蜂產(chǎn)品抗生素殘留檢測的研究進展

林春瑤，劉功良，白衛(wèi)東，趙曉娟，楊進輝，賴秋萍

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院，廣東廣州 510225；2.廣州市蜂嘜蜂業(yè)有限公司，廣東廣州 510900；3.廣東桂嶺蜂業(yè)科技股份有限公司，廣東梅州 514199）

蜂產(chǎn)品不僅具有很高的營養(yǎng)價值，而且還具有獨特的生理和藥理功能，因而在食品、醫(yī)藥業(yè)、化妝品行業(yè)、輕工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)等行業(yè)中的應用日益增多，越來越受到人們的關注。2009年我國蜂產(chǎn)品（含制品）的銷售額已達到150億元，蜂蜜、蜂蠟的出口量均居世界第1位[1-2]。然而，我國蜂產(chǎn)品中抗生素殘留的問題尚未得到有效解決，雖然這幾年通過無公害蜂產(chǎn)品標準的制定和實施，蜂產(chǎn)品中氯霉素超標問題在出口產(chǎn)品中得到有效控制，但四環(huán)素、鏈霉素、林可霉素、氟甲砜霉素等抗生素的殘留現(xiàn)象仍然存在[3]。食用含有抗生素殘留超標的蜂產(chǎn)品后，會直接影響人們的身體健康，其危害主要有以下幾個方面：過敏性反應、細菌耐藥性、環(huán)境平衡紊亂或菌群失調(diào)、致畸、致突變等。我國在加入世貿(mào)組織后，由于蜂產(chǎn)品中抗生素殘留超標而導致被外商拒收，這不僅給我國蜂業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟損失，也嚴重影響了我國蜂產(chǎn)品在國際市場上的聲譽[4]。介紹了蜂產(chǎn)品中抗生素殘留現(xiàn)狀及危害，蜂產(chǎn)品中抗生素殘留的檢測方法，以期為蜂產(chǎn)品中抗生素殘留的快速檢測及監(jiān)控提供依據(jù)。

1 抗生素殘留的原因及危害

抗生素是指生物在生命活動過程中產(chǎn)生的（或從化學、生物或生化方法中所產(chǎn)生的），并在低微濃度下能選擇性地抑制其他微生物的化學物質(zhì)。據(jù)相關研究表明，在養(yǎng)蜂的整個生產(chǎn)過程中，蜜蜂會得很多的病癥，其中腐臭病和敗血病是常見的病癥，當蜜蜂得這些病的時候，就會大大降低蜂蜜的產(chǎn)量，從而影響出口量。所以，養(yǎng)蜂人士為了不讓其生病，會加入非常多的抗生素。現(xiàn)今，一些有花苞的農(nóng)作物被過多噴灑了農(nóng)藥，經(jīng)過蜜蜂代謝作用，部分蜂產(chǎn)品中殘留著抗生素。蜂產(chǎn)品中的藥物殘留、有害化學物質(zhì)污染和生物性污染是影響蜂產(chǎn)品安全的主要因素。

2 抗生素殘留檢測技術

2.1 微生物學測定法

微生物學測定法是目前廣泛應用的測定抗生素方法，該方法可以直觀地反映抗生素藥品的抗菌活性并具有臨床特征。同時，微生物法所需儀器設備簡單、成本較低。目前，比濁法和瓊脂擴散法被列為抗生素微生物檢定方法，被我國藥典中引用為標準方法，主要有紙片法、管碟法和氯化三苯基四氮唑法。

2.1.1 紙片法

根據(jù)抗生素能抑制微生物生長繁殖的特點而設計。如果蜂產(chǎn)品存在抗生素殘留，則其樣品提取液可以抑制微生物生長；反之微生物的生長則不會受到抑制，而蜂產(chǎn)品中抗生素殘留的多少則可以根據(jù)對微生物的抑制程度來判斷。王春奕等人[5]用圓盤法對西寧市消毒鮮牛奶中抗生素殘留的調(diào)查結果表明，檢測5批25份市售消毒鮮牛奶中抗生素殘留的質(zhì)量分數(shù)在1.5×10-9以上。

