丹參酮ⅡA對(duì)腦缺血保護(hù)的作用機(jī)制研究進(jìn)展*

王媛媛，陶娌娜，宋燕青，李 楠

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院藥學(xué)部，吉林 長(zhǎng)春 130021）

缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制為腦血流供應(yīng)障礙造成大腦缺血缺氧［1］，隨著生物學(xué)技術(shù)及影像學(xué)的發(fā)展，多數(shù)證據(jù)支持其與氧自由基產(chǎn)生過(guò)多及消耗不足、缺血缺氧的大腦環(huán)境造成神經(jīng)細(xì)胞壞死與凋亡、免疫答應(yīng)與炎性反應(yīng)失衡等密切相關(guān)［2-4］。丹參是唇形科Labiatae多年生草本植物，最初被收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有很高的藥用價(jià)值，味苦，性微寒，具有活血化瘀、祛瘀止痛、化癰清心的功效［5］。丹參酮（tanshinone）是丹參的脂溶性化合物的主要成分，其中丹參酮ⅡA（TanshinoneⅡA，Tan ⅡA）在丹參酮活性成分中含量最高，其通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、減輕炎性反應(yīng)和抑制細(xì)胞凋亡等途徑發(fā)揮藥理作用，具有多靶點(diǎn)、多層次、多環(huán)節(jié)的腦保護(hù)功效［6-8］。在此對(duì)丹參酮ⅡA對(duì)腦缺血保護(hù)的作用機(jī)制的研究進(jìn)行綜述。

1 抑制細(xì)胞凋亡

1.1 概述

缺血性腦卒中是由腦血流的突然減小或完全中斷造成腦組織缺氧缺糖，繼而引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)造成的。早期腦組織缺血表現(xiàn)為中央缺血區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞呈不可逆性壞死，后期表現(xiàn)為缺血半暗帶細(xì)胞凋亡［9］。細(xì)胞凋亡是程序式過(guò)程，丹參酮ⅡA可通過(guò)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡而保護(hù)腦細(xì)胞，以及縮小梗死區(qū)域。

1.2 抑制凋亡誘導(dǎo)因子表達(dá)

抑制Caspase-3表達(dá)：半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（Caspases）以無(wú)活性的結(jié)構(gòu)酶原的形式廣泛存在于細(xì)胞中。目前，已知14種哺乳動(dòng)物的Caspases中，約有8種被認(rèn)為參與著細(xì)胞凋亡的過(guò)程，其中最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶被認(rèn)為是Caspase-3，在凋亡程序中占據(jù)樞紐地位［10］。缺血性腦卒中所致缺氧和缺糖細(xì)胞環(huán)境可上調(diào)Caspase-3前體的表達(dá)，引發(fā)Caspase-3前體去磷酸化，使 Caspase-3活化，加速細(xì)胞凋亡進(jìn)程［11］。韓若東等［12］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血造模完成后，經(jīng)染色后發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)率升高，細(xì)胞凋亡數(shù)目增加，腦部梗死體積較急性發(fā)作期進(jìn)一步擴(kuò)大。給予丹參酮ⅡA后，Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)率降低，細(xì)胞凋亡數(shù)目減少。多項(xiàng)證據(jù)均支持丹參酮ⅡA通過(guò)抑制Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)而保護(hù)腦缺血后的受損神經(jīng)元。

抑制Bax表達(dá)：Bcl-2和Bax蛋白是一對(duì)重要的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，具有細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。Bax同時(shí)也是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程，而B(niǎo)cl-2 具有抑制 Bax的作用［13］。Bcl-2 和 Bax蛋白的表達(dá)決定細(xì)胞的生存情況，當(dāng)Bax蛋白處于優(yōu)勢(shì)地位時(shí)細(xì)胞死亡速度加快，而當(dāng)Bcl-2蛋白處于優(yōu)勢(shì)地位時(shí)細(xì)胞死亡速度減慢。在大鼠局灶性腦缺血模型中，Bax蛋白由胞漿快速轉(zhuǎn)移至線粒體，并與Bcl-2結(jié)合，引起線粒體膜通透轉(zhuǎn)運(yùn)孔的開(kāi)放，釋放凋亡誘導(dǎo)因子及細(xì)胞色素 C，推動(dòng)細(xì)胞凋亡過(guò)程［13］。支文煜［14］研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能改善缺血-再灌注引起的Bax表達(dá)增高和Bcl-2表達(dá)降低，通過(guò)抑制線粒體內(nèi)促凋亡蛋白的釋放發(fā)揮抗凋亡作用。

