舒尼替尼治療膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠的實(shí)驗(yàn)研究

吳柯 王金杰 莊汝杰

膝骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是臨床上常見(jiàn)的退行性疾病，最常見(jiàn)于中老年人群。調(diào)查顯示，我國(guó)40歲以上人群KOA患病率達(dá)28.7%[1]。目前關(guān)于KOA的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，可能由于機(jī)械力分布失衡或負(fù)荷過(guò)度引起軟骨磨損，或其他理化因素使軟骨細(xì)胞代謝異常[2-4]。相關(guān)研究表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在KOA的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，且證實(shí)VEGF會(huì)影響軟骨細(xì)胞增殖、凋亡和代謝，刺激釋放基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）及其他代謝介質(zhì)來(lái)降解軟骨基質(zhì)[5-6]。本研究建立KOA大鼠模型，并使用VEGF靶點(diǎn)抑制劑舒尼替尼進(jìn)行干預(yù)治療，觀察其關(guān)節(jié)液炎癥因子表達(dá)水平變化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 4～5月齡的健康SD雄性大鼠32只，體重（190±10）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為4組，即空白組、4周治療組、8周治療組、對(duì)照組，每組8只。4組大鼠在相同條件下籠養(yǎng)，自由攝食、飲水，室溫控制在18～22℃。KOA建模方法：在常規(guī)無(wú)菌下，從冰箱取出木瓜蛋白酶靜置30min，將4g木瓜蛋白酶溶解于100ml 0.9%氯化鈉注射液，充分振蕩、混勻。大鼠麻醉后，仰臥位固定于木板上，剃去左右膝關(guān)節(jié)腔周邊1cm區(qū)域腿毛，絡(luò)合碘消毒，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇脫碘，大鼠屈曲45°，以髕骨下極髕腱外緣為進(jìn)針點(diǎn)，向髁間窩方向進(jìn)針，抵達(dá)股骨髁后回撤2mm，注入0.2ml配制好的木瓜蛋白酶0.9%氯化鈉注射液（在第1、3、5天各1次），2周后KOA模型建立[7]?？瞻捉M：大鼠不造模、不給藥。4周治療組：造模成功后，大鼠灌胃舒尼替尼（1mg/kg，100mg溶于100ml的0.9%氯化鈉溶液中，1ml/kg），1次/d，持續(xù)4周。8周治療組：造模成功后，大鼠灌胃舒尼替尼（1mg/kg，100mg溶于100ml的0.9%氯化鈉溶液中，1ml/kg），1次/d，持續(xù)8周。對(duì)照組：造模成功后，大鼠灌胃0.9%氯化鈉溶液（1ml/kg），1次/d，持續(xù)8周。

1.2 主要試劑及器材 木瓜蛋白酶（P3250-25g，規(guī)格25g，美國(guó) Sigma公司）、舒尼替尼（HY-10255A，規(guī)格200mg，美國(guó)MCE公司）、ELISA試劑盒（武漢新啟迪生物科技有限公司）、電子恒溫箱（HPX-9052 MBE，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）、臺(tái)式離心機(jī)（SORVALL，德國(guó)Heraeu公司）、酶標(biāo)儀（DNM-9602，北京普朗新技術(shù)有限公司）。

1.3 關(guān)節(jié)液VEGF、IL-6、IL-33表達(dá)水平的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后（第8周）脫頸處死大鼠，切開(kāi)雙膝關(guān)節(jié)腔，用1ml 0.9%氯化鈉溶液沖洗關(guān)節(jié)腔并收集為關(guān)節(jié)液標(biāo)本，4 000r/min離心5min，提取上清液，置于-20℃冰箱內(nèi)密封保存。采用ELISA法檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)液VEGF、IL-6、IL-33表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠關(guān)節(jié)液VEGF表達(dá)水平比較 4周治療組、8周治療組、對(duì)照組和空白組大鼠關(guān)節(jié)液VEGF表達(dá)水平分別為（168.43±47.47）、（136.75±27.48）、（237.95±69.10）、（152.26±31.17）pg/ml，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，4周治療組、8周治療組大鼠關(guān)節(jié)液VEGF表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組（均P＜0.05），8周治療組大鼠關(guān)節(jié)液VEGF表達(dá)水平明顯低于4周治療組（P＜0.05）。提示舒尼替尼能降低大鼠關(guān)節(jié)液VEGF表達(dá)水平，長(zhǎng)時(shí)間用藥能使關(guān)節(jié)液VEGF維持在較低水平。

