人RPE細(xì)胞通過(guò)隧道納米管傳遞鈣信號(hào)的研究進(jìn)展

王 舒，蔡善君

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 眼科，貴州 遵義 563099)

鈣在細(xì)胞生理過(guò)程中至關(guān)重要，且與各種生物學(xué)功能有關(guān)，包括蛋白質(zhì)分泌、細(xì)胞外吞、收縮、基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞生長(zhǎng)等。值得注意的是，引起細(xì)胞內(nèi)鈣不穩(wěn)定的任何干擾都會(huì)促使細(xì)胞功能從正常調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞死亡[1-2]。目前，鈣信號(hào)在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死[3]過(guò)程中的核心作用已經(jīng)明確。一般來(lái)說(shuō)，膜去極化觸發(fā)胞內(nèi)鈣內(nèi)流，啟動(dòng)胞泡融合和胞吐過(guò)程，以促進(jìn)同步突觸傳遞[4]。隧道納米管(tunneling nanotubes，TNT)可以提供一種特異且有效的細(xì)胞間通信方式[5-10]。鈣信號(hào)通過(guò)隧道納米管在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelial，RPE)間轉(zhuǎn)移，打破了以往了解的細(xì)胞利用縫隙連接和突觸來(lái)與相鄰細(xì)胞溝通，為細(xì)胞間傳遞鈣離子提供了新的傳遞方式，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床實(shí)踐?，F(xiàn)對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株Arpe-19通過(guò)隧道納米管傳遞鈣離子的相關(guān)文獻(xiàn)予以綜述。

1 隧道納米管的簡(jiǎn)述

細(xì)胞間通訊在正常和異常組織環(huán)境中的作用已經(jīng)被廣泛研究了幾十年。通過(guò)對(duì)內(nèi)源性運(yùn)載工具，如外體和微囊泡的研究，加深了細(xì)胞間傳遞機(jī)制的認(rèn)識(shí)[11-15]。間隙連接和可溶性擴(kuò)散信號(hào)，如細(xì)胞因子，需要有效和足夠的信息，且需要在相對(duì)較短的距離傳遞。然而，對(duì)于在生物微環(huán)境中距離較遠(yuǎn)的細(xì)胞來(lái)說(shuō)，遠(yuǎn)程交流是必要的。例如，由于癌細(xì)胞通過(guò)基質(zhì)成分分散在腫瘤基質(zhì)中，它們之間的長(zhǎng)距離可能會(huì)顯著減少它們通過(guò)趨化因子、細(xì)胞因子或外體/微囊泡的通訊。隧道納米管(TNT)是細(xì)胞間一個(gè)獨(dú)特又高效的聯(lián)絡(luò)方式，這可以解釋細(xì)胞如何通過(guò)隧道納米管引發(fā)一系列疾病 ，特別是在癌癥中。而首次的實(shí)驗(yàn)就是對(duì)培養(yǎng)的大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞進(jìn)行了隧道納米管膜突起的描述?，F(xiàn)在用顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的Arpe-19細(xì)胞常被TNT連接，且TNT不附著于下層。TNT在細(xì)胞間呈直線連接，是一種膜狀細(xì)胞的延伸，寬度從50～1 000 nm不等，長(zhǎng)度從幾百微米到幾百微米[16-17]，且用掃描電鏡證實(shí)了TNT的特征。熒光顯微鏡顯示Arpe-19細(xì)胞之間的TNT中含有F-肌動(dòng)蛋白，而不含微管，當(dāng)人為添加磚紅霉素B誘導(dǎo)F-肌動(dòng)蛋白的解聚，會(huì)導(dǎo)致TNT的消失。重要的是，這些TNT可以作為像路西法黃(Lucifer Yellow)這樣的小分子的擴(kuò)散通道，而不是右旋糖酐紅(Dextran Red)這樣的大分子的通道。最近的研究表明，不同細(xì)胞所形成的TNT的形態(tài)和組成可能不同。例如，連接人類(lèi)巨噬細(xì)胞的兩種不同類(lèi)型的隧道納米管：分為只有肌動(dòng)蛋白的薄納米管和含有肌動(dòng)蛋白和微管的較厚的納米管(直徑大于0.7 m)，TNT的功能是充當(dāng)細(xì)胞間交換的管道，包括線粒體、鈣離子、蛋白質(zhì)、高爾基小泡、病毒、微RNA(MiRNAs)和外顯子[18-19]。因此，TNT作為細(xì)胞的“納米公路”，用于連接不相鄰的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞器和其他物質(zhì)的運(yùn)輸。倒置顯微鏡和共聚焦顯微熒光成像技術(shù)的廣泛應(yīng)用已成為實(shí)驗(yàn)室識(shí)別細(xì)胞器及其他物質(zhì)通過(guò)TNT和直接細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的主要手段。