2.1.2 管碟法

根據(jù)對抗生素敏感的試驗菌在適當條件下所產(chǎn)生的抑菌圈大小和藥物濃度成比例的關系設計而成[6]。朱麗云等人[7]采用微生物管碟法與高效液相色譜法2種方法對蜂蜜中四環(huán)素族抗生素的進行檢測，分析兩者不同的準確度、精確度和靈敏度，結果得到微生物管碟法檢測蜂蜜中四環(huán)素、土霉素、金霉素線性相關系數(shù)分別為0.994 2，0.992 2，0.991 6；回收率分別為80%，81%，78%。高效液相色譜法檢測蜂蜜中四環(huán)素、土霉素、金霉素線性相關系數(shù)分別為0.999 9，0.999 7，0.999 7；回收率分別為80%，87%，83%。微生物管碟法操作周期長、操作繁瑣、誤差較大，但是靈敏度高；高效液相色譜法操作簡單、測量準確，但是檢測金霉素靈敏度沒有微生物管碟法的高。

2.1.3 氯化三苯基四氮唑法

根據(jù)抗生素對微生物新陳代謝影響大而設計的。該方法以嗜熱鏈球菌為指示菌，氯化三苯基四氮唑為指示劑（TTC的氧化態(tài)無色，還原態(tài)為無色），如果蜂產(chǎn)品中沒有抗生素存在，則其樣品提取液不影響指示菌的新陳代謝，從而能夠使無色氧化態(tài)的TTC還原為紅色還原態(tài)的TTC，培養(yǎng)液從無色變?yōu)榧t色。反之，提取液抑制指示菌的新陳代謝，抑制的程度和抗生素殘留量成正比，所以可依據(jù)培養(yǎng)液顏色有無變化及顏色變化的深淺來判斷樣品中抗生素的含量，微生物抑制法通常使用蠟狀芽孢桿菌，就檢測結果而言，其對四環(huán)素類抗生素非常敏感，其中二甲胺四環(huán)素的檢測限可達到0.001～0.002 mg/L，四環(huán)素和土霉素可達到0.025 mg/L，金霉素可達到0.005 mg/L。王婧[8]以發(fā)光菌青海弧菌和費氏弧菌為待測菌種，通過固體培養(yǎng)在25℃恒溫水浴下與待測抗生素反應，分別對磷霉素、甲磺酸左氧氟沙星和土霉素的毒性作用進行檢驗。研究表明，磷霉素對青?；【囊种坡瘦^好，但作用時間短促，量效關系不夠理想；甲磺酸左氧氟沙星對費氏弧菌的毒性作用量效果良好，但抑制率浮動較大；土霉素對這2種發(fā)光菌的毒性作用量效果關系均較好，對青?；【谇?0 min低濃度下有毒性興奮作用，在作用50 min時，量效關系相關性最好；土霉素對費氏弧菌的毒性抑制作用隨土霉素濃度變化呈直線關系，且這種關系比較穩(wěn)定。牛奶中測定時，土霉素對2種菌種的抑制效應有著非常相似的規(guī)律，其抑制率隨時間的變化都比較穩(wěn)定，而且費氏弧菌的量效關系更為穩(wěn)定。因此，費氏弧菌更適合用于檢測牛奶中的土霉素。

2.2 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法是近年來逐漸應用于檢測抗生素殘留的方法，其基本原理是通過特定酶對目標物進行標記，底物經(jīng)過酶催化反應后則顯色，最后通過酶標儀測定，該過程較示蹤法而言，可以避免放射性物質(zhì)的污染，以及被標記物衰變過快導致的檢測結果不夠準確。同時，酶催化反應的專一性很高，反應效率也很高，即催化大量底物只需要短時間內(nèi)經(jīng)過微量的酶對其進行催化，因此該方法具有較高靈敏度[9-10]。

