用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物中調(diào)控元件的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建

邢宇俊，陸丹丹，吳季榮，徐劍宏，王園園，梁 杰，史建榮

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室/江蘇省轉(zhuǎn)基因安全評(píng)價(jià)公共服務(wù)中心/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/中德農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全評(píng)估技術(shù)研發(fā)中心,江蘇 南京 210014)

自從首例轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品被批準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)以來(lái)，轉(zhuǎn)基因作物在不同的國(guó)家和地區(qū)開(kāi)始大規(guī)模地商業(yè)化種植，截至2017年，全球24個(gè)國(guó)家轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá)到 1.898×108hm2[1]。越來(lái)越多的已批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品出現(xiàn)在市場(chǎng)上，比如：轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、油菜、苜蓿、木瓜、棉花、甜菜、馬鈴薯等[1]。但隨著轉(zhuǎn)基因作物在全球范圍內(nèi)迅速發(fā)展，其環(huán)境和食品安全性問(wèn)題一直受到人們的關(guān)注，因此，對(duì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的檢測(cè)有利于政府職能部門對(duì)其進(jìn)行監(jiān)管和監(jiān)督。

目前，轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)的常用方法是提取檢測(cè)樣品的DNA，進(jìn)行定性PCR[2]或定量PCR檢測(cè)[3]。在PCR檢測(cè)過(guò)程中，必須設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，確保檢測(cè)結(jié)果的可比性、溯源性，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的作用十分重要[4-5]。檢測(cè)結(jié)果的可靠性、準(zhǔn)確性、有效性需要陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(包括標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒)作對(duì)照，因此陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中是不可缺少的。

雖然現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化體比較多，但市場(chǎng)上銷售的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)種類有限，價(jià)格比較高，很多標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)自歐盟標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測(cè)量研究所(IRMM-CRL) 和美國(guó)油料化學(xué)家協(xié)會(huì)( AOCS)，種類主要包括轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、油菜、水稻、棉花、甜菜等60余種[6]。而國(guó)內(nèi)這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要依賴于進(jìn)口，而且以植物原材料制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)非常復(fù)雜，不僅需要精密的儀器設(shè)備，而且對(duì)環(huán)境要求也比較高。雖然國(guó)內(nèi)也有部分轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)商業(yè)化，例如由中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院研制的Bt63，但種類有限。這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)針對(duì)的是特定品系。根據(jù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的特征，檢測(cè)方法等，建立了相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)，例如由上海交通大學(xué)建立的GMDD(http://gmdd.shgmo.org/)，以及歐盟轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)室建立的ENGL (http://gmo-crl.jrc.ec. europa .eu/engl/engl. html)。通過(guò)比較轉(zhuǎn)基因品系外源基因的信息，發(fā)現(xiàn)它們自身包含1種或幾種特定的啟動(dòng)子或終止子，并不涵蓋多個(gè)啟動(dòng)子或終止子。玉米中常使用的調(diào)控元件是CaMV35S啟動(dòng)子(35S)、NOS啟動(dòng)子(PNOS)、FMV35S啟動(dòng)子(FMV35S)、PTA 29啟動(dòng)子(PTA29)、Ubiquitin啟動(dòng)子(Ubiquitin)、35S終止子(t35S)、nos終止子(tNOS)、E9終止子(tE9)。因此，選擇這些調(diào)控元件構(gòu)建陽(yáng)性質(zhì)粒，可以更好地用于農(nóng)產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)。

陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的構(gòu)建是采用目的外源基因片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，重組于質(zhì)粒分子上，轉(zhuǎn)入微生物中進(jìn)行大量培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)是質(zhì)粒DNA容易提取且純度高，穩(wěn)定性好，并且一個(gè)質(zhì)粒分子中可以包含多個(gè)外源目的基因[7]。可以有效解決陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品缺乏和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品制備困難的問(wèn)題，因此被稱為“金標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)”[8]。

隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)要求的不斷提高，檢測(cè)方法開(kāi)始從定性PCR向定量PCR轉(zhuǎn)變，用質(zhì)粒分子作為定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)易于操作。現(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)質(zhì)粒分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已經(jīng)在玉米[9-10]和大豆[11]轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中得到很大的發(fā)展，并且已有質(zhì)粒分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(MON810)申請(qǐng)了有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[12]。但是這些研究是針對(duì)一種轉(zhuǎn)化體或一類作物，而在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的經(jīng)濟(jì)作物、蔬菜、未知材料的檢測(cè)時(shí)，需要通用型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。因此，本研究根據(jù)轉(zhuǎn)基因品種調(diào)控基因的特性，將多個(gè)啟動(dòng)子和終止子整合到質(zhì)粒分子中，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，用于大多數(shù)已經(jīng)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)和監(jiān)管。

1 材料與方法

1.1 植物樣品與試劑

TaqDNA聚合酶購(gòu)自Promega生物技術(shù)(美國(guó))有限公司，植物基因組提取試劑盒購(gòu)自Axygen生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，DNA marker、dNTPs、pMD-19T購(gòu)自TaKaRa生物工程(大連)有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。大腸桿菌DH5a菌株本實(shí)驗(yàn)室保存。轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS 40-3-2、MON87705、MON89788和A5547-127，轉(zhuǎn)基因玉米品系Bt11、MON810、Bt176、NK603和TC1507，轉(zhuǎn)基因油菜品系GT73、MS1、RF1和Oxy235，購(gòu)于美國(guó)AOCS公司和上海佑隆生物有限公司。轉(zhuǎn)基因水稻KF6和TT51-1由農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心提供。

1.2 質(zhì)粒pMD-RG的設(shè)計(jì)

針對(duì)國(guó)內(nèi)外檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中通用元件基因，構(gòu)建含有一批啟動(dòng)子(花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子CaMV35S、玄參花葉病毒35S啟動(dòng)子FMV35S、煙草花藥組織特異基因TA29啟動(dòng)子 PTA29、玉米泛素蛋白基因啟動(dòng)子Ubiquitin、胭脂堿合成酶基因NOS的啟動(dòng)子PNOS)和終止子(花椰菜花葉病毒的35S終止子t35S、胭脂堿合成酶基因NOS終止子tNOS、豌豆1,5-二磷酸核酮糖羧化酶E9基因終止子tE9)的多靶標(biāo)調(diào)控原件標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，命名為pMD-RG。設(shè)計(jì)的質(zhì)粒圖譜及大小見(jiàn)圖1。

1、2、3、4、5分別代表啟動(dòng)子CaMV35S、FMV35S、PTA29、Ubiquitin、PNOS，6、7、8分別代表終止子t35S、tNOS、tE9。圖1 重疊PCR法構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的示意圖Fig.1 Diagram of standard plasmid constructed by overlapping PCR

1.3 質(zhì)粒pMD-RG的構(gòu)建

根據(jù)CaMV35S、FMV35S、PTA29、Ubiquitin、PNOS、t35S、tNOS、tE9的相關(guān)序列信息以及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中使用的引物序列，添加合適的引物互補(bǔ)接頭(表1),利用重組PCR技術(shù)將相鄰片段連接起來(lái)，構(gòu)建示意圖見(jiàn)圖1。首先用引物35S-F/35S-FMV35S-R擴(kuò)增CaMV35S啟動(dòng)子，用引物FMV35S-F/FMV35S-PTA29-R擴(kuò)增FMV35S啟動(dòng)子，將兩部分?jǐn)U增產(chǎn)物作為模板，用引物35S-F/FMV35S-PTA29-R進(jìn)行重組PCR，從而將CaMV35S啟動(dòng)子和FMV35S啟動(dòng)子2個(gè)片段連接在一起，以CaMV35S+FMV35S表示；同樣的方法獲得PTA29+Ubiquitin、PNOS+t35S和tNOS+tE9。再以CaMV35S+FMV35S和PTA29+Ubiquitin擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用引物35S-F/Ubiquitin-PNOS-R進(jìn)行重組PCR擴(kuò)增，獲得CaMV35S+FMV35S+PTA29 +Ubiquitin片段；以PNOS+t35S和tNOS +tE9的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用引物PNOS-F/tE9-R 進(jìn)行重組 PCR 擴(kuò)增，獲得PNOS+t35S +tNOS+tE9,最后以CaMV35S+FMV35S +PTA29+Ubiquitin和PNOS+t35S+tNOS+tE9的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用引物35S-F/tE9-R進(jìn)行重組PCR擴(kuò)增，獲得CaMV35S+FMV35S+ PTA29+Ubiquitin +PNOS+t35S +tNOS+ tE9的整體序列，用于質(zhì)粒分子調(diào)控元件的構(gòu)建。將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，挑選單克隆在LB培養(yǎng)基(含有Amp)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件200 r/min，16 h。提取質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證。