大量的證據(jù)表明，TNT介導(dǎo)的通訊和運(yùn)輸對(duì)于生理?xiàng)l件下正常細(xì)胞的功能是必不可少的。雖然隧道納米管形成的分子機(jī)制尚不完全清楚，但刺激條件下，如炎癥或任何細(xì)胞損傷，已被證明能刺激細(xì)胞產(chǎn)生TNT。較短的納米管在未感染的細(xì)胞中常見(jiàn)，而長(zhǎng)的納米管在被感染的細(xì)胞中常見(jiàn)。據(jù)報(bào)道，感染病毒的細(xì)胞[20]納米管的產(chǎn)生頻率明顯增加，發(fā)現(xiàn)至少有兩種不同的TNT形成途徑。這表明病毒感染可以刺激TNT的形成，一種是從給定的細(xì)胞中延伸出來(lái)，最終與鄰近的細(xì)胞接觸，從而導(dǎo)致TNT的形成，如PC 12細(xì)胞和T24細(xì)胞[21]所見(jiàn)。在另一種途徑中，是從觀察到許多類(lèi)型的免疫細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的[22-25]，細(xì)胞首先接觸，然后出現(xiàn)TNT。這兩個(gè)過(guò)程不一定是相互排斥的，甚至可以同時(shí)發(fā)生在TNT形成過(guò)程中。在這兩種情況下，都需要粘附分子來(lái)促進(jìn)TNT的形成和(或)穩(wěn)定。

此外，Austefjord等[26]人在不同類(lèi)型的細(xì)胞之間也檢測(cè)到TNT的形成，這些連接有效地介導(dǎo)上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的病毒轉(zhuǎn)移。這種轉(zhuǎn)移很可能涉及體內(nèi)的病毒傳播，但在自然感染過(guò)程中它或許也發(fā)生。通過(guò)TNT的轉(zhuǎn)移可能與細(xì)胞間通信的其它途徑(其它類(lèi)型的細(xì)胞突起、外體或間隙)結(jié)合，優(yōu)選的途徑可能取決于細(xì)胞狀況。

2 人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞經(jīng)隧道納米管的通訊

2.1 視網(wǎng)膜色素上皮 視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)是視網(wǎng)膜的單層，位于神經(jīng)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜之間。視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)通過(guò)將視網(wǎng)膜與脈絡(luò)膜毛細(xì)血管床分離而形成血-視網(wǎng)膜屏障[27]。它是一個(gè)活躍的屏障，在許多方面支持神經(jīng)元視網(wǎng)膜。RPE為視網(wǎng)膜提供營(yíng)養(yǎng)因子，吞噬從感光器脫落的盤(pán)膜，回收維甲酸以維持視覺(jué)周期，調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜下間隙的組成和體積。這種高度極化的色素上皮在調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜下間隙的體積和化學(xué)成分方面起著至關(guān)重要的作用。它也促進(jìn)了神經(jīng)視網(wǎng)膜和血管絨毛膜間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和離子的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)[28]。RPE作為一種血-視網(wǎng)膜屏障，選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)生物分子，釋放保護(hù)視網(wǎng)膜所必需的各種因素。盡管RPE細(xì)胞具有重要的生理功能，但對(duì)RPE細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路知之甚少。電生理學(xué)研究表明，所有的視網(wǎng)膜細(xì)胞通過(guò)間隙連接[27-28]與相鄰細(xì)胞進(jìn)行通訊。連接蛋白43(Cx43)介導(dǎo)的間隙連接細(xì)胞間通訊參與調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜修復(fù)和再生。一些研究報(bào)告說(shuō)[29]，細(xì)胞凋亡信號(hào)可通過(guò)間隙連接傳遞，從而對(duì)其相鄰細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。這表明RPE細(xì)胞在生理?xiàng)l件下具有非?；钴S的細(xì)胞間通訊。

