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    天津市監(jiān)獄羈押人員中結(jié)核病患者臨床分離菌株的基因型分析

    2019-01-05 03:54:20謝彤王春花趙慧巨韓芳穆成王志銳孫蕊
    中國(guó)防癆雜志 2019年3期
    關(guān)鍵詞:分支監(jiān)獄結(jié)核病

    謝彤 王春花 趙慧 巨韓芳 穆成 王志銳 孫蕊

    作者單位:300011 天津市疾病預(yù)防控制中心病原生物檢測(cè)所(謝彤、王志銳);天津市結(jié)核病控制中心結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室(王春花、趙慧、巨韓芳、穆成、孫蕊)

    全球范圍內(nèi)不同國(guó)家結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查中監(jiān)獄羈押人群的結(jié)核病發(fā)病率均明顯高于普通人群,其中監(jiān)獄羈押人員中活動(dòng)性肺結(jié)核平均發(fā)病率為普通人群的23倍[1]。結(jié)核分枝桿菌(MTB)在傳播過(guò)程中,經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化已經(jīng)形成多個(gè)不同的基因型,全球不同地區(qū)流行的MTB的主要基因型并不相同,其中北京基因型MTB是我國(guó)流行的主要基因型[2]。北京基因型菌株基因組核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factors,NTF)區(qū)如果含有插入序列(IS)6110者則為北京基因型現(xiàn)代株,如果NTF區(qū)中IS6110缺失則為北京基因型古代株[3]。此外,根據(jù)北京基因型MTB在進(jìn)化過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)某些大片段的差異區(qū)域(regions of difference,RD)缺失,根據(jù)RD181、RD150和RD142的缺失情況,北京基因型菌株被分為4個(gè)不同進(jìn)化分支[4]。鑒于監(jiān)獄羈押人員為結(jié)核病的高發(fā)人群,筆者研究天津監(jiān)獄羈押結(jié)核病患者中北京基因型MTB流行特征,以揭示菌株不同進(jìn)化分支的傳播情況。

    材料和方法

    1.菌株來(lái)源:收集2013年1月至2016年6月從天津市監(jiān)獄管理局羈押人員不同結(jié)核病患者痰標(biāo)本中分離培養(yǎng)的124株分枝桿菌菌株,所有菌株均經(jīng)過(guò)對(duì)硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼生化試驗(yàn)鑒定證實(shí)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。實(shí)驗(yàn)中所用的H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品所。

    2.試劑和儀器:PCR擴(kuò)增所用的Taq酶分別為2×Taq PCR Mastermix(天根生化科技有限公司,北京)和Q5 Hight-Fidelity 2×Master-Mix(NEB公司,北京);溶菌酶、蛋白酶K、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基磺酸鈉(SDS)等MTB基因組提取試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。PCR擴(kuò)增儀為德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn);NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)為美國(guó)ThermoScientific公司生產(chǎn)。

    3.MTB基因組提?。簩⑸L(zhǎng)于改良羅氏培養(yǎng)基中的MTB菌落轉(zhuǎn)移至裝有磷酸鹽緩沖液(PBS)的1.5 ml Eppendorf管中,菌株經(jīng)80 ℃水浴滅活后加入溶菌酶過(guò)夜消化,采用CTAB法提取MTB菌株的基因組DNA[5]。提取后的基因組DNA溶于1×TE緩沖液中,使用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定基因組含量。

    4.基因型鑒定:基因組中RD207與RD105片段缺失是北京基因型MTB有別于其他基因型MTB的分子特征。采用多重PCR試驗(yàn),根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳中擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度判定菌株基因組中RD207與RD105的缺失情況[5-6]。RD207缺失的MTB菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為393 bp;RD207完整的MTB菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為570 bp。RD105缺失的MTB菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為547 bp;RD105完整的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為330 bp。