表1重組PCR引物

Table1OverlappingPCRprimers

啟動(dòng)子和終止子 引物名稱 引物序列(5'→3') 擴(kuò)增片段大小(bp)CaMV35S35S-FGCTCCTACAAATGCCATCATTGC19535S-FMV35S-RggtggatgtcttGATAGTGGGATT GTGCGTCATCCCFMV35SFMV35S-FAAGACATCCACCGAAGACTTA210FMV35S-PTA29-RccacccaccttaAGGACAGCTCTTTTCCACGTTPTA29PTA29-FTAAGGTGGGTGGCTGGACTA266PTA29-Ubiquitin-RcttgccagtgttACTTGCACCACAAGGGCATAUbiquitinUbiquitin-FAACACTGGCAAGTTAGCAAT314Ubiquitin-PNOS-RacgtaaaacggcCCGTAATAAATAGACACCCPNOSPNOS-FGCCGTTTTACGTTTGGAACTG183PNOS-t35S-RcatgagcgaaacTTATGGAACGTCAGTGGAGCt35St35S-FGTTTCGCTCATGTGTTGAGC121t35ST-tNOS-RgcaacaggattcGGGGATCTGGATTTTAGTACTGtNOStNOS-FGAATCCTGTTGCCGGTCTTG180tNOS-tE9-RccaatgccataaTTATCCTAGTTTGCGCGCTAtE9tE9-FTTATGGCATTGGGAAAACTGT273tE9-RATATATTCTTCGGTCATTAGAGGC

引物中小寫(xiě)部分為接頭。

1.4 重疊PCR擴(kuò)增

用添加互補(bǔ)接頭的特異性引物分別擴(kuò)增出含有接頭的基因片段。PCR體系：10×PCR buffer 2.500 μl，Mg2+2.500 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)2.000 μl，上游引物 0.750 μl，下游引物 0.750 μl，DNA模板(50～100 ng)1.250 μl，TaqDNA聚合酶0.125 μl，補(bǔ)水至25.000 μl。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，將獲得的正確片段條帶進(jìn)行切膠回收。

將含有互補(bǔ)接頭的膠回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，進(jìn)行重疊PCR。PCR體系：10×PCR buffer 2.50 μl，Mg2+2.50 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)2.00 μl，DNA模板各1.00 μl，TaqDNA聚合酶0.25 μl，補(bǔ)水至25.00 μl。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火10 min，72 ℃延伸3 min，循環(huán)15次；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)體系中添加第1段基因的正向引物和第2段基因的反向引物，其他反應(yīng)體系和條件不變。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，將獲得的大小正確的條帶進(jìn)行切膠回收。膠回收產(chǎn)物即為2個(gè)片段的連接產(chǎn)物。

1.5 重組片段克隆與驗(yàn)證

PCR擴(kuò)增得到的特異性片段與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，涂布含Amp的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取單菌落，進(jìn)行PC擴(kuò)增驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證。

PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證：利用表2中不含接頭的引物對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD-RG的外源插入基因進(jìn)行驗(yàn)證，檢驗(yàn)所構(gòu)建的質(zhì)粒是否能夠擴(kuò)增預(yù)期的所有片段。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同方法1.4中含有接頭的基因片段的擴(kuò)增，利用2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，比較目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物同預(yù)期片段大小是否一致。

測(cè)序驗(yàn)證：由生工生物工程(上海) 股份有限公司完成質(zhì)粒分子的測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果分別同NCBI進(jìn)行blast，驗(yàn)證載體中序列的準(zhǔn)確性。

1.6 pMD-RG質(zhì)粒分子檢驗(yàn)及應(yīng)用

按照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)JJG 1006-1994[13]，對(duì)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD-RG進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)。