1.3 調(diào)節(jié)凋亡信號(hào)通路

神經(jīng)元凋亡是由于細(xì)胞內(nèi)死亡程序的啟動(dòng)致使細(xì)胞“自殺”的過(guò)程，呈現(xiàn)能量依賴性。神經(jīng)元死亡程序啟動(dòng)后，神經(jīng)元細(xì)胞體積變小，細(xì)胞通透性改變，胞質(zhì)減少，細(xì)胞核固縮于邊緣，DNA降解，最終形成多個(gè)凋亡小體被吞噬細(xì)胞吞噬。神經(jīng)元細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制十分復(fù)雜，目前認(rèn)為主要信號(hào)通路分為外途徑（死亡受體途徑）和內(nèi)途徑（包括線粒體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑）。

線粒體通路：線粒體通路介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡與缺血性腦損傷嚴(yán)重程度有關(guān)。嚴(yán)重缺血性腦損傷可造成線粒體三磷酸腺苷（ATP）合成不足，細(xì)胞能量供應(yīng)不足，最終因能量枯竭導(dǎo)致神經(jīng)元壞死。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）處于線粒體內(nèi)外膜之間，當(dāng)細(xì)胞遭受到各種外源性刺激時(shí)，引起MPTP開(kāi)放，線粒體通透性增加，線粒體中的細(xì)胞色素C被釋放進(jìn)入胞漿，特異性結(jié)合凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）形成一種多聚復(fù)合物，激活 Caspase-3［15］，被激活的 Caspase-3 通過(guò)剪切靶細(xì)胞DNA依賴性蛋白激酶等，不可逆地改變其結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞凋亡。Bcl-2基因是一種癌基因，與其相關(guān)的膜蛋白是一種強(qiáng)有力的細(xì)胞凋亡抑制因子，其在調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。李浩等［16］采用線栓法建立局灶性腦缺血-再灌注模型，發(fā)現(xiàn)造模24 h后，模型組相對(duì)假手術(shù)組Bcl-2和Caspase-3表達(dá)增加。丹參酮ⅡA高、低劑量組較模型組腦組織缺血面積縮小，Bcl-2表達(dá)升高，且Caspase-3表達(dá)降低。

