大花序桉外植體消毒及誘導(dǎo)試驗

周小華，張 偉，黃志萍，張海忠，王炳南，湯建福，謝 恩

(1.福建生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)校，福建 福州 350008； 2.漳州市林業(yè)局，福建 漳州 363000；3.漳州長泰巖溪國有林場，福建 長泰 363900； 4.漳州平和天馬國有林場，福建 平和 363700)

大花序桉(Eucalyptus.cloeziana)又名昆士蘭桉、金皮楠、澳洲金皮楠，天然分布于澳大利亞，大喬木，樹高可達(dá)45 m[1]，樹干通直，材質(zhì)好，是很好的家具、室內(nèi)裝飾、礦柱、坑木及建筑用材；大花序桉樹種耐干旱瘠薄、抗病蟲害能力強(qiáng)，生長迅速，尤其是后期生長優(yōu)勢非常明顯，是極具培育價值的大徑材樹種。由于大花序桉引種的種源少，開花結(jié)實量也少，造成苗木緊缺，此外實生苗造林遺傳分化明顯，給造林管理帶來很大的挑戰(zhàn)和困難，因此制約了其大規(guī)模推廣與發(fā)展[2]。組織培養(yǎng)是桉樹種苗繁育的一種重要技術(shù)手段，即能規(guī)?；a(chǎn)，又能夠保持母本的優(yōu)良特性。近幾年，唐再生[3]、唐慶蘭[4]、陳曉明等[5]都曾對大花序桉組織培養(yǎng)進(jìn)行研究，通過誘導(dǎo)得到無菌苗，繼而進(jìn)行繼代培養(yǎng)，生根培養(yǎng)試驗，初步建立了“以芽繁芽”的組培快繁體系，但生根率不一，最高達(dá)86%[6]。目前，尚未見大花序桉組織培養(yǎng)苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的報道，大花序桉組培苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸在于生根率偏低。本研究對大花序按組織培養(yǎng)快速繁殖進(jìn)行深入研究，主要以大花序桉莖段芽誘導(dǎo)后的無菌苗為材料，研究其外植體消毒、誘導(dǎo)、繼代增殖培養(yǎng)，以獲得大量的組培苗，為生根培養(yǎng)打下基礎(chǔ)。目的在于建立大花序桉組織培養(yǎng)快速繁殖體系，為工廠化育苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自漳州市引種的大花序桉優(yōu)良單株，選擇連續(xù)晴天2 d以上且枝條無露水時(一般在上午9∶00—10∶00左右)進(jìn)行取樣，剪取正處生長季節(jié)、當(dāng)年生、幼嫩部分、無病蟲害、芽體飽滿、生長健壯的枝梢。保鮮帶回實驗室。

1.2 試驗設(shè)計與方法

本研究在查閱大量相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗的目的和計劃，著重探討大花序桉莖段外植體消毒及其芽誘導(dǎo)組織培養(yǎng)技術(shù)，采用正交設(shè)計或完全組合設(shè)計安排試驗，探討外源激素的添加效果，篩選最有利的內(nèi)外源激素的組合和比例，篩選出最優(yōu)技術(shù)參數(shù)組合，從外源激素的協(xié)調(diào)上建立大花序桉最優(yōu)組培快繁體系。

1.2.1 外植體消毒 先用清水和軟毛刷洗凈外植體表面附著物，后放入洗衣粉稀釋液中逐個刷洗，再置于流水中徹底洗掉洗滌劑，將外植體修剪后放入無菌瓶中；隨后轉(zhuǎn)入超凈工作臺上，將所需莖段的葉柄部分剪去，剪成帶有1～2個腋芽莖段，用無菌濾紙吸干莖段表面水分。選擇2%次氯酸鈉、75%食用酒精、0.1% HgCl2為消毒劑，根據(jù)外植體消毒程序設(shè)計若干個消毒方案進(jìn)行滅菌(表1)。2～3種藥劑處理間均用無菌水浸洗3～5次，用HgCl2消毒時可加入2～3滴吐溫-80。藥劑處理完后，用無菌水浸洗3～5次，直到清澈無泡沫為止。且每次無菌水浸洗時間不少于2 min。藥劑處理與無菌水浸洗均在無菌培養(yǎng)瓶中密封振蕩處理，以便無菌水與組織材料充分接觸。