均勻性檢驗(yàn)：取樣方法按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)JJG 1006-1994 技術(shù)規(guī)范進(jìn)行。將稀釋至1 μl 1×106拷貝的質(zhì)粒溶液以500 μl分裝至凍存管中，共分裝300 管。從中隨機(jī)取10 管，分別標(biāo)記為 1～10，對(duì)各管質(zhì)粒分子中的每個(gè)目標(biāo)片段進(jìn)行檢測(cè)。

穩(wěn)定性檢驗(yàn)：對(duì)質(zhì)粒樣品進(jìn)行短期穩(wěn)定性比較。將質(zhì)粒溶液稀釋至1 μl 1×106拷貝，以每管50 μl 分裝至0.2 ml的PCR管內(nèi)，分別將樣品置于25 ℃、4 ℃、-20 ℃、-70 ℃存放，在第1 d、第7 d、第14 d、第21 d和第28 d時(shí)對(duì)質(zhì)粒樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行比較。

pMD-RG質(zhì)粒分子的應(yīng)用：分別以構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RG和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品中提取的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，比較質(zhì)粒分子中各調(diào)控元件的擴(kuò)增和穩(wěn)定性與基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品是否一致。PCR體系及擴(kuò)增程序同方法1.4中含有接頭的基因片段的擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 重疊PCR擴(kuò)增獲得的啟動(dòng)子和終止子重組片段

根據(jù)圖1所示，進(jìn)行載體構(gòu)建。利用表1中各基因的上游和帶有互補(bǔ)接頭的下游引物分別擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。正確的片段切膠回收后，將含有互補(bǔ)接頭的膠回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，以此作為模板進(jìn)行重疊PCR，電泳后切膠回收獲得連接產(chǎn)物，即為2個(gè)片段的連接產(chǎn)物(圖2)。

確定條帶大小正確后，進(jìn)行切膠回收，再將2個(gè)片段連接起來(lái)。分別為CaMV35SS+ FMV35S(405 bp)、PTA 29 +Ubiquitin(580 bp)、PNOS +t35S(304 bp)、tNOS +tE9(453 bp)(圖3A、圖3B、圖3C、圖3D)。之后再拼接上述片段，即CaMV35S +FMV35S +PTA 29 +Ubiquitin(985 bp)和PNOS +t35S+tNOS+tE9(757 bp)(圖3E、圖3F)。最后，將2個(gè)大片段整合起來(lái)，得到完整的8個(gè)調(diào)控元件的片斷(1 742 bp)(圖3G)。

2.2 轉(zhuǎn)基因篩查陽(yáng)性質(zhì)粒的鑒定

利用分子克隆方法，將重疊PCR擴(kuò)增獲得的重組片段連接到質(zhì)粒載體pMD-19T上，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因篩查陽(yáng)性質(zhì)粒pMD-RG。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定和驗(yàn)證。

通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA 純度及質(zhì)量濃度，測(cè)定其在260 nm、280 nm處的紫外光吸收值，將質(zhì)量濃度稀釋為50 ng/μl。測(cè)定結(jié)果表明，260 nm與280 nm處的吸光值比值在1.80至2.00 之間，260 nm與230 nm處的吸光值比值在2.0至2.3之間，說(shuō)明DNA 純度符合質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子要求。

M：DL 2000 bp marker；1：陰性對(duì)照；2～5：模板為含有目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因材料；啟動(dòng)子CaMV35S和終止子tNOS以轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2為模板；啟動(dòng)子FMV35S、終止子tE9以轉(zhuǎn)基因油菜GT73為模板；啟動(dòng)子PTA29以轉(zhuǎn)基因油菜MS1為模板；啟動(dòng)子PNOS以轉(zhuǎn)基因油菜RF1為模板；終止子t35S以轉(zhuǎn)基因玉米Bt176為模板；啟動(dòng)子Ubiquitin以轉(zhuǎn)基因玉米MON810為模板。圖2 轉(zhuǎn)基因作物中啟動(dòng)子和終止子的擴(kuò)增Fig.2 Amplification of promoter and terminator of transgenic crops