死亡受體通路：包括死亡因子受體（Fas）／死亡因子Fas配體（FasL）死亡通路及腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白（TNFR）死亡通路。Fas是一種Ⅰ型膜蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為45×103；而FasL是一種Ⅱ型膜蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為37×103。Fas能與FasL特異性結(jié)合，從而迅速激活caspase-8，引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，裂解DNA，致使細(xì)胞凋亡［17］。韓峰等［18］證明，丹參酮ⅡA能調(diào)控 Fas／FasL死亡通路，抑制Caspase-8的表達(dá)，減少肺腫瘤細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡。TNFR死亡通路是通過(guò)TNF和TNFR-1的特異性結(jié)合，從而聚集受體死亡結(jié)構(gòu)域。對(duì)細(xì)胞凋亡有直接和間接2種影響，一是TNFR銜接蛋白（TRADD）可誘導(dǎo)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白FADD的聚集，直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；二是TNF和TNFR-1結(jié)合后，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和Apaf-1，相關(guān)凋亡因子被釋放，間接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡進(jìn)程加快。ZHU等［19］發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可抑制大鼠缺血再灌注后核因子κB亞基p65親和肽（NF-κBp65）的表達(dá)，從而降低Apaf-1水平，抑制細(xì)胞凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)廣泛存在于真核細(xì)胞中，是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為信號(hào)傳導(dǎo)的樞紐平臺(tái)，參與蛋白質(zhì)合成、折疊和寡聚化，鈣離子的儲(chǔ)存，脂類及類固醇等物質(zhì)的代謝、合成等過(guò)程。當(dāng)細(xì)胞受到多種病理生理刺激，如氧化應(yīng)激反應(yīng)、缺血缺氧環(huán)境、鈣離子水平失衡及病毒感染等時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，此過(guò)程既能修復(fù)早期或損傷較輕的細(xì)胞，又能清除過(guò)度損傷的細(xì)胞，是重要的維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的過(guò)程［20］。Parecoxib作為一種新型環(huán)氧合酶-2（COX-2）抑制劑，可抑制腦缺血再灌注損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，控制腦缺血后缺血半暗帶面積進(jìn)一步擴(kuò)大。DONG等［21］發(fā)現(xiàn)，Parecoxib可顯著抑制缺血半暗帶Chop表達(dá)及Caspase-12活性，進(jìn)而減輕神經(jīng)元凋亡，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和信號(hào)傳導(dǎo)途徑或可成為缺血性腦卒中等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療新靶點(diǎn)。

2 抑制炎性反應(yīng)

2.1 概述

腦缺血-再灌注后，氧自由基及其他信使可活化炎性細(xì)胞，釋放趨化因子，上調(diào)黏附分子，白細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，血流受阻形成“無(wú)復(fù)流現(xiàn)象”，微血管閉塞，同時(shí)聚集的白細(xì)胞可釋放氧自由基、蛋白水解酶等作用于內(nèi)皮細(xì)胞，破壞血-腦屏障，形成腦水腫，激活的白細(xì)胞在微血管內(nèi)聚集，又可釋放大量的炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，使更多的中性粒細(xì)胞聚集到炎性反應(yīng)部位，從而加重炎性反應(yīng)，造成惡性循環(huán)［22］。丹參酮ⅡA通過(guò)抑制炎性細(xì)胞的活化及趨化因子、炎性細(xì)胞因子表達(dá)，抑制細(xì)胞及體液免疫答應(yīng)，從而降低炎性反應(yīng)。

2.2 抑制參與炎性反應(yīng)的細(xì)胞活性

小膠質(zhì)細(xì)胞：是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種免疫細(xì)胞，可實(shí)時(shí)反映大腦微環(huán)境情況，并對(duì)細(xì)胞外信號(hào)刺激有一定反應(yīng)；同時(shí)，還具有吞噬表達(dá)異常細(xì)胞、細(xì)胞碎片的能力，在維持正常細(xì)胞的平衡中發(fā)揮重要作用。缺血性腦卒中造成的缺血缺氧環(huán)境可引發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞的異常表達(dá)及形態(tài)學(xué)的改變，從而激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放出多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞毒性介質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷及凋亡，最終加重腦損傷。蔡琳等［23］研究證實(shí)，丹參酮ⅡA可通過(guò)對(duì)NLRP 3炎癥體信號(hào)通路中的白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、凋亡蛋白Caspase-1及IL-18的表達(dá)產(chǎn)生抑制，進(jìn)而發(fā)揮OGD／R的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

星形膠質(zhì)細(xì)胞：可分泌多種炎性介質(zhì)。缺血性腦卒中造成的缺血缺氧環(huán)境可導(dǎo)致機(jī)體啟動(dòng)免疫應(yīng)激，活化星形膠質(zhì)細(xì)胞，分泌與組織相容性較好的復(fù)合物和刺激因子，活化T輔助淋巴細(xì)胞，抑制IL-12的表達(dá)，發(fā)生免疫答應(yīng)，引起炎性反應(yīng)。同時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應(yīng)中具有協(xié)同作用。小膠質(zhì)細(xì)胞可以分泌細(xì)胞因子和氧自由基而影響星形膠質(zhì)細(xì)胞活性，而星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性因子的活化，可以產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，兩者相互作用加重缺血-再灌注后神經(jīng)元炎性反應(yīng)［24］。利用Zea Longa線栓法可以制造大鼠腦缺血性動(dòng)脈梗死模型，神經(jīng)細(xì)胞纖維化，膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）分泌增多，而丹參酮ⅡA可降低GFAP水平，使受影響區(qū)域的細(xì)胞炎癥及死亡進(jìn)程減慢，最終發(fā)揮腦保護(hù)作用［25］。

