基于CO2傳輸阻力解析的土壤水分調控番茄光合生理機制

張大龍 柳玉平 李 洋 馮改利 李清明 魏 珉

(1.山東農業(yè)大學園藝科學與工程學院， 泰安 271018； 2.農業(yè)農村部黃淮海設施農業(yè)工程科學觀測實驗站， 泰安 271018；3.山東藍奧生物技術有限公司， 濟南 250001)

0 引言

灌溉制度是作物生理生態(tài)、作物栽培和農田水利等學科的重要研究內容，通過優(yōu)化灌溉頻率、灌水時間和灌溉定額可以挖掘作物生產潛力，提高水資源利用效率[1]。光合作用是作物生長的基本驅動力，土壤水分與植物個體及組織細胞的水分平衡密切相關，決定葉片解剖結構和保衛(wèi)細胞行為，進而決定CO2的吸收、運輸與同化進程。因此，解析土壤水分調控光合作用的機理是優(yōu)化灌溉設計和高效栽培的理論基礎。在植物光合作用過程中，底物CO2首先從外界大氣擴散到葉片表層，然后穿過氣孔到達氣孔下腔，克服葉肉阻力到達葉綠體羧化位點，由羧化酶進行同化。每克服一個阻力，細胞內的CO2濃度都會相應降低[2]。番茄是重要的蔬菜作物，設施及露地栽培廣泛。番茄為C3植物，CO2傳輸阻力較大，其葉綠體內有效CO2濃度顯著低于胞間，遠遠不能滿足葉綠體內羧化反應的需求，是提高光合CO2同化能力和挖掘產量潛力的重要限制因子[3]。

CO2需要克服阻力從大氣傳輸到羧化位點，構成“源-流-庫”模式[4]。氣孔僅為CO2由大氣傳輸至葉綠體羧化位點的第一步。早期的光合作用研究中，由氣孔傳輸至葉綠體羧化位點的葉肉阻力對光合作用的限制一般忽略不計?；谧魑锷杷畔⒌奶澣惫喔?、分根交替灌溉等節(jié)水理論與技術不斷發(fā)展，在大田作物與設施栽培中得到廣泛應用，但傳統節(jié)水理論仍以氣孔作為光合CO2吸收傳輸唯一限速節(jié)點[5-6]。大量研究集中于以氣孔功能為契點，從水分動力傳輸和水分平衡角度解析了氣孔保衛(wèi)細胞響應土壤水分的前饋和反饋調節(jié)機制，揭示土壤水分調控番茄光合CO2吸收的第一道“門戶”的機制，為全面定量解析CO2傳輸“源-流-庫”的阻力構成及分布奠定了基礎，但對CO2傳輸過程缺乏系統和全面認知。隨著碳同位素測量和熒光技術的發(fā)展，葉肉阻力已被證明是CO2傳輸總阻力的重要組成部分，是除氣孔阻力和羧化反應之外的第3個光合效率限制因素，葉肉阻力與氣孔阻力相當甚至要大于氣孔阻力，是光合CO2傳輸同化的重要限制因子[7-10]。氣孔限制和非氣孔限制已經很難精準描述土壤水分調控番茄光合CO2吸收同化機理，而需要從氣孔阻力、葉肉阻力和羧化反應限制3個限制因素解析，但相關研究鮮見報道。不同土壤水分梯度下番茄光合CO2吸收與傳輸的阻力分布、關鍵限速位點和調控機制仍不清晰。

本研究基于葉綠素熒光、氣體交換和響應曲線相結合的方法，解析不同土壤水分梯度下番茄光合CO2傳輸的各支段阻力及權重，量化各支段阻力抑制光合CO2吸收的相對貢獻率，基于“源-流-庫”總路徑闡明土壤水分脅迫限制番茄CO2傳輸與供應的關鍵步驟及位點。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗于2018年5—7月在山東農業(yè)大學園藝試驗站進行(北緯36°09′，東經117°09′，海拔126 m)。該試驗區(qū)屬黃淮海平原，溫帶大陸性濕潤季風氣候區(qū)。全年平均氣溫12.9℃，平均日照時數2 627.1 h，平均降水量697 mm。選用番茄品種為圣羅蘭，于四葉一心期定植到塑料盆內(高40 cm，直徑30 cm)。栽培基質由菜園土與有機肥按照2∶1(體積比)配制而成，每盆裝基質10 kg。基質容重為1.37 g/cm3，田間持水率為25.8%(質量分數)。盆內表面用地膜覆蓋防止土面蒸發(fā)。根據水量平衡原理和稱量法[11]將土壤相對含水率控制到40%、50%、60%、70%、80%和90% 6個水平。試驗于日光溫室內進行，長度43 m，跨度10 m，全鍍鋅鋼管桁架結構。