    5.基因組NTF區(qū)域IS6110分析:北京基因型菌株基因組NTF區(qū)IS6110插入序列的分析采用Wada等報(bào)道的方法[7]。使用MDR6和MDR6r擴(kuò)增引物,通過(guò)PCR試驗(yàn)分析菌株NTF區(qū)中是否存在IS6110序列。如果NTF區(qū)含有至少1個(gè)拷貝的IS6110序列,則為北京基因型現(xiàn)代株,其擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1.5 kb;反之則為北京基因型古代株,其擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為302 bp。25 μl PCR反應(yīng)體系中含有12.5 μl的Master Mix Taq酶,0.4 μmol/L的引物,以及10~50 ng基因組DNA。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,63 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。

    6.MTB北京基因型菌株RD多態(tài)性分析:采用Q5 Hight-Fidelity 2×Master-Mix Taq酶建立的多重PCR反應(yīng),分析MTB基因組中差異區(qū)域RD181、RD150與RD142的缺失情況,根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度判斷差異區(qū)域在菌株基因組中是否缺失。25 μl PCR反應(yīng)體系中含有12.5 μl的Q5 Hight-Fidelity 2×Master-Mix Taq酶,0.5 μmol/L的引物,以及10~50 ng基因組DNA。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。不同差異區(qū)域擴(kuò)增引物序列參考Reed等[6]的報(bào)道。

    結(jié) 果

    1.基因分型:124株MTB菌株基因組中,同時(shí)發(fā)生RD105和RD207缺失的MTB有116株(93.5%),均屬于北京基因型;8株(6.5%)為非北京基因型。

    2.北京基因型菌株的進(jìn)化分支:116株北京基因型MTB菌株中有20株(17.2%)基因組NTF區(qū)IS6110序列缺失,為北京基因型古代株;96株(82.8%)MTB基因組NTF區(qū)存在IS6110序列,為北京基因型現(xiàn)代株。

    根據(jù)基因組中NTF區(qū)IS6110序列的存在情況和差異區(qū)域的多態(tài)性,北京基因型菌株被分為4個(gè)進(jìn)化分支(表1)。菌株基因組中存在RD181差異區(qū)域的RD181(+)菌株被認(rèn)為是北京基因型最早期的進(jìn)化分支。在116株菌株中,RD181(+)的菌株為7株(6.0%),均為NTF區(qū)不含IS6110插入序列的北京基因型古代株;RD181(-)的菌株為109株(94.0%)。在RD181(-)的菌株中,基因組NTF區(qū)無(wú)IS6110插入序列的北京基因型古代株有13株,占全部北京基因型菌株的11.2%;基因組NTF區(qū)存在IS6110插入序列的北京基因型現(xiàn)代株有96株,占全部北京基因型菌株的82.8%。96株北京基因型現(xiàn)代菌株中,95株基因組中有完整的RD150序列,占全部北京基因型菌株的81.9%,僅1株為RD150缺失的北京基因型現(xiàn)代株,占全部北京基因型菌株的0.9%。RD142差異序列存在于所有分析的北京基因型菌株基因組中。

    討 論

    北京基因型MTB在包括我國(guó)在內(nèi)的東亞地區(qū)的流行最為廣泛,在臨床分離株中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),我國(guó)的東北、京津冀、河南等北方地區(qū)北京基因型MTB占臨床分離株的90%以上[8]。北京基因型MTB在俄羅斯、南非、東南亞、歐洲等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)也同樣廣泛流行,是目前在全球傳播最廣的基因型[9]。本研究發(fā)現(xiàn),北京基因型菌株在天津羈押人群中占臨床分離菌株的93.5%,與天津普通人群肺結(jié)核患者中北京基因型MTB的構(gòu)成比相近[10]。