2.3 抑制細(xì)胞因子表達(dá)

IL：IL-1有2種不同的異形體，即IL-1α和IL-1β，可結(jié)合不同的受體而發(fā)揮作用。丹參酮ⅡA可下調(diào)IL-1β表達(dá)，抑制中性粒細(xì)胞聚集、浸潤(rùn)腦部，降低炎性反應(yīng)［26］，即給予 IL-1β 抗體，預(yù)先阻斷 IL-1β 的表達(dá)，IL-6是腦炎性損傷的重要因子，腦缺血急性期時(shí)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫等系統(tǒng)均處于一種激活的狀態(tài)，IL-6分泌增多，以增加機(jī)體抗損傷的修復(fù)能力，可減小大鼠腦缺血-再灌注后壞死面積，降低神經(jīng)功能缺失評(píng)分，改善神經(jīng)功能。孫有利等［27］的研究發(fā)現(xiàn)，用丹參酮ⅡA預(yù)處理后的缺血性腦卒中大鼠，IL-1β及IL-6水平均明顯降低，丹參酮ⅡA發(fā)揮抗炎活性，保護(hù)神經(jīng)元。

TNF-α：TNF-α通過(guò)多種途徑參與腦損傷，可激活內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管收縮并維持凝血狀態(tài)，進(jìn)一步減小腦部血流，加重缺血性腦損傷，并提高腦卒中二次復(fù)發(fā)率；刺激急性期反應(yīng)蛋白合成增加，誘發(fā)炎性反應(yīng)；促進(jìn)興奮性氨基酸及一氧化氮（NO）釋放，加重神經(jīng)毒性。丹參酮ⅡA能下調(diào)TNF-α在體內(nèi)的表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)［28］。

2.4 抑制趨化因子表達(dá)

趨化因子是一類細(xì)胞因子，相對(duì)分子質(zhì)量較小。此類細(xì)胞因子在細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)及炎性細(xì)胞招募過(guò)程中起到重要作用，分為C-X-C趨化因子和C-C趨化因子。IL-1和TNF-α均可促進(jìn)趨化因子的產(chǎn)生、并增強(qiáng)其活性。單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）是一種趨化蛋白，在炎性反應(yīng)中高表達(dá)。急性缺血性腦卒中患者腦脊液中的MCP-1表達(dá)水平明顯高于健康者。給予丹參酮ⅡA治療后，MCP-1及TNF-α明顯降低，同時(shí)可改善腦缺血半暗帶區(qū)白細(xì)胞浸潤(rùn)情況［29］。

2.5 抑制黏附因子表達(dá)

細(xì)胞間黏附分子（ICAM-1）是一種分布于全身的重要炎性因子，多存在于炎癥部位的細(xì)胞表面，在白細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。通常情況下，ICAM-1水平較低，而當(dāng)受到如 TNF-α，IL-1β，NF-κB等炎性細(xì)胞因子刺激后，ICAM-1表達(dá)急劇升高。腦缺血后，細(xì)胞黏附因子表達(dá)升高，從而加強(qiáng)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，最終促使白細(xì)胞穿越內(nèi)皮細(xì)胞到達(dá)腦實(shí)質(zhì)，因此黏附過(guò)程在白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移過(guò)程中至關(guān)重要。KAMIMURA等［30］的研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可抑制ICAM-1的表達(dá)，抑制白細(xì)胞浸潤(rùn)神經(jīng)細(xì)胞，從而緩解局部炎性反應(yīng)，達(dá)到治療缺血性腦卒中的目的。