邢淑婕[11]采用酶聯(lián)免疫法檢測蜂產(chǎn)品中土霉素的殘留，采用多克隆抗體作為相應試劑盒，蜂蜜中土霉素的檢測范圍為5～200 μg/kg，相關系數(shù)為0.995 1，在此范圍內(nèi)對人工污染樣品的平均回收率為97.5%～107.5%；蜂花粉中土霉素的檢測范圍為50～200 ng/mL，在此范圍內(nèi)對人工污染樣品的平均回收率為92.61%～104.36%。

國占寶等人[12]利用自制的抗四環(huán)素單克隆抗體，研制了酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒用以檢測蜂蜜中四環(huán)素類抗生素的含量，靈敏度為0.05 ng/mL，檢測限為3～5 ng/mL，加標回收率為90%±10%，平均批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15%。

目前，食品分析越來越趨向于簡單、快捷、靈敏和微量化。與其他方法相比較，酶聯(lián)免疫吸附分析法具有高特異性和靈敏性優(yōu)點。其檢測范圍在納克（ng）和皮克（pg）之間，屬于超微量分析技術；該方法結果精確、重現(xiàn)性好、成本低、操作簡單、樣品處理量大[13]。但酶聯(lián)免疫吸附分析法不可避免地存在一些缺陷，對試劑的選擇性高，很難同時分析多種成分；對結構類似的化合物有一定程度的交叉反應；分析分子量小的化合物或不穩(wěn)定的化合物有一定的困難。因此，許多學者致力于改進和完善該技術，重點研究多克隆抗體轉向單克隆抗體，純化抗體和抗原，改進抗體的載體、反應環(huán)境和定量方式等方面[14]。

2.3 液相色譜法及其聯(lián)用技術

高效液相色譜（HPLC）技術是一種分離效率高、分析速度快的方法。近年來，在抗生素殘留檢測中廣泛應用，是一項較為成熟的技術。

吳華等人[15]采用高效液相色譜法檢測蜂蜜中氯霉素殘留，最低檢出限為0.01 μg/g，檢測線性范圍為0.1～10 μg/mL，相關系數(shù) R2=0.999 3，加標回收率為82.9%～86.7%，RSD為5.1%～6.0%。該方法解決了一般采用氣相色譜-質(zhì)譜儀（GC-MS）、高效液相色譜串聯(lián)多級質(zhì)譜（HPLC-MSN）聯(lián)用技術檢測蜂蜜中氯霉素殘留時儀器昂貴、基層單位難以普及的問題。

周萍等人[16]利用液-液萃取法結合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測蜂王漿中的氯霉素殘留量，檢測線性范圍為0.5～20 μg/kg，相關系數(shù)R2=0.999 9，檢出限為0.1 μg/kg，加標回收率在98.0%～101.3%，相對標準偏差為0.81%～2.08%。該方法簡單實用，樣品無需經(jīng)過固相萃取柱即可富集純化，在質(zhì)譜儀上可達到與固相萃取相同的檢測效果，能很好地檢測氯霉素殘留量，不產(chǎn)生干擾，使樣品前處理的成本大幅度降低。

李小平等人[17]采用固相萃取-高效液相色譜熒光法同時測定蜂蜜中5種磺胺類藥物的殘留。蜂蜜樣品經(jīng)醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解后，用C18固相萃取小柱富集、凈化、乙腈洗脫，從熒光胺中提取5種磺胺類藥物，以2%醋酸（V/V）溶液-乙腈（50/50，V/V）為流動相，在C18色譜柱上（250 mm×416 mm，5 μm） 分離，熒光法在 λEx=405 nm，λEm=495 nm處測定。結果5種磺胺類藥物在0.01～0.20 mg/L具有良好的線性，其相關系數(shù)均大于0.999 5，加標回收率在82.0%～102.5%，RSD均小于5.3%，定量檢出限為0.004 mg/kg。該方法快速、靈敏、簡便、準確，能滿足實際工作的需要。

