免疫相關因子對結核性腦膜炎診斷的研究進展

陳建華 楊小艷 馮 飛 羅 勇△

1)遵義醫(yī)學院，貴州 遵義 563000 2)貴州航天醫(yī)院神經內科，貴州 遵義 563000 3)遵義醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院神經內科，貴州 遵義 563000

結核性腦膜炎(TBM)是一種常見的肺外結核病，5%～15%累及神經系統(tǒng)。近年來，由于結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)基因的變異和獲得性免疫缺陷疾病(AIDS)的增多，結核病的患病率和致死率有所升高。研究發(fā)現，艾滋病感染者患TBM的風險最高[1]。據WHO統(tǒng)計，2016年全球有1 040萬新發(fā)結核病例，且37.40萬人死于TBM[2]。雖然CSF培養(yǎng)是診斷TBM的金標準，但其所需時間長，敏感度低而限制了在臨床上的實際應用價值[3]。另外TBM的臨床表現及常規(guī)檢查缺乏特異性，當患者神經系統(tǒng)癥狀明顯(如腦神經麻痹[4]、視盤腫脹[5]、顱壓增高、意識水平改變)時，患者可能留有永久性的后遺癥[6]。TBM的早期診斷和治療的延誤，將嚴重影響患者的預后[7-8]，甚至是致命的[9]。目前尚缺乏經濟、簡便的實驗方法來早期診斷TBM。因此，尋找一種更為快速、方便、可靠的診斷方法很有研究價值。

1 單項指標

1．1 γ干擾素γ干擾素釋放試驗(gamma interferon release assays，IGRAs)是T細胞介導的體外測試技術，當人體感染MTB，接受其特異性抗原刺激后，T細胞產生免疫應答，當再次接受結核特異性抗原刺激后，活化的T細胞產生γ干擾素(gamma interferon，IFN-γ)，可反映機體受MTB感染后的免疫應答狀態(tài)[10]。目前臨床上采用結核感染T細胞斑點檢測(tuberculosis infection T cell spot test，T-SPOT.TB)和酶聯免疫吸附實驗法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測IFN-γ的濃度。PAN等[11]采用T-SPOT.TB法檢測患者CSF的IFN-γ含量，結果發(fā)現CSF中IFN-γ的曲線下面積(area under curve，AUC)為0.81，敏感度60.80%，特異性97.20%，表明T-SPOT.TB的診斷準確度高于常規(guī)實驗室檢測。T-SPOT.TB的高特異性使其成為TBM快速診斷中有用的檢測方法。此實驗靈敏度低的原因可能是樣本數的不足影響了實驗的檢測結果。但該方法不能區(qū)分結核感染是處在潛伏期還是活動期，從而影響了T-SPOT.TB在臨床上的廣泛應用[12]。另外，T-SPOT.TB費用較高，CSF中細胞數較少，也限制了其在臨床應用的推廣。與T-SPOT.TB相比，用ELISA檢測CSF中的IFN-γ更為簡便，快速，且所需CSF量較少，可以對TBM的診斷提供一種方便的檢測手段。LU等[13]采用ELISA檢測TBM患者CSF的IFN-γ水平，發(fā)現IFN-γ的AUC為0.82，當IFN-γ界值為81.36pg/mL時，靈敏度為83.00%，特異度為85.00%，且研究發(fā)現通過T-SPOT.TB檢測TBM患者外周血和ELISA檢測CSF中IFN-γ水平，可使診斷TBM的特異度和陽性預測值達到100%，表明聯合T-SPOT.TB檢測外周血和ELISA檢測CSF中IFN-γ可以提高TBM的診斷率。

1．2早期分泌性抗原靶-6 早期分泌性抗原靶-6(early secretory antigen target-6，ESAT-6)是一種由MTB早期分泌的蛋白質，主要存在于致病性MTB中，具有較高的特異性，只有當感染MTB時，其含量明顯增高，因此，ESAT-6可作為TB感染的一項敏感標志物[14-15]。SONG等[16]使用免疫組化檢測ESAT-6，探討MTB抗原在CSF單核細胞中的陽性表達診斷TBM的意義，結果發(fā)現TBM患者CSF中MTB抗原陽性百分比高于病毒性腦膜炎和健康對照組(P<0.01)，TBM的敏感度90.00%，特異度92.00%，表明ESAT-6在CSF單核細胞中的陽性表達有助于TBM的早期診斷。也有研究者使用ELISA方法探索ESAT-6對TBM的診斷價值，結果發(fā)現其靈敏度88%，特異性92.00%，且TBM患者ESAT-6的平均濃度顯著高于非TBM組，表明ELISA檢測TBM患者的CSF中的ESAT-6有助于TBM的早期診斷，且是一項具有高靈敏度和特異度的免疫診斷方法[17]。但研究者未對比ESAT-6在其他腦膜炎中表達的特異性。因此，仍有待進一步研究ESAT-6在TBM和其他腦膜炎中的診斷價值。