1.2 原理

CO2“源-流-庫”傳輸模式及阻力分布如圖1所示。圖中，Ca、Cb、Ci、Cc分別表示大氣、葉面、胞間和羧化基的CO2濃度，rb、rs、rm分別表示邊界層、氣孔和葉肉阻力。CO2在不同位點分壓梯度的驅動下，由高分壓位點克服阻抗向低分壓位點擴散。根據物理學中表征流體及物質擴散的一般法則，阻力(R)為分壓差ΔP與通量的比值。

圖1 葉片CO2“源-流-庫”擴散過程梯度驅動力及阻力分布Fig.1 Distribution of driving force and resistance for CO2transport through “source-path-sink”

1.3 氣孔CO2傳輸導度及光合參數測量

根據葉綠素熒光、氣體交換和響應曲線擬合相結合的方法測定并估算不同水分梯度下“源-流-庫”的CO2分壓梯度，根據氣體擴散定律計算氣孔和葉肉導度。在環(huán)境控制良好的室內測定，環(huán)境溫度設30℃，相對濕度70%，光強1 000 μmol/(m2·s)，CO2濃度400 μmol/mol。光合氣體交換及葉綠素熒光采用Li-Cor6400XT型光合作用測量系統所配置的葉室測定。CO2初始濃度設為400 μmol/mol。待系統穩(wěn)定后，調用自動程序測定熒光Pn/Ci曲線。測定過程中CO2濃度依次設定為400、300、200、150、50、400、600、800、1 000、1 500 μmol/mol。葉綠素熒光測定設定為多閃飽和脈沖模式。待測定完成后，將系統接入低氧環(huán)境，并將光強調成2 000 μmol/(m2·s)，測定低氧光合熒光響應曲線以校正電子傳遞效率。氣孔對CO2的傳輸導度(gsc)根據氣體交換測量的對水汽傳輸的氣孔導度(gsH2O)進行換算，由于H2O在空氣中的傳播能力為CO2的1.6倍，gsc=gsH2O/1.6[12]。最大羧化速率Vc,max以及最大電子傳遞速率Jmax根據CO2響應曲線及FvCB模型進行估算[13]，羧化效率CE為初始階段CO2濃度小于200 μmol/mol時曲線的斜率[14]。

1.4 葉肉CO2傳輸導度計算

根據氣體擴散定律，葉肉導度gm可以由光合CO2同化速率(Pn)與胞間至葉綠體內CO2分壓梯度(Ci-Cc)計算[15]，即

(1)

胞間CO2濃度Ci和凈光合速率Pn由氣體交換測得，由于CO2同化的能量可以通過電子傳遞速率進行量化，從而可以反推得到Rubisco酶(1,5-二磷酸核酮糖羧化酶)羧化反應底物葉綠體內CO2濃度

(2)

其中

J=ΦPSⅡPαβ

(3)

式中J——電子傳遞速率

Rd——光照下線粒體呼吸速率(光照下暗呼吸速率)

Γ*——無線粒體呼吸時葉綠體CO2補償點

P——光合光量子通量密度

α——葉片對光量子的吸收效率

β——光量子在光系統間的分配比例

ΦPSⅡ——光系統Ⅱ的光量子效率

Fs——穩(wěn)態(tài)熒光值

1.5 阻力權重和光合限速分析

類比電流，CO2通過氣孔傳輸至羧化位點“源-流-庫”動力傳輸路徑為串聯電路，因此總傳輸阻力(1/gtot)可計算為氣孔阻力(1/gsc)與葉肉阻力(1/gm)之和：1/gtot=1/gsc+1/gm。因此，CO2總傳輸導度可計算為