2.2 視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞間的TNT TNT在不同細(xì)胞類(lèi)型中的直徑、長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)和功能各不相同，Arpe-19細(xì)胞中的TNT，典型直徑為50～300 nm，長(zhǎng)度可達(dá)120 mm。在Arpe-19細(xì)胞培養(yǎng)中，Wittig D[30]發(fā)現(xiàn)了直接以TNT相互連接兩個(gè)細(xì)胞，偶爾也發(fā)現(xiàn)多達(dá)三個(gè)或四個(gè)不同的TNT連接的細(xì)胞，Arpe-19細(xì)胞互相接觸后形成TNT。這些細(xì)胞一開(kāi)始有接觸，然后移動(dòng)，形成細(xì)胞-細(xì)胞之間的連接，隨著細(xì)胞的分裂而拉長(zhǎng)，隨之產(chǎn)生TNT。最近 在線粒體功能失調(diào)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，線粒體可以在細(xì)胞間的TNT內(nèi)移動(dòng)[31-32]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞與RPE細(xì)胞直接相接觸的情況下通過(guò)TNT將線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)至RPE細(xì)胞。而年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變等視網(wǎng)膜退行性疾病與線粒體的功能密切相關(guān)[33-36]。所以，研究RPE細(xì)胞間的隧道納米管可以為眼底疾病提供新的治療方向。

3 人RPE細(xì)胞傳遞鈣信號(hào)的產(chǎn)生與傳播

3.1 機(jī)械刺激誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞間Ca2+波的傳播 目前，TNT被證明以類(lèi)似于細(xì)胞間通過(guò)間隙連接傳輸鈣波的方式介導(dǎo)細(xì)胞間鈣信號(hào)的傳遞，且能夠在不親密接觸的細(xì)胞之間傳輸。Khamidakh[37-38]為了研究這一過(guò)程，通過(guò)單個(gè)細(xì)胞的機(jī)械刺激在Arpe-19單層中誘導(dǎo)細(xì)胞間Ca2+波。在存在和不存在細(xì)胞外Ca2+的情況下，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存Ca2+耗盡后使用Ca2+敏感熒光染料fura-2，用單劑量法來(lái)檢測(cè)單層細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的動(dòng)態(tài)變化。應(yīng)用間隙連接阻斷劑α-甘草次酸后，在匯合的單層Arpe-19細(xì)胞內(nèi)單個(gè)細(xì)胞的機(jī)械刺激引發(fā)Ca2+增加，其以波狀方式傳播到相鄰細(xì)胞。這種局部刺激經(jīng)常在TNT連接的細(xì)胞中產(chǎn)生強(qiáng)大的Ca2+信號(hào)，從而擴(kuò)大了通信的范圍。

Arpe-19細(xì)胞表現(xiàn)出兩種不同的Ca2+波，其傳播機(jī)制依賴(lài)于細(xì)胞位置：在接近機(jī)械刺激部位的細(xì)胞中，Ca2+波主要通過(guò)間隙連接傳播，并且需要來(lái)自細(xì)胞內(nèi)Ca2+的儲(chǔ)存和細(xì)胞外培養(yǎng)基，而更遠(yuǎn)的傳播更依賴(lài)于嘌呤能受體，并不需要細(xì)胞外的Ca2+。所提出的方法可以用來(lái)體外評(píng)估人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞測(cè)定藥物誘導(dǎo)細(xì)胞間通訊變化的工具。

