TSP家族蛋白在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用研究進(jìn)展

王耀輝 陳 濤 余思遜 匡永勤 樹海峰△

1)西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科，四川 成都 610031 2)西南交通大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610031

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病，其發(fā)生的病因、發(fā)病機(jī)制及如何控制尚未完全闡明。許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷、腫瘤、感染、退行性病變、血管病變等常繼發(fā)性引起癲癇。在細(xì)胞水平上，癲癇的發(fā)生與星形膠質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān)[1]。近年來就星形膠質(zhì)細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白凝血酶敏感蛋白(thrombospondins，TSP)在癲癇發(fā)生中的重要作用研究為我們認(rèn)識癲癇提供了新的重要方向。TSP與其受體α2δ結(jié)合可誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性突觸數(shù)量上調(diào)，引起興奮性突觸與抑制性突觸結(jié)構(gòu)和功能失衡，導(dǎo)致神經(jīng)元過度興奮[2]，引起癲癇發(fā)生。本文就TSP、α2δ受體在中樞突觸生成中的作用和TSP拮抗劑加巴噴丁、普瑞巴林抑制癲癇癥狀的作用做一綜述。

1 凝血酶敏感蛋白促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸形成和重塑

TSP是一組由星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的具有功能的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，目前發(fā)現(xiàn)TSP蛋白主要分為5種亞型，分別為TSP1、TSP2、TSP3、TSP4和TSP5，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)均有分布，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞間和細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)間的相互作用，這些作用包括細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、血管形成、炎癥、突觸形成、細(xì)胞增殖和凋亡等。而其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，如層黏連蛋白、膠原蛋白主要起支持細(xì)胞、維持組織、器官形態(tài)結(jié)構(gòu)的作用[3]。在神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的TSP家族蛋白能促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)形成新的突觸[4-5]。在新生的哺乳動物(如小鼠)中，TSP促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育主要在出生后第2周，同時也促進(jìn)其他組織的發(fā)育和成熟，包括骨、心臟和肌肉[6-7]。突觸發(fā)生是一個復(fù)雜的生理、病理過程，多種細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、信號通路參與其中。離體的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分別培養(yǎng)于普通培養(yǎng)基、星形細(xì)胞培養(yǎng)基，以及不與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞直接接觸的星形細(xì)胞滋養(yǎng)層培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)后兩種培養(yǎng)基中突觸數(shù)量較前一種培養(yǎng)基明顯增加，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的TSP1和TSP2能促進(jìn)新的突觸形成，當(dāng)星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中敲除TSP2，突觸小點(diǎn)的數(shù)量減少了7倍，表明星形膠質(zhì)細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白參與調(diào)控離體培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的突觸發(fā)生，TSP1和TSP2能模擬星形膠質(zhì)細(xì)胞的突觸發(fā)生效應(yīng)[4]。在正常神經(jīng)系統(tǒng)生理發(fā)育過程中，TSP水平在新生的幼年小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中開始升高，但到了成年期，TSP水平又降至低水平，當(dāng)某些病理因素，如外傷、腫瘤、感染等作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)時，TSP水平又會上升[8-9]。小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中若缺乏TSP1和TSP2，成年后突觸數(shù)量較正常發(fā)育的小鼠降低31%[4]。TSP誘導(dǎo)形成的突觸結(jié)構(gòu)雖然在電鏡下觀察是正常的，但電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，僅僅突觸前膜有電活動，突觸后膜表現(xiàn)出“沉默狀態(tài)”，是因?yàn)橥挥|后膜缺乏功能性AMPA受體，表明TSP不能單獨(dú)誘導(dǎo)形成具有完整生理功能的突觸[4]。TSP促進(jìn)谷氨酸能興奮性突觸數(shù)量增多，但對GABA能抑制性突觸的形成無明顯作用，當(dāng)把神經(jīng)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時，無論培養(yǎng)基中有無TSP，興奮性、抑制性突觸數(shù)量均增多[10]。TSP對興奮性、抑制性突觸的不同作用導(dǎo)致的興奮性、抑制性突觸失衡，進(jìn)而導(dǎo)致局部神經(jīng)環(huán)路興奮抑制失衡[11]，可能是癲癇發(fā)生的重要原因。

