Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥基因突變檢測(cè)及家系調(diào)查

謝軍 劉剛 王思宇 嚴(yán)蕾 楊超 呂蓉 劉小琦

(1 四川省人民醫(yī)院皮膚病研究所激光中心 四川 成都 610000)

(2 四川省人民醫(yī)院疾病基因研究四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川 成都 610000)

假性肥大型進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchennemusculardystrophy，DMD)是源于橫紋肌的一種連鎖隱性致死性遺傳病，進(jìn)行性肌萎縮和腓腸肌無(wú)力伴小腿腓腸肌假性肥大是其典型的臨床特征，在活產(chǎn)男嬰中的發(fā)病率為1/3500～1/4000[1]。發(fā)病早、病情嚴(yán)重，嚴(yán)重影響患兒生活質(zhì)量，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重心理和經(jīng)濟(jì)壓力。本病由抗肌萎縮蛋白（dystrophin，Dys）基因突變引起，Dys由X染色體短臂Xp21基因編碼，分布于骨骼肌和心肌細(xì)胞膜的質(zhì)膜面，起細(xì)胞支架作用，維持肌纖維完整性和抗?fàn)坷δ?。Dys是肌纖維膜細(xì)胞骨架的主要成分，與肌纖維膜蛋白緊密聯(lián)合為抗肌萎縮蛋白聯(lián)合蛋白，這些蛋白與細(xì)胞的層粘蛋白連接，Dys減少引起肌無(wú)力可能與這些聯(lián)結(jié)失調(diào)有關(guān)[2-4]。由于基因變異引起的Dys缺乏是進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良的主要病因。現(xiàn)有1例臨床診斷為假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良的患者，其舅舅已因本病去世，其母親、大姨媽、表姐均可能為缺陷基因攜帶者。對(duì)患者完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查并明確診斷后，對(duì)其家屬作相關(guān)基因檢測(cè)，了解其基因突變類型后查閱有關(guān)文獻(xiàn)，與目前結(jié)果相比對(duì)，明確其是否存在目前尚且未知的基因突變類型。現(xiàn)報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院收治的1例DMD患兒，以進(jìn)行性肌無(wú)力以及運(yùn)動(dòng)功能倒退為主訴，均經(jīng)詳細(xì)詢問(wèn)病史與體檢，且聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果確診為DMD。男性患兒，年齡為9歲，父母雙親非近親結(jié)婚。診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）兒童期隱匿性發(fā)病，主要包括如下臨床表現(xiàn)：近側(cè)肌無(wú)力以及肌肉萎縮，有腓腸肌的假性肥大和/或廣泛肌萎縮等；（2）經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查，血清磷酸肌酸激酶水平是正常水平的10倍～數(shù)百倍；肌電圖呈現(xiàn)出典型性肌病表現(xiàn)，周圍神經(jīng)傳導(dǎo)速度保持正常水平；（3）除外多發(fā)性肌炎和脊肌萎縮癥、重癥肌無(wú)力等其他肌肉疾病。患兒及其家屬均對(duì)本研究方案知情，且自愿簽署知情同意書(shū)，且均經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采集患兒EDTA抗凝外周血2.0ml，應(yīng)用血液DNA提取盒（由天根生化科技有限公司生產(chǎn)），采用離心柱法將基因組DNA進(jìn)行提取，然后血樣置于-20℃的冰箱中進(jìn)行保存、待測(cè)。DNA總量＞50μL，質(zhì)量濃度在100～150ng/μL范圍之內(nèi)，采用分光光度儀對(duì)其進(jìn)行測(cè)定分析，吸光度在1.8～2.0范圍之內(nèi)。

1.2.2 多重鏈接探針依賴擴(kuò)增技術(shù)（MLPA）的檢測(cè)方法 試劑盒均購(gòu)自于荷蘭MRC-Holland公司生產(chǎn)的P035型試劑盒。嚴(yán)格按照試劑盒上的說(shuō)明進(jìn)行操作，基因組DNA變性之后，與SALSA MLPA探針之間進(jìn)行雜交反應(yīng)，雜交時(shí)間在16小時(shí)以上，然后將其中加入連接緩沖液與連接酶，進(jìn)行連接反應(yīng)，經(jīng)PCR擴(kuò)增之后，采用ABI-3130型基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳試驗(yàn)，得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用Gene Marker v1.6軟件進(jìn)行分析處理。

1.2.3 全基因組新一代測(cè)序技術(shù)（NGS）檢測(cè)方法 根據(jù)德國(guó)生產(chǎn)的QIAamp血液提取試劑盒上的說(shuō)明書(shū)將基因組DNA進(jìn)行提取，取3.0μL DNA經(jīng)美國(guó)Covaris公司生產(chǎn)的Covaris S2超聲打碎隨機(jī)地分解為長(zhǎng)度為250-3000bp的片段，且純化，對(duì)經(jīng)過(guò)純化的DNA采用T4連接酶以及T4堿性磷酸酶、Klenow片段進(jìn)行末端修復(fù)，且于片段3’端加A堿基，然后通過(guò)接頭連接形成標(biāo)準(zhǔn)化的Solexa測(cè)序文庫(kù)。

1.2.4 Sanger測(cè)序 對(duì)NGS檢測(cè)所發(fā)現(xiàn)的點(diǎn)位突變按照具體的突變點(diǎn)位，采用Primer primer 5.0型對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增引物，擴(kuò)增產(chǎn)物使用測(cè)序試劑盒Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（Applied Biosystems）測(cè)序，最后經(jīng)過(guò)ABI PRISM 3130型基因分析儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0軟件對(duì)本研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、分析。