M：DL 2000 bp marker；1：陰性對(duì)照；2～5：連接后的片段。A:CaMV35S+FMV35S;B:PTA29+Ubiquitin;C:PNOS+t35S;D:tNOS+tE9;E:CaMV35S+FMV35S+PTA29+Ubiquitin;F:PNOS+t35S+tNOS+tE9;G:CaMV35S+FMV35S+PTA29+Ubiquitin+PNOS+t35S+tNOS+tE9。圖3 啟動(dòng)子和終止子的連接片段Fig.3 The segment connection of promoters and terminators

利用表1中各基因的上、下游引物，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD-RG的外源插入片段進(jìn)行驗(yàn)證[14-15]。結(jié)果顯示，擴(kuò)增條帶片段大小與預(yù)期片段大小一致(圖4)，各片段大小分別為CaMV35S 195 bp、FMV35S 210 bp、PTA29 266 bp、Ubiquitin 314 bp、PNOS 183 bp、t35S 121 bp、tNOS 180 bp、tE9 273 bp，表明載體構(gòu)建成功。同時(shí)對(duì)質(zhì)粒分子進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證(圖4)。BLAST分析結(jié)果表明：pMD-RG克隆序列長(zhǎng)1 742 bp，與實(shí)際堿基序列完全吻合。

a圖中， M為DL 2000 bp marker，NC為空白對(duì)照，1～8依次為CaMV35S、FMV35S、PTA29、Ubiquitin、PNOS、t35S、tNOS、tE9；b圖中，下劃線表示質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子構(gòu)建中所用的引物位置。圖4 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD-RG的PCR擴(kuò)增驗(yàn)證(a)和測(cè)序驗(yàn)證(b)Fig.4 PCR amplification and sequencing validation of standard plasmid pMD-RG

2.3 pMD-RG質(zhì)粒分子的均勻性和穩(wěn)定性

將pMD-RG質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子同一稀釋到1 μl 1×106拷貝，分裝，隨機(jī)抽取其中的10管進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)。PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖5)顯示10管質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子都擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的8個(gè)調(diào)控基因片段，說(shuō)明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子各管間均勻性良好。

M：DL 2000 bp marker；1～10：隨機(jī)抽取的10管質(zhì)粒分子。圖5 pMD-RG質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子均勻性驗(yàn)證Fig.5 Verification of uniformity of standard plasmid molecules of pMD-RG

對(duì)pMD-RG質(zhì)粒分子進(jìn)行短期內(nèi)穩(wěn)定性檢驗(yàn)。PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖6)表明，pMD-RG質(zhì)粒分別在25 ℃、4 ℃、-20 ℃、-70 ℃溫度下存放1 d、7 d、14 d、21 d、28 d，擴(kuò)增結(jié)果均很好。說(shuō)明短期內(nèi)pMD-RG標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒穩(wěn)定性好，擴(kuò)增結(jié)果可靠。

2.4 pMD-RG質(zhì)粒分子的應(yīng)用分析

對(duì)構(gòu)建的質(zhì)粒pMD-RG進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。從表2可以看出，質(zhì)粒pMD-RG中各調(diào)控元件均得到了擴(kuò)增并與基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果一致，證明構(gòu)建的含調(diào)控元件的篩查質(zhì)粒分子pMD-RG可以作為轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品用于轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)。

表2轉(zhuǎn)基因作物篩查質(zhì)粒pMD-RG的PCR擴(kuò)增鑒定

Table2PCRidentificationofscreeningplasmidpMD-RGfortransgeniccrop

轉(zhuǎn)基因作物品系CaMV35SFMV35SPTA29UbiquitinPNOS t35StNOStE9Bt11+NN+NN+NBt176+NN+N+NNMON810+NN+NNNNNK603+NN+NN+NTC1507+NN+N+NNA5547-127+NNNN+NNGT73N+NNNNN+TT51-1NNNNNN+NKF6+NNNN++NMS1NN+N+N+NRF1NN+N+N+NGTS40-3-2+NNNNN+NMON89788NNNNNNN+OXY235+NNNNN+N

