā)現(xiàn)其中的172個蛋白與骨組織數(shù)據(jù)庫中的蛋白重合[13]。更進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)組分析，檢測到蛋白包括ephrinB1蛋白(EFNB1)、轉(zhuǎn)換生長因子受體3(TGFBR3)、脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(LRP6)、骨形態(tài)蛋白受體1(BMPR1)、Smad泛素化調(diào)控因子-1(SMURF1)，這些蛋白在骨組織疾病中均有重要功能。除了蛋白，骨組織來源的Exosomes內(nèi)各種的核酸也被鑒定出來[14]。有研究將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中分泌的Exosomes內(nèi)miRNA的不同進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)let-7a、miR-199b、miR-218、miR-148a、 miR-135b、miR-203、miR-219、miR-299-5p和miR-302b明顯升高，miR-221、miR-155、miR-885-5p、miR-181a和miR-320c降低。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)7個mRNA，包括RPS2、DGKA、ACIN1、DKK2、Xsox17、DDX6和Lsm2表達(dá)具有差異。

3 Exosomes在骨量丟失中的角色

骨組織是一個在成骨細(xì)胞促進(jìn)合成、破骨細(xì)胞促進(jìn)分解，協(xié)調(diào)進(jìn)行的不斷建模和修復(fù)的過程。成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間相互交流，交流過程復(fù)雜，牽涉到激素、生長因子、mRNA和miRNA。對骨組織中的Exosomes進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Exosomes能夠直接影響成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以調(diào)控骨的結(jié)構(gòu)及代謝。成骨細(xì)胞來源的Exosomes包含有骨調(diào)節(jié)蛋白，能夠刺激破骨細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，是骨組織進(jìn)行細(xì)胞間交流的機(jī)制之一。核因子Κβ配體活化受體(receptor activator of nuclear factor kappa beta ligand，RANKL)隸屬于TNF家族，在骨代謝的過程中有重要作用，能夠調(diào)控破骨細(xì)胞的激活。成骨細(xì)胞分泌的Exosomes包含有RANKL，甲狀旁腺激素能夠促進(jìn)RANKL的釋放，攜帶RANKL的Exosomes能夠進(jìn)入破骨細(xì)胞內(nèi)起到傳遞RANKL的作用[15]。有研究證實老年患者的Exosomes與年輕患者相比，更加能夠抑制骨的生成，并且該抑制作用與半凝乳素蛋白(Galectin-3)相關(guān)[16]。Galectin-3在老年患者的Exosomes中減少，體外實驗中Galectin-3的過表達(dá)能夠引起B(yǎng)MSCs成骨分化能力的增強(qiáng)。骨化成骨細(xì)胞來源的Exosomes已經(jīng)被證實包含有miRNAs，例如miR-1192、miR-680、miR-302a，這些Exosomes能夠被BMSCs吞噬從而刺激成骨性分化。Exosomes激活BMSCs成骨分化的機(jī)制是Exosomes內(nèi)的miRNAs能夠激活Wnt/β-catenin通路[17]。Wnt/β-catenin通路是BMSCs分化的關(guān)鍵調(diào)控通路，而Wnt通路的激活能夠抑制PPARγ、CCAAT增強(qiáng)結(jié)合蛋白的表達(dá)，激活成骨因子Runx2、Dlx5和Osterix的表達(dá)。