(4)

依據光合經典理論，將光合限速步驟劃分為氣孔限制(Ls)、葉肉限制(Lm)和羧化反應限制(Lb)，可通過權重分析確定關鍵限速位點和步驟[16]為

(5)

?A/?Cc根據光合速率-葉綠體內CO2濃度響應曲線(Pn-Cc，Cc=4×10-5～1.1×10-4)的斜率進行估算[17]。

2 結果分析

2.1 土壤水分對光合參數的影響及模擬

番茄光合參數對土壤水分的響應呈現相似趨勢：光合速率(Pn)、最大羧化速率(Vc,max)、最大電子傳遞速率(Jmax)及初始羧化效率(CE)在土壤水分充足時達到最大值，在土壤相對含水率80%～90%范圍內波動較為平緩，隨著土壤水分脅迫的增大，光合參數迅速下降，在重度土壤水分脅迫狀況下(40%～50%)，光合參數最小，且變化趨勢趨于平穩(wěn)(圖2)。光合參數隨土壤水分變化整體呈現出“S”形變化曲線，初期緩慢增長，中期迅速增長，末期達到最大值并趨于穩(wěn)定，可用logistic模型模擬為

(6)

式中a——增長極限，表征土壤水分充足時光合的極限速率

b——截距系數，為基礎狀態(tài)參數

c——增長率系數，表征系統狀態(tài)趨近于頂級的速度

模型均通過顯著性檢驗，光合速率(Pn)、最大羧化速率(Vc,max)、最大電子傳遞速率(Jmax)及初始羧化效率(CE)的模型參數如表1所示。

圖2 土壤水分對光合速率(Pn)、最大羧化速率(Vc，max)、最大電子傳遞速率(Jmax)及初始羧化效率(CE)的影響Fig.2 Effect of soil moisture on photosynthesis rate(Pn), rubisco carboxylation capacity (Vc，max), maximum electron transport capacity (Jmax) and carboxylation efficiency (CE)

變量模型參數abcPR2光合速率Pn31.723.860.070.00160.98最大羧化速率Vc,max92.544.720.070.00300.98最大電子傳遞速率Jmax97.124.740.070.00170.98初始羧化效率CE0.415.720.080.00440.97氣孔導度gsc0.839.800.160.00020.99葉肉導度gm0.8412.510.220.00030.99總傳輸導度gtot0.4210.650.180.00030.99

2.2 土壤水分對CO2傳輸導度的影響及模擬

氣孔、葉肉對CO2的傳輸導度及總傳輸導度與光合參數的響應規(guī)律相似，隨土壤水分變化均呈現明顯的“S”形變化曲線(圖3)，氣孔導度、葉肉導度及總CO2傳輸導度隨水分脅迫加重而逐漸減小，這種下降趨勢在土壤相對含水率由70%降到50%時表現最為明顯；當土壤水分飽和時，氣孔和葉肉對CO2的傳輸導度為最大值，且趨于穩(wěn)定。

圖3 土壤水分對氣孔導度(gsc)、葉肉導度(gm)及總CO2傳輸導度(gtot)的影響Fig.3 Effect of soil moisture on stomatal conductance (gsc), mesophyll conductance (gm) and total conductance (gtot) for CO2 transport

圖4 氣孔阻力、葉肉阻力和羧化反應限速光合速率的相對貢獻率隨土壤水分的變化趨勢Fig.4 Effect of soil moisture on proportion of stomatal limitation, mesophyll limitation and biochemical limitation on photosynthesis

2.3 光合限速步驟解析

在番茄光合CO2吸收與傳輸過程中，各支段阻力及限速光合速率的權重與土壤水分狀態(tài)密切相關。如圖4所示，氣孔阻力與葉肉阻力對光合速率限制的相對貢獻率變化趨勢相似，隨著水分脅迫的加重，其貢獻率逐漸增大，可以用指數函數模擬(Ls=0.871 8e-0.02x，P<0.01;Lm=0.791e-0.021x，P<0.01)。羧化反應對光合速率限制的相對貢獻率與氣孔和葉肉導度相反，隨著水分脅迫的加重，其貢獻率逐漸減小，可以用對數函數模擬(Lb=0.698 7lnx-2.378 8，P<0.01)。因此，在土壤水分充足時，羧化反應限速光合的相對貢獻率最大，是光合速率的關鍵限制因子；在水分脅迫狀況下，氣孔阻力和葉肉阻力對光合速率的限制作用占主導地位，羧化反應的相對貢獻率較低。