3 抑制氧化應(yīng)激過(guò)程

氧化應(yīng)激的基本機(jī)制是體內(nèi)氧化-抗氧化動(dòng)態(tài)平衡被打破，細(xì)胞還原電位下降導(dǎo)致氧自由基大量產(chǎn)生，誘發(fā)氧化應(yīng)激［31］。缺血性腦卒中患者產(chǎn)生氧自由基的過(guò)程分為三部分。首先，隨著線粒體去極化水平的降低，產(chǎn)生大量氧自由基；其次，伴隨鎂離子水平升高，ATP代謝產(chǎn)物使黃嘌呤氧化酶被激活，產(chǎn)生氧自由基；最后隨著鈣離子水平的升高，還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化鎂產(chǎn)生氧自由基。

提高超氧化物歧化酶活性：氧自由基是人體在利用氧時(shí)產(chǎn)生的損害細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和DNA的一種分子，其不能在體內(nèi)穩(wěn)定存在，還會(huì)影響到體內(nèi)其他分子的穩(wěn)定性，造成細(xì)胞和組織的廣泛性損傷，且與衰老密切相關(guān)。氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫的過(guò)程需要超氧化物歧化酶（SOD）的催化，過(guò)氧化氫繼續(xù)經(jīng)氧化氫酶或谷胱甘肽過(guò)氧化物酶分解成為水，清除自由基的過(guò)程也是保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激傷害的過(guò)程。SOD活性間接反映了機(jī)體對(duì)抗氧化應(yīng)激、清除自由基的能力。馮晶晶等［32］的研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可顯著降低缺血腦組織中脂質(zhì)過(guò)氧化物（MDA）的含量，增強(qiáng)SOD活性，并提高ATP水平，降低氧化應(yīng)激程度，減少體內(nèi)自由基的形成，增加機(jī)體清除自由基的能力，并改善能量代謝障礙，這可能與丹參酮ⅡA降低缺血性腦卒中神經(jīng)細(xì)胞中鈣離子水平有關(guān)。

提高谷胱甘肽過(guò)氧化酶（GSH-Px）活性：機(jī)體內(nèi)廣泛存在的清除氧自由基的催化酶，可清除由氫氧負(fù)離子、活性氧誘導(dǎo)形成的MDA，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整和細(xì)胞器功能的健全。LIN等［33］的研究顯示，大鼠經(jīng)腦缺血-再灌注造模后，GSH-Px活性較正常大鼠增強(qiáng)，推測(cè)與大鼠缺血后的代償性反應(yīng)存在一定聯(lián)系，當(dāng)給予丹參酮ⅡA干預(yù)后，GSH-Px活性進(jìn)一步增強(qiáng)。表明丹參酮ⅡA可以通過(guò)提高GSH-Px水平而增強(qiáng)抗氧自由基效用。

4 結(jié)語(yǔ)

丹參可通過(guò)以下3個(gè)方面保護(hù)腦缺血組織：一是抑制炎性細(xì)胞的活化過(guò)程，減少炎性因子及黏附分子的表達(dá)與分泌，減少缺血腦組織中中性粒細(xì)胞及白細(xì)胞的浸潤(rùn)、聚集，減輕組織因過(guò)度的炎性反應(yīng)所致?lián)p傷；二是通過(guò)抑制細(xì)胞相關(guān)凋亡誘導(dǎo)因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，最終抑制受損神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，縮小腦梗死體積；三是通過(guò)提高抗過(guò)氧化物酶活性，抑制氧化應(yīng)激過(guò)程，保護(hù)腦缺血細(xì)胞。以上多數(shù)理論依據(jù)建立在試驗(yàn)動(dòng)物模型上，缺少臨床證據(jù)，故應(yīng)開(kāi)展大樣本、多中心的隨機(jī)臨床試驗(yàn)研究，以實(shí)踐其基礎(chǔ)研究的準(zhǔn)確性。