1.2.2 外植體誘導(dǎo) 全部接種工作均在經(jīng)嚴(yán)格滅菌的超凈工作臺上進(jìn)行。消毒后的莖段在無菌條件下接種誘導(dǎo)，誘導(dǎo)試驗方案見表2。接種數(shù)量為每種配方33瓶，每個處理接種10～11瓶，每瓶接4～5塊外植體，重復(fù)2～3次，若由于一些外界或人為原因接種量適當(dāng)增加。

1.2.3 繼代培養(yǎng) 繼代培養(yǎng)試驗方案見表3。

1.2.4 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫度為(25±2) ℃，濕度為60%～70%，光照強(qiáng)度為1200～1400 lx，每天光照時間為12 h。

表1 消毒方法正交試驗設(shè)計

表2 不同培養(yǎng)基配方對莖段芽誘導(dǎo)正交試驗設(shè)計

*：培養(yǎng)基配方為蔗糖(分析純)30 g·L-1，瓊脂5.5 g·L-1，pH值在5.6～6.0范圍內(nèi)。下同。

1.3 數(shù)據(jù)收集及處理

運(yùn)用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，大花序桉莖段外植體接入培養(yǎng)基后每2 d進(jìn)行觀察統(tǒng)計，誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)20 d時進(jìn)行調(diào)查。調(diào)查結(jié)果按下列方法統(tǒng)計相關(guān)指標(biāo)。褐化率(%)=褐化的莖段數(shù)/接種的莖段總數(shù)×100%；污染率(%)=污染的莖段數(shù)/接種的莖段總數(shù)×100%；誘導(dǎo)率(%)=誘導(dǎo)芽的莖段數(shù)/未感染的外植體數(shù)×100%；平均芽數(shù)量(%)=誘導(dǎo)的芽總數(shù)/未感染的外植體總數(shù)×100%；增殖系數(shù)=收獲時的芽苗數(shù)/接種時的芽苗數(shù)；出芽率(%)=已出芽的莖段數(shù)/接種的莖段誘導(dǎo)數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體滅菌

不同消毒方法對大花序桉外植體的滅菌效果差別較大(表4)，A5處理消毒效果較好，即2%次氯酸鈉浸泡20 min+75%食用酒精表面消毒30 s+0.1%HgCl2深層消毒6 min。這樣的消毒方式能夠保證較低的褐化率與污染率及較高的誘導(dǎo)成活率且生長良好。

表3 繼代培養(yǎng)正交試驗設(shè)計

*：植物生長調(diào)節(jié)劑單位均為mg·L-1。

表4 消毒方法對滅菌效果的影響 %

2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)

通過不同培養(yǎng)基對芽誘導(dǎo)效果的影響(表5)分析對比得出，培養(yǎng)基類型為改良MS+6-BA 0.3～0.5 mg·L-1+NAA 0.1～0.3 mg·L-1+KT 0.1～0.2 mg·L-1時，誘導(dǎo)出芽的效果最佳。其誘導(dǎo)率最高達(dá)到86%，出芽率最高達(dá)到58.1%。

表5 不同培養(yǎng)基對芽誘導(dǎo)效果的影響

表5(續(xù))

*：試驗數(shù)指參與試驗總數(shù)；誘導(dǎo)數(shù)指除褐化株數(shù)外的誘導(dǎo)總數(shù)。

2.3 繼代培養(yǎng)

通過不同培養(yǎng)基對增殖系數(shù)的影響(表6)可以看出，E5、E6、E7、E8的增殖系數(shù)較高，可以達(dá)到4.5以上(圖1、圖2)，平均增殖系數(shù)為3.6。通過增殖系數(shù)來判斷最佳的繼代增殖培養(yǎng)基配方為：改良MS+6-BA 0.2～0.3 mg·L-1+NAA 0.1～0.2 mg·L-1+KT 0.2～0.3 mg·L-1。