4 干細(xì)胞來源Exosomes在骨組織再生修復(fù)中的角色

在過去的幾年，骨組織修復(fù)再生領(lǐng)域中Exosomes的作用被引起重視。干細(xì)胞分泌的Exosomes已經(jīng)被用在幾項再生應(yīng)用中[18-19]。報道顯示特異性蛋白、mRNA和miRNA能夠從Exosomes中橫向轉(zhuǎn)移至臨近或遠(yuǎn)處細(xì)胞以激活疾病組織中的再生程序[20]。Furuta研究顯示間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)Exosomes是MSC旁分泌信號的重要分子之一。與對照組相比，注射MSC-exosomes能夠增強(qiáng)骨折的愈合。最近，MC3T3-E1細(xì)胞來源的Exosomes被用來促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。該研究發(fā)現(xiàn)Exosomes明顯影響受體基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的miRNA成分，并且這一改變是通過抑制Axin1的表達(dá)和增加β-catenin蛋白以激活Wnt信號通路[17]。Exosomes來源于干細(xì)胞和成骨細(xì)胞前體能夠激活破骨細(xì)胞的形成。骨髓基質(zhì)細(xì)胞來源的Exosomes已經(jīng)被證實能夠影響破骨細(xì)胞前體至破骨細(xì)胞形成的過程。因此，該類Exosomes能夠被用在破骨細(xì)胞形成需要的組織中，例如正畸治療和雙膦酸鹽相關(guān)的關(guān)節(jié)骨壞死[21]。Huang等[22]評估了體內(nèi)外牙髓細(xì)胞來源的Exosomes引起幼稚人牙髓干細(xì)胞及人骨髓基質(zhì)細(xì)胞牙源性分化的可能。該結(jié)果證實Exosomes能夠被各種細(xì)胞內(nèi)化，并且刺激牙分化所需基因的表達(dá)。更進(jìn)一步，當(dāng)檢測牙髓干細(xì)胞的齒根切片模型時，Exosomes能夠促進(jìn)牙髓類似組織的再生[23]。Qi及其合作者利用干細(xì)胞來源的Exosomes去修復(fù)骨質(zhì)疏松兔骨組織的缺損，證明Exosomes能夠有效刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化，并且該作用隨著Exosomes濃度增加而增強(qiáng)。在體內(nèi)Exosomes通過血管增生和骨生成以增強(qiáng)缺損的顱骨骨組織的再生。最近，人類胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞來源的Exosomes被用來治療兔骨軟骨缺陷[24]，第12周Exosomes處理后的缺陷展示出完整的軟骨和軟骨下骨，其表面光滑、具有完整形態(tài)。骨組織細(xì)胞來源的Exosomes能夠通過成骨細(xì)胞分化和破骨細(xì)胞的下調(diào)，以促進(jìn)骨組織修復(fù)和再生。

5 骨組織Exosomes內(nèi)miRNA的研究

骨組織來源的Exosomes miRNA能夠被用作成骨細(xì)胞分化和基質(zhì)形成的靶點。有研究對骨形成過程中牽涉的Exosomes miRNA進(jìn)行了分析。骨化細(xì)胞來源的Exosomes中的miRNAs中有4個是高表達(dá)的，即：miR-677-3p、miR-680、miR-3084-3p和miR-5000。Let-7蛋白在成骨細(xì)胞前體和分化成熟內(nèi)Exosomes均可以被發(fā)現(xiàn)，并且能夠通過調(diào)控高遷移組蛋白AT-hook2(HMGA2)和軸蛋白2(Axin 2)增強(qiáng)骨的生成[14]。有報道表明骨轉(zhuǎn)錄因子(Runx2)被miR-30 d-5p、miR-133b-3p、miR-199b、mir221和miR-133b-3p所調(diào)控，而 miR-30 d-5p和 miR-885-5p則負(fù)向調(diào)控成骨細(xì)胞的分化[25]。有研究證實破骨細(xì)胞來源的Exosomes miR-214-3p能夠抑制成骨細(xì)胞的骨形成。因此，抑制破骨細(xì)胞內(nèi)miR-214-3p已經(jīng)被當(dāng)作是治療低骨量引起骨骼疾病的潛在的治療途徑[26]。