2.結(jié)果

經(jīng)檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)受檢者 DMD 基因 4-7 號(hào)外顯子缺失變異；發(fā)現(xiàn)受檢者母親及二姐 DMD 基因 4-7 號(hào)外顯子雜合缺失變異；未發(fā)現(xiàn)受檢者姐姐 DM在大片段變異；未發(fā)現(xiàn)受檢者三姐 DMD 基因存在大片段變異。

3.討論

Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良的主要臨床特征是進(jìn)行性肢體肌萎縮肌無(wú)力，近端為主，伴小腿腓腸肌假性肥大。一般3～5歲出現(xiàn)癥狀，呈進(jìn)行性加重，10～12歲喪失行走能力，多于20歲左右死于呼吸衰竭和(或)心力衰竭。研究中的患兒臨床進(jìn)程基本符合DMD的臨床特點(diǎn)[5-6]，值得注意的是相當(dāng)部分患兒有運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲滯，但常被家長(zhǎng)忽略，而經(jīng)仔細(xì)追問(wèn)，高達(dá)77.8%的患兒均有獨(dú)走的延遲。提示臨床醫(yī)生，在發(fā)現(xiàn)不明原因獨(dú)走延遲的男性患兒時(shí)應(yīng)考慮到DMD的可能性[7]。

DMD為X連鎖隱性遺傳性疾病，致病基因?yàn)閐ystrophin,位于染色體Xp21，該基因是目前人類發(fā)現(xiàn)的最大的基因，長(zhǎng)度約2400～3000kb，約79個(gè)外顯子，編碼3685個(gè)氨基酸，組成dystrophin蛋白(即抗肌萎縮蛋白)，分子量427KD[8]。Dystrophin蛋白位于骨骼肌和心肌細(xì)胞膜內(nèi)面，為細(xì)胞骨架蛋白，具有抗機(jī)械牽拉作用，能防止肌細(xì)胞在收縮過(guò)程中的損傷。Dystrophin與細(xì)胞膜內(nèi)面、跨細(xì)胞膜區(qū)以及細(xì)胞膜外區(qū)的多種蛋白如sarcoglycan、dystroglycan等蛋白緊密聯(lián)合，相互關(guān)聯(lián)，在細(xì)胞膜內(nèi)外組成一個(gè)整體，維系細(xì)胞膜內(nèi)外的物質(zhì)交換和聯(lián)系，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整和穩(wěn)定[9-10]。Dystrophin基因缺陷導(dǎo)致肌細(xì)胞膜上dystrophin蛋白缺乏或減少，使肌細(xì)胞膜不穩(wěn)定而引起肌細(xì)胞壞死和功能喪失。如dystrophin蛋白完全缺乏，則產(chǎn)生DMD表現(xiàn)。

本研究結(jié)果顯示：經(jīng)檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)受檢者DMD基因4～7號(hào)外顯子缺失變異；發(fā)現(xiàn)受檢者母親及二姐DMD基因 4～7號(hào)外顯子雜合缺失變異；未發(fā)現(xiàn)受檢者三姐DMD基因存在大片段變異。上述結(jié)果提示：DMD基因是杜氏/貝氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD/BMD）的致病基因，為X連鎖隱性遺傳方式（XR）；鑒于該類遺傳方式特點(diǎn)（男性攜帶即發(fā)?。?，不對(duì)其父樣本進(jìn)行檢測(cè)。在受檢者DMD基因所發(fā)現(xiàn)的4～7號(hào)外顯子的缺失變異很可能是導(dǎo)致受檢者發(fā)病的致病性變異；受檢者其母、其二姐很可能均為致病性變異攜帶者。杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD）為DMD基因變異所致的 X 連鎖隱性遺傳病，男性只有1條X染色體，獲得致病基因即發(fā)病，發(fā)病率為1/3500活產(chǎn)男嬰。女性攜帶缺陷基因時(shí)一般不患病，除非由于不幸的萊昂化，導(dǎo)致正?；蛩诘腦染色體滅活而發(fā)病。不過(guò)由于還有部分細(xì)胞為缺陷基因所在的染色體滅活，正?；蚱鹱饔茫Y狀要比男性患者輕。DMD病歷中散發(fā)病例較多，它可能是[11-12]：①隱匿傳遞的致病基因的“暴露”；②母親卵細(xì)胞減數(shù)分裂的“差錯(cuò)”；③母親生殖腺細(xì)胞有絲分裂差錯(cuò)，卵巢中有相當(dāng)一部分卵母細(xì)胞攜帶變異基因，即“生殖腺嵌合”。除減數(shù)分裂中發(fā)生的差錯(cuò)再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較低外（與一般孕婦相同），隱匿傳遞的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)與家族性病例一樣，而生殖腺嵌合的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)與變異細(xì)胞群的比例有關(guān)。由于不能確定變異發(fā)生在什么階段，散發(fā)病例都要進(jìn)行產(chǎn)前診斷。有DMD基因變異患兒生育史的母親再次生育時(shí)，需進(jìn)行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷。

綜上所述，通過(guò)對(duì)Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥患者基因突變檢測(cè)分析，并對(duì)其家系進(jìn)行調(diào)查，可為及時(shí)確診DMD提供遺傳學(xué)依據(jù)。