表6 不同培養(yǎng)基對增殖系數(shù)的影響

圖1 大花序桉1株瓶苗繼代增殖培養(yǎng)效果

圖2 大花序桉1株繼代培養(yǎng)瓶苗切割效果

3 結(jié)論與討論

1)外植體消毒試驗結(jié)果表明，大花序桉最好的消毒方法為A5處理，即2%次氯酸鈉浸泡20 min+75%食用酒精表面消毒30 s+0.1%HgCl2深層消毒6 min。這樣的消毒方式能夠保證較低的褐化率與污染率及較高的誘導(dǎo)成活率且生長良好。消毒時間過短，無法完全清除外植體上帶有的真菌、細(xì)菌等微生物；而消毒時間過長，可能會使外植體組織損傷失去活力，導(dǎo)致外植體褐化或死亡。

導(dǎo)致外植體污染的原因有很多，各種微生物可能附著在外植體上，也可能附著在植物體內(nèi)。組培中使用的培養(yǎng)基通常會添加較高濃度的糖分[7]，從而為外植體上的微生物繁殖和生長提供條件。帶菌的外植體一旦接觸培養(yǎng)基便能迅速繁殖，并排泄出對外植體有害的代謝毒素，影響莖段芽的正常誘導(dǎo)，導(dǎo)致外植體污染直至死亡。使用HgCl2消毒時，要注意消毒時間的控制，由于其具有較強(qiáng)的毒性，對微生物有很好的殺滅效果，若消毒時間過長，其毒性也會被外植體吸收，導(dǎo)致外植體中毒，甚至死亡。

2)誘導(dǎo)試驗結(jié)果表明，誘導(dǎo)出芽效果最佳的培養(yǎng)基為：改良MS+6-BA 0.3～0.5 mg·L-1+NAA 0.1～0.3 mg·L-1+KT 0.1～0.2 mg·L-1，誘導(dǎo)出芽的效果最佳?；九囵B(yǎng)基的選擇對大花序桉組培苗的生長起到關(guān)鍵作用。在選擇基本培養(yǎng)基時，除了要考慮植物的遺傳特性外，還應(yīng)考慮培養(yǎng)基總離子濃度、總氮水平及硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的比例、鈣和氯化物的含量等。本研究對不同基本培養(yǎng)基和激素配比對芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)影響(出芽率)進(jìn)行分析，可知4種因素對出芽率的影響較大，它們依次為培養(yǎng)基類型、6-BA濃度、NAA濃度、KT濃度。高濃度的KT能夠很好地刺激大花序桉組培苗誘導(dǎo)出芽，增殖系數(shù)高，但是組培苗莖段較紅，出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象等生長不正?，F(xiàn)象。

3)通過不同培養(yǎng)基對增殖系數(shù)的影響可以看出E5(改良MS+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.3 mg·L-1)、E6(改良MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+KT 0.3 mg·L-1)、E7(改良MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1)、E8(改良MS+6-BA 0.2 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1)的增殖系數(shù)較高，可以達(dá)到4.5以上，平均增殖系數(shù)為3.6。通過增殖系數(shù)來判斷，最佳的繼代增殖培養(yǎng)基配方為：改良MS+6-BA 0.2～0.3 mg·L-1+NAA 0.1～0.2 mg·L-1+KT 0.2～0.3 mg·L-1。

為了獲得大量的繼代增殖培養(yǎng)組培苗，可選擇使用較高濃度的細(xì)胞分裂素和一定濃度的生長素配比，以提高芽體的增殖率并獲得生長良好的芽苗，但在此過程中必須控制好二者間的濃度關(guān)系[7]，細(xì)胞分裂素的濃度高于一定程度將會降低芽苗的質(zhì)量，抑制繼代增殖效果。

*：本項目得到漳州市林業(yè)局韓金發(fā)、何水東2位高級工程師；福建農(nóng)林大學(xué)陳禮光副教授；長泰巖溪國有林場張友育高級工程師的大力支持與幫助。在此表示最誠摯的謝意!