1．3培養(yǎng)濾液蛋白10 培養(yǎng)濾液蛋白10 (culture filtrate protein-10，CFP-10)是由MTB早期分泌，由Rv3874基因編碼的一種低分子蛋白，只存在于致病性MTB中，在卡介苗及其他分枝桿菌中不存在[18]。目前已有報道CFP-10可用于結核性胸腔積液的研究[19]。另有研究者使用膠體金免疫層析法(colloidal gold immunochromatographic strips，ICSs)來檢測人體痰液、血漿和胸腔積液的CFP-10水平，培養(yǎng)上清液的結果顯示，CFP-10開發(fā)的ICSs靈敏度91.20%，特異性88.20%，表明ICSs 是檢測MTB快速，簡單且相對有效的方法，是TB的潛在篩查工具[20]。KASHYAP等[21]研究發(fā)現，CFP-10診斷TBM的靈敏度86%，表明這種檢測方法快速、簡單、靈敏，可常規(guī)用于病理學實驗室支持臨床TBM的診斷。

1．4神經元特異性烯醇化酶神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)是神經元和神經內分泌細胞中特殊類型的酸溶性蛋白質。研究表明[22]，NSE的水平對多種神經系統(tǒng)疾病，如癲癇發(fā)作、急性腦卒中和腦損傷具有重要意義，可反映受影響細胞的損傷狀態(tài)。INOUE等[23]提出，NSE可以作為神經元損傷的標志，特別是腦膜炎。SONG等[24]探討NSE對TBM的臨床價值，發(fā)現TBM組中CSF的NSE水平明顯高于其他類型的腦膜炎組及對照組，認為NSE有助于TBM的診斷和鑒別診斷。也有研究發(fā)現合并急性粟粒性結核和TBM患者的NSE水平明顯高于單純急性粟粒性結核患者及疑似腦膜炎患者，且TBM患者與CSF中NSE的高表達顯著相關，結論為早期檢測CSF中NSE的表達水平對急性粟粒性結核繼發(fā)的TBM的診斷具有重要價值[25]。

1．5miR-29a微小RNA(microRNA，miRNA)是一種非編碼競爭性內源性的單鏈RNA，其作用是從轉錄后水平調節(jié)基因的表達，可以參與有機體和細胞生物學的過程[26]。最近有人提出，miRNA可作為結核的有用生物標志物，可能是疾病發(fā)病機制中的重要組成部分[27]。YAGI等[28]認為，miRNA 可反映大腦的病理過程。有研究表明，miRNA在肺結核感染的過程中起著重要的作用[29]。在各種miRNA中，miR-29a、miR-155、miR-155-5p、miR-125b、miR-3179a、miR-147可能是TB診斷的潛在生物標志物[30]。PAN等[31]通過定量實時聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)評估m(xù)iR-29a在外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)和CSF中的表達對兒童TBM的診斷價值，發(fā)現miR-29a在PBMC中的AUC為0.85，靈敏度為67.20%，特異度為88.50%，CSF中的AUC為0.89，靈敏度為81.10%，特異度為90.00%，兩者聯合檢測的AUC為0.93，靈敏度和特異度分別為84.40%和95.38%，提示miR-29a有助于兒童TBM的早期診斷，可減低誤診率、病死率和致殘率。但miR-29a在兒童TBM的應用仍處于研究階段，TBM感染的機制和診斷價值有待進一步研究。

2 多項指標聯合檢測

2．1 ESAT-6聯合IFN-γ 王娟娟等[32]用ELISA法檢測患者CSF中的 ESAT-6 和IFN-γ水平，結果顯示，ESAT-6的靈敏度、特異度、準確度分別為78.50%、90.20%、93.40%，IFN-γ的靈敏度、特異度、準確度分別為65.80%、78.40%、84.20%，而聯合檢測的靈敏度、特異度、準確度分別為87.60%、95.30%、97.30%。由此可見，兩者聯合可明顯提高診斷的靈敏度、特異度和陽性結果準確度，有助于TBM的早期臨床診斷。