    MTB的進(jìn)化途徑主要是通過(guò)大片段的缺失、轉(zhuǎn)位及單核苷酸的突變[11]。其中在大片段進(jìn)化路徑中MTB首先發(fā)生RD207與RD105缺失進(jìn)化成為北京基因型;北京基因型MTB在以后的持續(xù)進(jìn)化過(guò)程中,不同的菌株按順序可能出現(xiàn)RD181缺失、IS6110在NTF區(qū)的轉(zhuǎn)位插入形成現(xiàn)代株和RD150的缺失,從而形成不同MTB菌株大片段多態(tài)性[12-13]。本研究中,北京基因型現(xiàn)代株占全部北京基因型菌株的82.8%,說(shuō)明天津監(jiān)獄羈押人群結(jié)核病患者感染的菌株以北京基因型現(xiàn)代株為主;在天津地區(qū)普通人群中占86.5%[10]。提示天津地區(qū)普通人群與監(jiān)獄羈押人群結(jié)核病患者感染的北京基因型菌株均以現(xiàn)代株為主?;仡櫺粤餍胁≌{(diào)查顯示,卡介苗(BCG)接種者中感染北京基因型現(xiàn)代株的結(jié)核病患者比例明顯高于未接種者,提示北京基因型現(xiàn)代株較該基因型的古代株更容易逃避BCG接種所產(chǎn)生的免疫,導(dǎo)致BCG的接種可能選擇性地促進(jìn)MTB北京基因型現(xiàn)代株在人群中的傳播[14]。

    注“+”表示序列完整;“-”表示序列缺失

    基于菌株基因組中大片段多態(tài)性分析證實(shí),天津監(jiān)獄羈押人群中至少有4個(gè)北京基因型MTB進(jìn)化分支流行,其中RD150(+)的北京基因型現(xiàn)代株占全部116株北京基因型菌株的81.9%,明顯高于其他3個(gè)北京基因型分支。天津地區(qū)普通人群中感染RD150(+)北京基因型現(xiàn)代株者占78.1%[10],提示這一北京基因型進(jìn)化分支無(wú)論是在普通人群中,還是監(jiān)獄羈押人群中均為主要流行分支,而且在上述不同人群中肺結(jié)核患者感染RD150(+)北京基因型現(xiàn)代株的構(gòu)成比相近。事實(shí)上,北京基因型在全球各地廣泛傳播流行也是由其現(xiàn)代株分支在人群的近期傳播所導(dǎo)致[15]。引起這一北京基因型現(xiàn)代株廣泛流行的機(jī)制還未完全闡明,采用小鼠肺感染模型對(duì)北京基因型不同進(jìn)化分支菌株的毒性研究中證實(shí)RD150(+)北京基因型現(xiàn)代菌株較北京基因型古代株引發(fā)小鼠更快死亡,菌株對(duì)肺組織造成更大的病理?yè)p傷,提示這一進(jìn)化分支具有更強(qiáng)的毒性[16]。在所有從天津監(jiān)獄肺結(jié)核患者分離的菌株中,僅有1株北京基因型現(xiàn)代株中發(fā)生RD150差異區(qū)域的缺失,說(shuō)明在RD150(-)北京基因型現(xiàn)代菌株在天津監(jiān)獄羈押人群中并未廣泛流行,同時(shí)也提示RD150差異區(qū)域的缺失并不能促進(jìn)北京基因型MTB在人群中傳播。雖然其他地區(qū)北京基因型菌株基因組中有RD142缺失的報(bào)道,但包括本研究在內(nèi)我國(guó)不同地區(qū)基因大片段多態(tài)性對(duì)菌株進(jìn)化研究中均未發(fā)現(xiàn)RD142缺失的北京基因型菌株,提示RD142差異區(qū)域在我國(guó)流行的北京基因型菌株中并不具備多態(tài)性。

    綜上所述,北京基因型MTB是天津監(jiān)獄羈押結(jié)核病患者感染的優(yōu)勢(shì)菌株,至少發(fā)現(xiàn)4個(gè)北京基因型進(jìn)化分支在監(jiān)獄肺結(jié)核患者中流行;但結(jié)核病患者感染不同進(jìn)化分支的比例存在較大的差異,RD150(+)北京基因型現(xiàn)代菌株是導(dǎo)致北京基因型在天津監(jiān)獄羈押人員中傳播的主要分支,提示該進(jìn)化分支較其他進(jìn)化分支具有更強(qiáng)的毒性。今后在針對(duì)引起北京基因型廣泛傳播的分子機(jī)制研究中應(yīng)重點(diǎn)對(duì)RD150(+)北京基因型現(xiàn)代這一分支開(kāi)展研究,同時(shí)也十分有必要著重針對(duì)RD150(+)北京基因型現(xiàn)代菌株的流行開(kāi)展監(jiān)測(cè)。

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