3.2 間隙連接在TNT鈣信號(hào)傳播中的作用 一些實(shí)驗(yàn)室觀察到TNT中存在連接蛋白和間隙連接，但間隙連接在這些過(guò)程和這些疾病中的作用仍在積極研究中[39]。這些觀察表明了由TNT介導(dǎo)的長(zhǎng)距離連接通訊的可能性。事實(shí)上，間隙連接，例如：電突觸，首次在心肌和神經(jīng)中發(fā)現(xiàn)了在相鄰細(xì)胞之間的電遷移。間隙連接在TNT連接的細(xì)胞間信號(hào)分子的傳遞中有關(guān)聯(lián)，已發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性連接蛋白通過(guò)免疫熒光技術(shù)在TNT內(nèi)或附近定位[40-41]。在多種病理類(lèi)型的疾病中，TNT形成和TNT介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊顯著增加，包括病毒感染、癌癥、梅毒以及朊蛋白相關(guān)疾病[42-47]。在不同環(huán)境下(比如星形細(xì)胞間或巨噬細(xì)胞間)，連接蛋白43(Cx43)存在于TNT樣結(jié)構(gòu)中，而間隙連接通道的抑制并不能阻止它們的形成，但會(huì)干擾TNT連接細(xì)胞之間的正常通訊。這些數(shù)據(jù)表明，這兩個(gè)通信系統(tǒng)在協(xié)調(diào)通信方面是相互補(bǔ)充的[48]。

目前已經(jīng)有報(bào)告描述了遠(yuǎn)距離細(xì)胞間Ca2+信號(hào)的細(xì)胞間交換是通過(guò)TNT介導(dǎo)的[48-49]，表明在這些結(jié)構(gòu)上存在某種形式的膜/胞質(zhì)連續(xù)性，或在這一過(guò)程中存在活躍的間隙連接通道。目前對(duì)細(xì)胞間Ca2+波傳播過(guò)程所涉及的機(jī)制尚不完全明了，但認(rèn)為間隙連接與TNT密切相關(guān)。

3.3 IP3沿TNT擴(kuò)散的信號(hào)傳播 機(jī)械刺激除了促進(jìn)ATP的釋放外，還能通過(guò)IP3受體(IP3R)通道促進(jìn)IP3的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子。在TNT中觀察到局部IP3介導(dǎo)的Ca2+信號(hào)，提示它們可能促進(jìn)細(xì)胞間Ca2+波的傳播[50]。原則上，通過(guò)TNT傳播Ca2+信號(hào)可能是由Ca2+的直接轉(zhuǎn)移、IP 3從被激活的細(xì)胞擴(kuò)散到引起反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+釋放或者Ca2+傳遞促進(jìn)IP3誘導(dǎo)應(yīng)答細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放的混合機(jī)制[7]所致。為了區(qū)分這些假設(shè)，觀察了TNT連接的連接蛋白(Cx43)細(xì)胞之間的通訊，以及細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高的位置和時(shí)間，分別使用機(jī)械刺激和IP3的局部光釋放作為刺激，一個(gè)關(guān)鍵的發(fā)現(xiàn)是，反應(yīng)細(xì)胞中的Ca2+升高是在刺激之后，明顯延遲后才開(kāi)始的，開(kāi)啟IP3R通道絕對(duì)需要IP3以及Ca2+ [51]。提示被刺激細(xì)胞內(nèi)IP3其擴(kuò)散速度快于Ca2+的升高，Ca2+波沿TNT的主動(dòng)傳遞可能是通過(guò)連接的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行通訊，連接細(xì)胞在IP3濃度升高后才打開(kāi)鈣通道，使得Ca2+波迅速升高。

4 展望

隧道納米管(TNT)是細(xì)胞間遠(yuǎn)程通信系統(tǒng)的一種形式，可以介導(dǎo)細(xì)胞間鈣信號(hào)的遠(yuǎn)距離傳輸，在人RPE細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了鈣離子沿隧道納米管傳播，鈣離子產(chǎn)生及傳播的方式通過(guò)間隙連接或主動(dòng)產(chǎn)生IP3，進(jìn)而產(chǎn)生、傳遞鈣離子。這為治療眼底疾病開(kāi)辟了新的治療機(jī)會(huì)，為利用隧道納米管作為細(xì)胞輸送管道打開(kāi)一扇新的大門(mén)?；蛟S可以通過(guò)藥物調(diào)節(jié)這些過(guò)程來(lái)阻止或增加它們的形成，以掌控通過(guò)TNT傳播的致病和健康成分的傳輸。