2.4 氣孔與葉肉阻力的影響因素

氣孔由保衛(wèi)細胞構成，葉片水分狀況通過調控膨壓決定氣孔開放程度，進而決定CO2傳輸阻力。本研究中，氣孔對CO2的傳輸導度與葉水勢呈正相關，隨葉水勢的下降，氣孔導度也呈線性下降趨勢 (圖5a)。葉水勢與土壤含水率關系密切，葉水勢隨著土壤含水率的下降而下降；氣孔開度受植物水分狀況影響，與葉水勢變化趨勢一致，隨水分脅迫加重，氣孔開度逐漸變小(圖5b)，是導致氣孔CO2傳輸導度下降的重要原因。比葉重是葉片重要經濟性狀，在本研究中與葉肉導度密切相關，是土壤水分影響葉肉導度的重要途徑。葉肉導度與比葉重呈線性負相關關系，葉肉導度隨比葉重的增大而線性減小(圖6a)；比葉重隨土壤水分脅迫程度的加劇而逐漸增大(圖6b)。

3 討論

圖5 葉水勢與氣孔導度的關系及對土壤水分的響應Fig.5 Response of leaf water potential to soil moisture and relationship with stomatal conductance

圖6 比葉重對土壤水分的響應及與葉肉導度的關系Fig.6 Response of leaf mass area to soil moisture and relationship with mesophyll conductance

基于氣體擴散理論全面解析CO2“源-流-庫”傳輸總路徑阻力構成及各支段阻力權重，量化了氣孔限制、葉肉限制和羧化反應限制的相對貢獻率，揭示了不同土壤水分梯度下番茄光合CO2傳輸的關鍵限速位點，突破了設施栽培研究中將氣孔作為光合CO2吸收傳輸唯一限速節(jié)點的局限性，拓展并豐富了光合理論，對番茄節(jié)水高效栽培具有重要意義。本研究表明，除氣孔行為以外，葉肉阻力對番茄葉綠體內光合底物CO2的供應同樣有重要影響；氣孔、葉肉和羧化反應對光合限速的相對貢獻率在不同水分狀況下亦有所不同。在土壤水分脅迫狀況下，氣孔和葉肉阻力限制是光合的關鍵限制因子，而且其相對貢獻率隨土壤水分脅迫的加劇而增大，葉綠體基質的羧化反應限制對光合的抑制作用較小。在土壤水分充足時，氣孔和葉肉阻力限制對光合速率的抑制作用較小，羧化反應限制則成為光合抑制的主導因子。

氣孔控制水流和CO2流，與溶質流和能量流以及營養(yǎng)物質循環(huán)有著密切聯系。氣孔運動受植物生理和環(huán)境要素變化的共同影響，氣孔的調控存在兩個機理，即保衛(wèi)細胞膨壓的前饋和反饋調節(jié)[18]。氣孔能對環(huán)境波動迅速響應，進而調控CO2的吸收阻力，氣孔運動的直接原因是保衛(wèi)細胞的膨壓變化，當保衛(wèi)細胞膨壓增大時，保衛(wèi)細胞膨脹，氣孔開度增大，氣孔對CO2吸收傳輸的導度亦隨之增大[19]。在土壤水分脅迫狀況下，根系吸水與供水能力不足，葉片水勢和細胞膨壓低，氣孔關閉，氣孔對CO2的傳輸導度低，因此，土壤水分脅迫情況下，氣孔限制對光合抑制的相對貢獻率較大。隨著土壤含水率增加，脅迫逐漸緩解，葉片水勢和膨壓逐漸升高，氣孔開度增大，氣孔對CO2的傳輸導度亦隨之增大，氣孔限制對光合抑制的相對貢獻率較小，此時葉綠體內CO2濃度較高，光合速率主要受葉綠體基質的羧化反應限制。