+:檢測(cè)出相應(yīng)條帶;N:沒(méi)有檢測(cè)出。

3 討 論

轉(zhuǎn)基因作物的種植面積在逐年擴(kuò)大。在中國(guó)，每年都有轉(zhuǎn)基因品系獲得進(jìn)口證書(shū)，2017年農(nóng)業(yè)部發(fā)布轉(zhuǎn)基因生物安全證書(shū)(進(jìn)口)清單，批準(zhǔn)孟山都、拜耳、先正達(dá)等公司的16個(gè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書(shū)(進(jìn)口)，涉及的轉(zhuǎn)基因生物為大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜，用途皆為“加工原料”[16]。截至目前，中國(guó)進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品擴(kuò)大到46種，對(duì)這些獲得進(jìn)口證書(shū)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)管比較嚴(yán)格。然而，對(duì)進(jìn)口產(chǎn)品中混雜的非法進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因品種或?qū)嶒?yàn)室產(chǎn)品擴(kuò)散的監(jiān)管更為重要。對(duì)于未知產(chǎn)品的檢測(cè)，當(dāng)前采用的主要方法是通用元件基因檢測(cè)，之后對(duì)轉(zhuǎn)化體品系進(jìn)行分析。在檢測(cè)過(guò)程中，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是檢測(cè)過(guò)程中的標(biāo)尺，然而由于來(lái)源于植物原材料本身的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備過(guò)程非常復(fù)雜，需要精度很高的設(shè)備，生產(chǎn)成本較高，保存環(huán)境要求高等因素，獲得所有不同轉(zhuǎn)基因植物的標(biāo)準(zhǔn)樣品難度比較大[17]。而標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子是一種重組質(zhì)粒分子，根據(jù)需要可組合轉(zhuǎn)基因作物的內(nèi)源基因，待檢測(cè)的外源基因，轉(zhuǎn)化體特異性片段，該物種特異性片段，也可插入多組外源基因，并且制備上操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)成本低，容易獲得高純度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子DNA樣品[18]。因此含有通用元件的質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照在檢測(cè)中使用比較便捷。

在質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程中，如果選擇常規(guī)的質(zhì)粒載體構(gòu)建方法，一般利用酶切位點(diǎn)進(jìn)行重組克隆，而有時(shí)酶切的選擇和位點(diǎn)引入存在一定難度，同時(shí)在構(gòu)建過(guò)程中要進(jìn)行多次酶切和連接操作，這使得構(gòu)建過(guò)程繁雜而且構(gòu)建成本也較高[19]。本研究中選擇的重疊PCR技術(shù)比較方便快速。重疊PCR最初是用于基因定點(diǎn)突變中[20]，后來(lái)被擴(kuò)展應(yīng)用到2個(gè)片段的拼接[21]。該技術(shù)也曾在其他質(zhì)粒分子的構(gòu)建中使用，設(shè)計(jì)的引物中有18～25個(gè)堿基重疊，重疊序列能將相鄰的8個(gè)目標(biāo)DNA片段連接[22]。本研究將8個(gè)調(diào)控元件單獨(dú)擴(kuò)增后，利用重疊PCR技術(shù)將這些調(diào)控元件片段融合在一起，進(jìn)行克隆，構(gòu)建了含有8個(gè)調(diào)控元件的質(zhì)粒載體，相對(duì)于引入酶切位點(diǎn)的重組克隆，該技術(shù)更便捷快速。

本研究構(gòu)建的含有調(diào)控元件的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒均勻性一致，短期穩(wěn)定性好。已構(gòu)建好的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子可以在低溫環(huán)境下(4 ℃、-20 ℃、-70 ℃)保存3個(gè)月，對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有影響[23-24]。用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可以避免在檢測(cè)過(guò)程中陽(yáng)性物質(zhì)的多次提取，減少陽(yáng)性物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的污染。通過(guò)分析國(guó)外已批準(zhǔn)商業(yè)化和國(guó)內(nèi)處于環(huán)境釋放階段材料的插入元件信息，以及國(guó)內(nèi)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的需要，選擇轉(zhuǎn)化體中通用調(diào)控元件構(gòu)建篩查質(zhì)粒，構(gòu)建的篩查質(zhì)?？梢愿采w絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體，可作為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)和監(jiān)管的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。