2 凝血酶敏感蛋白通過其受體α2δ調(diào)控神經(jīng)元突觸發(fā)生作用

主要位于突觸前膜的電壓門控鈣離子通道(voltage-gated calcium channels)由四部分組成，組成其孔道結(jié)構(gòu)的是α1亞基，決定鈣通道的主要生理和藥理功能，鈣離子可通過該結(jié)構(gòu)內(nèi)流。α2δ、β和γ是鈣通道的輔助結(jié)構(gòu)，均與α1亞單位直接相連[12]，調(diào)節(jié)α1亞單位的生理功能[13-14]。α2δ具有4種構(gòu)象：α2δ-1、α2δ-2、α2δ-3、α2δ-4，分別由4種單基因編碼，即CACNA2D1-4[15]。α2δ分布于不同的組織中，發(fā)揮著不同的生理功能[12，16-18]，α2δ-1、α2δ-2、α2δ-3主要分布于腦組織、心臟和骨骼肌，α2δ-4分布于心臟、骨骼肌和小腸等組織[12]。α2δ-1能加強(qiáng)α1亞基的鈣離子內(nèi)流功能和增加突觸末端配體結(jié)合部位[19]，α2δ-2僅能改變電流幅度，而不能改變鈣通道的生理特性[16]。α2δ-3和α2δ-4與其他亞單位共表達(dá)也會對鈣離子通道的電流幅度、頻率、通道的失活和激活轉(zhuǎn)變產(chǎn)生影響。盡管α2δ是電壓門控鈣離子通道的組成結(jié)構(gòu)，但研究發(fā)現(xiàn)，α2δ還具有部分與鈣離子通道功能無關(guān)的其他生理功能，如腫瘤生長和易感性[16，20]、骨骼肌發(fā)育、肌管遷移和發(fā)育[21]等。α2δ受體缺失不僅影響正常的生理功能，也與部分疾病的發(fā)生相關(guān)，如α2δ-1的缺失雖然不影響鈣離子通道的表達(dá)水平，不阻斷肌管興奮-收縮偶聯(lián)，但明顯減少對延遲去極化的反應(yīng)[22]。近期研究發(fā)現(xiàn)，α2δ-1和α2δ-3還與突觸生成、神經(jīng)環(huán)路重塑和突觸的可塑性相關(guān)[23-24]。α2δ受體參與突觸生成作用的機(jī)制主要是TSP結(jié)構(gòu)中表皮生長因子(EGF)樣重復(fù)序列可特異性識別α2δ受體VWF-A結(jié)構(gòu)域并與之結(jié)合[23]，形成“突觸生成復(fù)合體”(synaptogenic signaling complex)，發(fā)揮突觸發(fā)生信號通路開關(guān)的作用[25]。TSP與α2δ受體結(jié)合激活突觸再生，這一過程由多種細(xì)胞、細(xì)胞外蛋白和信號通路參與[26-27]。同時，神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞之間進(jìn)行著復(fù)雜的信息交換，星形膠質(zhì)細(xì)胞主要對神經(jīng)元軸突發(fā)芽、延伸、成熟與穩(wěn)定等生理活動發(fā)揮調(diào)控作用[28]。相鄰的神經(jīng)元之間分別形成軸絲狀、樹狀偽足，并進(jìn)一步特異化形成突觸前膜和突觸后膜，形成結(jié)構(gòu)突觸雛形[28]。LIAUW等[29]利用小鼠局灶缺血模型研究缺血后突觸發(fā)芽情況，發(fā)現(xiàn)TSP1和TSP2被敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠較野生型小鼠軸突發(fā)芽密度降低。星形膠質(zhì)細(xì)胞分別與前后突觸結(jié)構(gòu)共同形成所謂“三突觸結(jié)構(gòu)”(tripartite synapses)，星形膠質(zhì)細(xì)胞及其調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)一步包裝修飾突觸，使突觸結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具備完整的突觸功能[28]。該突觸結(jié)構(gòu)突觸前膜能攝取和釋放谷氨酸，但突觸后膜由于缺乏AMPA受體，不具備完整的傳導(dǎo)興奮作用。FARIA等[30]通過膜片鉗試驗(yàn)記錄過表達(dá)α2δ-1的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)，小鼠皮層電活動興奮性增高，并有癲癇樣放電活動。視頻腦電圖記錄也顯示有異常頻繁的自發(fā)癲癇樣放電。通過免疫熒光雙標(biāo)法標(biāo)記興奮性突觸蛋白位點(diǎn)Vglut-2和PSD95，發(fā)現(xiàn)兩者的共定位密度較對照組正常小鼠增加。類似的，在皮層外傷模型中，α2δ-1的表達(dá)上調(diào)，可能在癲癇形成中發(fā)揮重要作用。與之對應(yīng)的是在α2δ-1過表達(dá)的成年轉(zhuǎn)基因小鼠中，利用VGlut2和PSD-95分別標(biāo)記突觸前膜和突觸后膜，并對共標(biāo)記的突觸小點(diǎn)計(jì)數(shù)以反映興奮性突觸的數(shù)量，結(jié)果顯示，與對照組野生型小鼠相比，VGlut2與PSD-95共標(biāo)記的陽性突觸小點(diǎn)數(shù)目增加約1.8倍，興奮性突觸后電位頻率增加1.63倍，且VGlut2陽性突觸數(shù)量的增加并不是丘腦和皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量上調(diào)所致[23]。表明α2δ-1的過表達(dá)上調(diào)了興奮性突觸數(shù)量、增強(qiáng)了突觸傳遞功能。