2.2 4組大鼠關(guān)節(jié)液IL-6表達(dá)水平比較 4周治療組、8周治療組、對(duì)照組和空白組大鼠關(guān)節(jié)液IL-6表達(dá)水平分別為（36.88±9.81）、（33.16±5.51）、（41.13±13.12）、（26.92±9.40）pg/ml，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，8周治療組大鼠關(guān)節(jié)液IL-6表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組、4周治療組（均P＜0.05），4周治療組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示舒尼替尼長(zhǎng)時(shí)間用藥能降低大鼠關(guān)節(jié)液IL-6表達(dá)水平。

2.3 4組大鼠關(guān)節(jié)液IL-33表達(dá)水平比較 4周治療組、8周治療組、對(duì)照組和空白組大鼠關(guān)節(jié)液IL-6表達(dá)水平分別為（40.36±14.75）、（35.22±9.13）、（53.68±21.73）、（25.88±11.39）pg/ml，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，4周治療組、8周治療組大鼠關(guān)節(jié)液IL-33表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組（均P＜0.05），8周治療組大鼠關(guān)節(jié)液IL-33表達(dá)水平明顯低于4周治療組（P＜0.05）。提示舒尼替尼能降低大鼠關(guān)節(jié)液IL-33表達(dá)水平，長(zhǎng)時(shí)間用藥可持續(xù)降低關(guān)節(jié)液IL-33表達(dá)水平。

3 討論

KOA是一種退行性疾病，以關(guān)節(jié)軟骨退行性變、骨贅形成、滑膜炎癥為主要特征，常見(jiàn)于中老年人。在嚴(yán)重情況下，關(guān)節(jié)周?chē)墓羌败浗M織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形或殘疾[8]。目前關(guān)于KOA病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。KOA進(jìn)展可能與炎癥有關(guān)，而所有關(guān)節(jié)炎癥的共同特征是滑膜炎。

滑膜中新生血管增多，VEGF表達(dá)水平上升均與滑膜炎有關(guān)。VEGF家族是一類(lèi)多功能的細(xì)胞因子，在血管及淋巴管生成中具有直接或間接的調(diào)控作用，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管生成，增加血管通透性[9]。此外，VEGF是骨發(fā)育的重要介質(zhì)。當(dāng)VEGF發(fā)生作用時(shí)，新生神經(jīng)及血管一同進(jìn)入軟骨、新生骨贅中，促進(jìn)骨膜炎癥的浸潤(rùn)，從而加重患者疼痛感[10-11]。新生血管刺激炎癥反應(yīng)生成，而炎癥反應(yīng)又促進(jìn)血管生成；在這過(guò)程中，VEGF起著重要作用[12]。同時(shí)，VEGF還能上調(diào)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞MMP表達(dá)水平，從而導(dǎo)致軟骨變性。IL-6是一種促炎癥因子，它在KOA患者中表達(dá)水平明顯上升[13-14]。IL-6由軟骨細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞分泌并交叉調(diào)節(jié)介導(dǎo)[15]，可誘導(dǎo)IL-1增加MMP的合成，抑制蛋白多糖產(chǎn)生[16]。IL-33是IL-1受體家族成員ST2的唯一已知配體，它通過(guò)與ST2的結(jié)合來(lái)參與活化MyD88/NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)肥大細(xì)胞、Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生。ST2/IL-33信號(hào)通路參與多種炎癥免疫過(guò)程并起著關(guān)鍵作用。

舒尼替尼是一種多靶點(diǎn)的小分子酪氨酸激酶抑制劑，其作用靶點(diǎn)包括 PDGFR（PDGFRα、PDGFRβ）、VEGFR（VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3）等。舒尼替尼能阻斷這些信號(hào)通路，目前被廣泛用于抗腫瘤治療的實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，舒尼替尼能降低大鼠關(guān)節(jié)液VEGF表達(dá)水平；長(zhǎng)時(shí)間用藥能使關(guān)節(jié)液VEGF維持在較低水平，且降低IL-6、IL-33表達(dá)水平。

綜上所述，舒尼替尼對(duì)KOA大鼠模型具有治療作用，本研究結(jié)果為舒尼替尼作為防治KOA的新型藥物提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。