相關研究人員建立一種快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定蜂蜜中20種磺胺類藥物殘留的方法，該方法快速、準確、高效、靈敏。蜂蜜樣品采用0.1%（V/V）磷酸提取后，MCX固相萃取小柱凈化，快速液相分析色譜柱Shim-pack-XR-ODSII（100 mm×2.0 mm id.，2.2 μm）上，以內(nèi)含 0.1% （V/V）甲酸5 mmol/L乙酸銨的乙腈/水溶液為流動相，采用梯度洗脫。利用超快速液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（UFLC-MS/MS）電噴霧電離多反應監(jiān)測（MRM）正離子模式檢測。結果表明，20種磺胺類藥物除磺胺胍和磺胺醋酰外均在0.25～25.0 μg/kg范圍具有良好的線性關系，磺胺胍和磺胺醋酰在1.0～25.0 μg/kg范圍具有良好的線性關系，相關系數(shù)>0.99；在0.5，2.5，5.0 μg/kg 3個水平添加時，各被測物的回收率在63.3%～106.9%，相對標準偏差（RSD）為1.7%～2.3%，檢出限為0.004～0.25 μg/kg，最低定量檢出限為0.01～0.83 μg/kg。建立的方法可在5.5 min內(nèi)同時測定20種磺胺，是測定蜂蜜中磺胺類藥物殘留的一種高效快速的分析方法。

侯建波等人建立了固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（SPE-LC-MS/MS），同時測定蜂蜜中磺胺類、硝基咪唑類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類、吡喹酮六大類54種藥物殘留的方法。生產(chǎn)蜜經(jīng)磷酸鹽緩沖溶液稀釋、Oasis HLB固相萃取柱凈化后，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術進行檢測（正離子方式，多反應監(jiān)測模式）。采用同位素稀釋內(nèi)標法或外標法進行定量，線性關系良好，相關系數(shù)大于0.992。方法的定量限（LOQ，以信噪比（S/N）大于10計）分別為磺胺類和硝基咪唑類藥物1.0 μg/kg，喹諾酮類和林可酰胺類藥物2.0 μg/kg，大環(huán)內(nèi)酯類藥物3.0 μg/kg，吡喹酮0.3 μg/kg?？傮w回收率為32.6%～114.0%，相對標準偏差為1.3%～28.9%。該方法的定量限量滿足目前國內(nèi)外藥品的最大殘留限量的要求，可作為蜂蜜相關藥物殘留量的篩選檢測方法。

Kazuhiro Fujita等人從0.01 mol/L Na2edta-mcllvaine緩沖液（pH值4.0）中提取樣品，用雙苯乙烯二乙苯共聚物柱和銅離子螯合親和色譜柱對樣品進行純化富集，最后用HPLC熒光檢測器進行檢測。結果表明，土霉素、正霉素、金霉素的最低檢出限分別為 0.5，0.7，0.9 ng/g。

劉蓉蓉等人采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術，同時測定蜂蜜樣品中4種四環(huán)素族抗生素和3種差向異構體的方法。采用Edta-mcilvaine緩沖液提取蜂蜜樣品中的藥物殘留。分別用OASIS HLB和羧酸弱陽離子柱固相萃取柱富集純化，再用流動相洗脫，洗脫液經(jīng)微孔濾膜過濾，用流動相甲酸水-乙腈梯度分離，電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜進行測定。在多反應監(jiān)測模式下，7種藥物在22 min內(nèi)基本實現(xiàn)分離和定性定量。樣品在10～500 μg/kg添加范圍內(nèi)，回收率均為64.9%～91.0%，相對標準偏差（RSD）不大于10.5%。土霉素及差向土霉素、四環(huán)素及差向四環(huán)素的檢測限為1 μg/kg，金霉素及差向金霉素、強力霉素的檢測限為2 μg/kg。

Nozal MJ等人用液相色譜-光電二級管檢測器-電噴霧電離質(zhì)譜（LC-DAD-ESI-MS）檢測蜂蜜中泰妙菌素的殘留，檢測限為0.5～1.2 μg/kg。