3 TSP拮抗劑加巴噴丁和普瑞巴林與α2δ受體結(jié)合可抑制癲癇癥狀

加巴噴丁(gabapentin)和普瑞巴林(pregabalin)被廣泛用于治療各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如部分發(fā)作性癲癇[31]、神經(jīng)病理性疼痛[32]、廣泛焦慮障礙[33]和纖維肌痛[34]。加巴噴丁為GABA能遞質(zhì)類似物，但不作用于GABA受體，普瑞巴林的結(jié)構(gòu)與加巴噴丁結(jié)構(gòu)類似。加巴噴丁和普瑞巴林均與神經(jīng)元突觸α2δ受體具有很強(qiáng)親和力[35]。其抗癲癇效應(yīng)的分子機(jī)制有賴于與α2δ受體結(jié)合[1，35]。但加巴噴丁并不是與所有α2δ受體亞型具有很強(qiáng)的親和力，其主要與受體α2δ-1和α2δ-2結(jié)合，且與α2δ-1結(jié)合的親和力遠(yuǎn)大于α2δ-2[36]。基于加巴噴丁控制癲癇患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常放電效應(yīng)，目前這兩種藥物已廣泛用于臨床以改善癲癇患者癥狀，最近的研究顯示，加巴賁丁可能具有抑制癲癇發(fā)生的作用。主要證據(jù)如下：(1)加巴噴丁與α2δ受體結(jié)合后可阻斷TSP與α2δ受體結(jié)合，從而阻斷各種病理因素條件下TSP誘導(dǎo)的興奮性突觸生成效應(yīng)[23]；(2)同時加巴噴丁和普瑞巴林與α2δ受體結(jié)合后減少突觸前膜鈣內(nèi)流，降低突觸間隙興奮性遞質(zhì)的釋放，達(dá)到抑制癲癇樣放電的目的[37-38]，表明加巴噴丁和普瑞巴林可通過影響神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能抑制癲癇的發(fā)生；(3)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，加巴噴丁還可協(xié)同作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞，減弱反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生從而干擾癲癇持續(xù)狀態(tài)患者中樞反應(yīng)性突觸生成[39]，從而降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)癲癇樣放電，改善癲癇癥狀[38]。在動物大腦外傷模型中，異常的興奮性突觸重組發(fā)生在外傷后3 d～2周，在外傷后急性短期應(yīng)用加巴噴丁3 d可預(yù)防異常突觸環(huán)路形成以及癲癇活動[40]。在新生小鼠冰凍癲癇模型中，小鼠出現(xiàn)癲癇癥狀前，大腦組織中已有異常突觸形成，早期應(yīng)用加巴噴丁能明顯減少癲癇樣興奮性突觸后電位發(fā)放頻率和興奮性遞質(zhì)谷氨酸的釋放量[1]。

4 展望

TSP誘導(dǎo)突觸發(fā)生為在分子水平研究癲癇發(fā)病機(jī)制提供了新方向，但癲癇的發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，TSP誘導(dǎo)突觸發(fā)生從組織學(xué)和電生理功能學(xué)方面部分解釋了癲癇的發(fā)生機(jī)制。目前，對于癲癇的治療主要依靠藥物、生酮飲食、手術(shù)、神經(jīng)調(diào)控等手段，加巴噴丁和普瑞巴林在臨床上已被用于控制癲癇癥狀發(fā)作，加巴賁丁和普瑞巴林可能具有調(diào)控癲癇發(fā)生的潛在作用，但要完全地闡明癲癇的發(fā)生機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。