6 Exosomes在骨骼肌細(xì)胞分化再生、先天性肌病方面的角色

骨骼肌的代謝需要各種因子的平衡，包括分泌蛋白、炎性因子、miRNAs和脂膜類。肌母細(xì)胞能夠分泌Exosomes，增強(qiáng)肌肉的代謝。體外的幾項研究證實在C2C12細(xì)胞和人肌母細(xì)胞分化過程中，Exosomes的分泌增多[27]。肌母細(xì)胞分泌的Exosomes包含有各種生長因子，包括基礎(chǔ)成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、胰島素樣生長激素-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-beta1，TGF-B1)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等，具有調(diào)控生長、功能、修復(fù)的潛能[28]。用熒光標(biāo)記法檢測Exosomes在肌母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的定位，發(fā)現(xiàn)肌母細(xì)胞不僅能夠分泌Exosomes，而且能夠內(nèi)吞這些顆粒。肌小管分泌的Exosomes能夠通過cyclin-D1蛋白和myogenin蛋白促進(jìn)肌母細(xì)胞的分化[24]。這些研究證實，肌細(xì)胞能夠分泌Exosomes，并且能被周圍或遠(yuǎn)處的肌母細(xì)胞所內(nèi)吞，影響其增殖和分化的能力。Exosomes同樣具有肌肉修復(fù)的作用。用肌肉來源的Exosomes處理受損的肌肉能夠降低肌肉的纖維化，增強(qiáng)再生肌纖維的數(shù)量[27]，且肌肉的損傷和鈣的內(nèi)流能夠刺激Exosomes的釋放增多。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Exosomes在肌肉的損傷修復(fù)過程中扮演信號交流分子的角色，其內(nèi)包含的MiR-206能夠通過下調(diào)Twist-1蛋白促進(jìn)肌母細(xì)胞的分化[29]。將肌母細(xì)胞與含有這些miRNA的Exosomes共同孵育，與直接與miRNA孵育產(chǎn)生的作用類似，能夠促進(jìn)細(xì)胞的存活，降低細(xì)胞的死亡[30]。Exosomes在強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良癥(myotonic dystrophy、DM)也扮演一定角色[31]。DM病情進(jìn)展的患者中的miR-1、miR-133a/b和 miR-206是升高的，而非進(jìn)展的患者中該類miRNA沒有變化。研究發(fā)現(xiàn)這些miRNA能夠從Exosomes中分離獲得，并且可以隨著其他蛋白分子進(jìn)行流通。因此，有設(shè)想管控這些Exosomes的分泌能夠間接調(diào)節(jié)這些miRNA的分布，從而影響病程的進(jìn)展。

7 總結(jié)

以上這些研究都證實Exosomes通過作用于BMSCs、破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞在調(diào)控骨量代謝方面扮演著重要角色，且證實Exosomes在骨組織代謝的治療中存在很大的潛能。Exosomes的研究已經(jīng)在腫瘤進(jìn)展、標(biāo)志物研究、干細(xì)胞產(chǎn)物方面取得了相當(dāng)顯著的進(jìn)展，而在骨組織方面研究相對較少。目前相關(guān)研究顯示骨骼相關(guān)的Exosomes對于骨組織的維持和修復(fù)具有重要作用。提取的骨組織內(nèi)Exosomes有相當(dāng)?shù)纳锘钚裕⑶夷軌蛘{(diào)控骨組織的維持和修復(fù)。另外，關(guān)于Exosomes內(nèi)的miRNA也進(jìn)行了一些研究，發(fā)現(xiàn)miRNA調(diào)控許多關(guān)鍵的病理過程，并且提出針對Exosomes內(nèi)miRNA進(jìn)行調(diào)控能夠改善骨代謝。目前研究已經(jīng)對不同組織來源的Exosomes的功能進(jìn)行了探討，但在體內(nèi)其是如何傳播和被捕獲，發(fā)揮調(diào)控的機(jī)制是什么，目前研究尚未深入。揭示骨組織中Exosomes發(fā)揮功能的作用過程，為治療骨代謝疾病提供新的策略是目前研究的重點。