高效液相色譜的特點是在室溫下進行分析，特別是對非揮發(fā)性及熱不穩(wěn)定性農(nóng)藥的分析優(yōu)勢更為明顯，缺點是用于殘留物分析的檢測器還不十分靈敏，這是因為只有少數(shù)農(nóng)藥具有天然熒光，液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術的出現(xiàn)為農(nóng)藥分析提供了更加便利的條件，使其檢測范圍加大。高效液相色譜法特異性高、精確度高，但是抗生素的含量少時，不易檢測。針對高效液相色譜存在的各種缺陷，聯(lián)用技術不斷推陳出新，是當今蜂產(chǎn)品中抗生素殘留檢測研究最多、最熱門的檢測方法。隨著我國對食品安全工作的重視及儀器和技術的發(fā)展，高效液相色譜在蜂產(chǎn)品藥物殘留檢測中將得到更廣泛的應用。

2.4 生物芯片檢測技術

生物芯片即生物傳感器，作為一種新型檢測技術，其操作方便、快速準確，可以重復使用和連續(xù)使用，在單一芯片中完成從樣本的預處理、分離、稀釋、混合、化學反應、檢測到產(chǎn)物提取的全過程，大大提高了檢測速度和分析效率。

生物芯片檢測技術是國際分析領域前沿檢測技術,對大量檢測樣本具有快速、靈敏、準確、抗干擾性、高通量的特點。由瑞典必安科貝爾法斯特研究中心領先研究的生物檢測芯片,被日本貿(mào)易商用于蜂蜜進出口檢測。因此，該技術的發(fā)展可提高我國蜂產(chǎn)品檢測技術的靈敏度與快速檢測水平，對提升我國出口企業(yè)產(chǎn)品和品牌的美譽度有一定幫助。

3 結語

目前，對蜂產(chǎn)品中抗生素殘留檢測的方法較多，檢測限一般低于最大殘留量。色譜法尤其是高效液相色譜法（HPLC）是目前研究藥物殘留最常用的檢測方法，具有高效、快速、靈敏度高等特點，但前處理比較復雜；酶聯(lián)免疫法經(jīng)過20多年來的不斷改進和發(fā)展，同時伴隨著單克隆技術的應用和抗體提純酶制備技術的提高，其特異性與靈敏度也有很大提高，該方法已經(jīng)廣泛應用于檢測農(nóng)獸藥和抗生素殘留，可在基層實驗室進行，并被多國政府部門認可。但該法存在一定的交叉反應，且包被和洗滌2個關鍵步驟如果操作不當，會降低測定的靈敏度和準確度，不適合做殘留確證，而適用于快速篩選。分析技術聯(lián)用分析范圍廣、靈敏度高、結果精確可靠，但所需儀器要求高，不易在基層推廣，多用于殘留確證。

2007年初，農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（北京）對生物芯片檢測技術進行了驗證試驗，認為該技術對抗生素檢測具有先進性、實用性和廣闊的開拓前景，但現(xiàn)階段其發(fā)展受到很多相關技術的制約，如費用高、技術復雜等，相信隨著技術的發(fā)展和相關部門的不斷投入，各具特色的生物芯片檢測技術將是蜂產(chǎn)品中抗生素殘留檢測的重要工具。

蜂蜜被廣泛用于食品、醫(yī)藥和保健品工業(yè)中。我國近幾年的蜂類產(chǎn)品的貿(mào)易量主要為28～30×104t，主要銷量往歐盟、美洲、日本等地。目前，蜂產(chǎn)品中氨基糖苷類抗生素的殘留阻礙了蜂產(chǎn)品的出口，原因是蜂蜜中氨基糖苷類抗生素容易引起人的障礙性貧血，對于人類的身體健康其實是有著比較大的潛在危害。因此，提高我國蜂蜜殘留的檢測水平，是保障蜂蜜中殘留的氨基糖苷類抗生素符合進出口貿(mào)易限量標準的有效手段。