CO2由氣孔下腔傳輸至葉綠體羧化位點的過程，雖然路徑較短，但葉肉阻力對光合抑制的相對貢獻率較大，對CO2吸收傳輸具有重要調控作用。葉肉導度的變化及相對貢獻率與氣孔相似，均呈“S”形變化曲線，在土壤水分虧缺時，葉肉導度較小，CO2傳輸阻力大，對光合抑制的相對貢獻率較大，是光合速率提高的限制因子。當土壤水分充足時，葉肉導度大，對CO2傳輸的限制作用較小。與氣孔迅速響應環(huán)境變化的膨壓調控機制不同，葉片解剖結構是影響葉肉導度的重要因子[20]。在結構層面上影響葉肉導度的依次是葉片厚度、葉肉細胞孔隙度、細胞壁厚度、細胞膜通透性等[21]。葉片厚度增加是植物適應干旱脅迫的響應機制之一，可以有效防止過度水分散失[22]。比葉重是表征葉片厚度的重要指標，比葉重較大的葉片可能具有較多細胞或單個細胞具有較大生物量，葉片較厚，細胞組織間隙較為緊密，不利于水分散失[23]。雖然比葉重可以保持水分抵御干旱脅迫，但CO2吸收傳輸的阻力相應增大，葉肉對CO2的傳輸導度降低。因此，在本研究中，水分虧缺時，葉片比葉重大，葉片厚度大，CO2吸收傳輸阻力大，對光合速率的抑制作用明顯。隨著土壤含水率的增大，葉片比葉重降低，葉面積大而薄，葉肉組織分化程度低，氣腔和通氣組織發(fā)達，葉肉組織間隙疏松。CO2在葉肉組織中的傳輸阻力較小，因而在水分充足時對光合速率的限制作用較小。CO2以被動運輸方式跨越細胞膜和葉綠體膜，水通道蛋白在CO2跨膜運輸過程中顯得尤為重要[24-25]。目前已發(fā)現，水通道蛋白能夠促進跨膜快速CO2傳輸，主要由質膜水通道蛋白PIP1s小家族負責，其表達量與葉肉阻力和光合速率密切相關[25-26]。解析質膜通道蛋白在不同水分梯度下的活性以及對葉肉導度的調控機理仍需深入探討，將是本研究的下一步工作。

4 結論

(1)番茄光合速率(Pn)、最大羧化速率(Vc,max)、最大電子傳遞速率(Jmax)及初始羧化效率(CE)隨土壤含水率變化呈“S”形變化曲線，初期緩慢增長，中期迅速增長，末期達到最大值并趨于穩(wěn)定，可用logistic函數模擬。

(2)氣孔、葉肉對CO2的傳輸導度及總傳輸導度隨土壤含水率變化均呈明顯的“S”形變化曲線，氣孔導度、葉肉導度及總CO2傳輸導度在土壤水分充足時趨于穩(wěn)定并達到最大值；隨著土壤水分脅迫的加重，各支段導度及總CO2傳輸導度逐漸降低，并在重度土壤水分脅迫狀況下達到最低，可用logistic函數模擬。

(3)氣孔導度與葉肉導度對光合速率限制的相對貢獻率變化趨勢相似，隨著水分脅迫的加重，其貢獻率逐漸增大，可以用指數函數模擬；羧化反應對光合速率限制的相對貢獻率與氣孔和葉肉導度相反，隨著水分脅迫的增大，其貢獻率逐漸減小，可以用對數函數模擬；在土壤水分充足時，葉綠體內CO2濃度充足，羧化反應限速光合速率的相對貢獻率最大，是關鍵限制因子；在水分脅迫狀況下，氣孔限制和葉肉限制占主導地位，羧化反應的相對貢獻率較低。

(4)氣孔對CO2的傳輸導度與葉水勢呈正相關，隨葉水勢的下降，氣孔導度也呈線性下降趨勢；葉肉導度與比葉重呈線性負相關關系，葉肉導度隨比葉重的增大而線性減小，比葉重隨土壤水分脅迫程度的加劇而逐漸增大。