2．2 ESAT-6聯合IFN-γ及ADA 腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)是一種與機體細胞免疫活性有關的核酸代謝酶，能使腺嘌呤核苷生成次黃嘌呤核苷。當人體感染MTB后，T淋巴細胞可通過增殖、分化，使機體產生炎癥反應。ADA的含量在T淋巴細胞中較高，TBM的病理過程伴隨著巨噬細胞和淋巴細胞的增多，因此，ADA可用于TBM的診斷。研究者[33]發(fā)現，ADA對TBM診斷的敏感度和特異度分別為89.00%和91.00%。檢測ESAT-6、IFN-γ以及ADA水平，結果發(fā)現TBM重癥組的各指標水平均高于輕癥組及對照組，相對單個指標來說，兩者甚至三者聯合檢測能提高對TBM診斷的靈敏度和準確度，以三者聯合檢測提高的幅度較顯著?？梢娭笜说穆摵蠙z測可提高TBM的檢出率，給臨床上TBM的診斷和病情的評估帶來很大幫助。

2．3 ESAT-6聯合IFN-γ及IL-8 白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)是在MTB感染或細菌的脂多糖刺激下由單核細胞產生并釋放到血流或組織液中的一種炎癥因子，可參與細胞免疫和介導炎癥反應，從而清除MTB的作用，但也能透過血腦屏障造成腦組織的損傷。已有學者發(fā)現[34]，在MTB感染的組織中證實了IL-8信使RNA的存在，表明IL-8是參與結核性肉芽腫細胞募集的重要趨化因子之一。當活動性結核感染時，患者體內的抗原特異性B淋巴細胞過度表達IL-8。TBM患者CSF中IL-8含量明顯高于VM組及非感染性神經系統(tǒng)疾病組，表明IL-8參與TBM的病理生理過程。檢測CSF中ESAT-6、IFN-γ和IL-8，結果發(fā)現，TBM組急性期的各項指標均高于正常對照組，且三者聯合檢測能明顯提高對TBM診斷的靈敏度、特異度、陽性檢測值及陰性檢測值，給TBM的早期診斷帶來一定的臨床價值。

2．4 IFN-γ、ADA聯合MMP-9 基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)是由單核細胞、巨噬細胞及小膠質細胞等分泌的一種基質金屬蛋白酶，能降解Ⅳ型、Ⅴ型膠原及細胞外基質中明膠和纖維蛋白原。最近，MAILANKODY等[35]研究發(fā)現，TBM患者的CSF中MMP-9水平是升高的。研究表明[36]，TBM組MMP-9水平明顯高于病毒性腦膜炎組及對照組。更有研究表明[37]，MMP-9可能成為TBM的治療靶點。MMP-9水平的抑制，有益于TBM的治療及神經系統(tǒng)并發(fā)癥的改善[38]。聯合檢測TBM患者CSF中IFN-γ、MMP -9和ADA水平，結果發(fā)現各指標在急性期明顯高于其恢復期及對照組，表明單獨檢測各指標的敏感度、特異度及陽性率較低，二聯檢測能提高各項檢測度，以三者聯合檢測提高的最顯著。

2．5 ESAT-6、IL-10、TNF-α聯合IFN-γ 白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)是一種免疫抑制因子，可通過抑制促炎細胞因子的產生參與機體的免疫應答和炎癥反應。在結核患者中，IL-10的表達水平會升高。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是由單核細胞、淋巴細胞等分泌的一種細胞因子，具有抗病毒、細菌、誘發(fā)炎癥反應及調節(jié)免疫功能的作用。與對照組相比，TBM患者CSF中TNF-α明顯增高。TBM患者CSF中IL-10、TNF-α、ESAT-6及IFN-γ較對照組明顯增高，聯合檢測能提高診斷TBM的檢出率，有助于TBM的早期診斷。

TBM具有較高的發(fā)病率和病死率，而TBM的早期診斷仍是一個難題，目前仍缺少一種快速、準確的檢測方法早期診斷[39]。上述免疫相關指標中，ELISA法檢測IFN-γ可為TBM的早期診斷提供一定的價值，值得進一步研究。T-SPOT.TB檢測外周血和ELISA檢測CSF中IFN-γ可以提高TBM的診斷率。另外ELISA檢測TBM患者的CSF中的ESAT-6是一項具有高靈敏度和特異度的檢測方法，有助于TBM的早期診斷。而NSE有助于TBM的診斷和鑒別診斷，可作為CNS感染的標志物之一，且早期檢測NSE的水平對急性粟粒性結核繼發(fā)的TBM的診斷具有重要價值。qRT-PCR檢測PBMC和CSF中的miR-29a水平有助于兒童TBM的早期診斷。而多項指標聯合檢測能提高TBM的檢出率，對臨床上TBM的早期診斷具有重要意義。但上述某些指標目前研究尚少，仍需進一步探索研究其診斷價值。