“Cocktail”體外探針法評(píng)價(jià)補(bǔ)骨脂素對(duì)人肝微粒體P450酶亞型活性的影響*

張文杰，李夢榮，韓立峰，郝 佳，劉二偉

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)，中醫(yī)藥研究院，天津 300193；2．天津市中藥化學(xué)與分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193）

補(bǔ)骨脂，薔薇目豆科植物補(bǔ)骨脂（Psoralea corylifolia L．）的干燥成熟果實(shí)，主要含香豆素類、黃酮類、單萜酚類、苯并呋喃類和少量其他成分，其主要成分補(bǔ)骨脂素（PSO）屬于呋喃香豆素類化合物，具有治療白癜風(fēng)病、擬雌激素效果、抗白血病及抗腫瘤等多種藥理作用[1-3]，其作為多種中藥復(fù)方和制劑的主要成分而廣泛應(yīng)用于臨床治療當(dāng)中。實(shí)驗(yàn)證明，PSO能明顯抑制肝癌細(xì)胞等癌細(xì)胞的生長[4]，并且對(duì)去甲腎上腺素和多巴胺的轉(zhuǎn)運(yùn)具有抑制作用，可用于注意力缺陷多動(dòng)障礙、抑郁癥、帕金森病等多種疾病的臨床治療[5]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究已表明，大鼠在給予補(bǔ)骨脂水煎劑后，檢測其血清中的主要活性成分即為PSO[6]。前期藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，雄性大鼠長期服用PSO后能使聯(lián)合使用的降壓藥硝苯地平的血藥濃度升高，存在聯(lián)合用藥產(chǎn)生的不良反應(yīng)安全隱患。另有報(bào)道稱，在雄性小鼠連續(xù)28 d服用PSO后，其CYP3A11的活性顯著增高，而肝臟中CYP2E1的活性則降低[7]。但PSO對(duì)人肝微粒體CYP450酶代謝的抑制和誘導(dǎo)作用的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。

探針?biāo)幬锓?，指某些?jīng)CYP450代謝的藥物，以其代謝物和原型藥的比例或速率來衡量酶代謝能力變化的方法[8]。將兩種及兩種以上經(jīng)不同酶代謝的藥物同時(shí)給予的方法被稱為“Cocktail”探針?biāo)幬锓╗9]，此實(shí)驗(yàn)方法因具有經(jīng)濟(jì)、快速、簡便、有效的特點(diǎn)而備受推崇。作為最重要的藥物代謝酶，CYP酶約參與75%的臨床藥物的體內(nèi)代謝，其中介導(dǎo)臨床藥物代謝的5個(gè)主要的CYP同工酶分別為CYP2C9，CYP1A2，CYP2D6，CYP2E1 和 CYP3A4，而藥物在臨床上產(chǎn)生代謝性相互作用的主要原因即為其對(duì)于CYP酶的誘導(dǎo)和抑制[10-11]。所以，通過加深對(duì)中藥有效成分對(duì)CYP酶的誘導(dǎo)或抑制潛能的研究與了解，可有利于降低臨床因藥-藥相互作用而引起的風(fēng)險(xiǎn)，從而有效提高臨床用藥的安全性。

呋喃香豆素類化合物與CYP450酶之間具有非常復(fù)雜的相互作用，它們通常由CYP酶介導(dǎo)代謝，同時(shí)也可反過來對(duì)CYP酶的活性進(jìn)行抑制[12]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters Acquity H-Class高效液相系統(tǒng)（美國沃特世公司）；WatersXevo TQ-S質(zhì)譜儀（美國沃特世公司）；WatersACQUITY UPLC HSS T 3分析柱（2．1 mm×100 mm，1．8 μm）（美國沃特世公司）；恒溫水浴鍋（埃朗科技國際貿(mào)易有限公司）；超純水制造機(jī)（Millipore公司，Mill-QⅡ型）；萬分之一天平（德國Sartorius公司，BP121S）；十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司，AX-205）；渦旋混合儀（美國LABNET公司，VX-200）；超低溫冰箱（美國Thermo Heto公司，-70℃）；低溫高速離心機(jī)（德國Sigma公司）；移液槍（德國Eppendorf公司）。

1.2 試藥 色譜乙腈、色譜甲醇，德國默克公司；去離子水，美國Millipore公司；PBS溶液（北京索萊寶科技有限公司，PH7．2～7．4）；甲酸，美國 ACS 恩科化學(xué)公司；PSO（中國藥品生物制品檢定所）；非那西丁（Phe，CYP1A2的探針），甲苯磺丁脲（Tol，CYP2C9的探針），右美沙芬（Dex，CYP2D6的探針），咪達(dá)唑侖（Mdzl，CYP3A4的探針），氯唑沙宗（Chlo，CYP2E1的探針），Sigma－Aldrich；香豆素（Xds，CYP2A6 的探針），紫杉醇（Zsc，CYP2C8的探針），中國國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；對(duì)乙酰氨基酚（Apap，非那西丁代謝產(chǎn)物），4-羥基甲苯磺丁脲（4-OH Tol，甲苯磺丁脲代謝產(chǎn)物），去甲基右美沙芬（Dexde,右美沙芬代謝產(chǎn)物），α-羥基咪達(dá)唑侖（α-OH Mdzl,咪達(dá)唑侖代謝產(chǎn)物），6-羥基氯唑沙宗（6-OH Chlo，氯唑沙宗代謝產(chǎn)物），7-羥基香豆素（7-OH Xds,香豆素代謝產(chǎn)物），6α-羥基紫杉醇（6α-OH Zsc,紫杉醇代謝產(chǎn)物），中國藥品生物制品檢定所；安替比林（ATBL，內(nèi)標(biāo)），纈沙坦(XST,內(nèi)標(biāo))，中國國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。蒙古人種混合肝微粒體（20 mg/mL），瑞德肝臟有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 程序洗脫：流動(dòng)相為乙腈（A），0．1%甲酸水（B）；0～10min，A 相 3%～100%，10～15min，A 相100%。柱溫 40 °C，流速 0．4 mL/min；進(jìn)樣量 3 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜參數(shù)為：毛細(xì)管電壓，3．0 kV（正離子模式），2．5kV（負(fù)離子模式）；錐孔電壓，30V；去溶劑化溫度，450 °C；去溶劑氣流量，900 L/h（N2，純度 99．9%）；檢測模式，多反應(yīng)檢測（MRM）模式;錐孔電壓（CV）和碰撞能量（CE）如表所示，數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析使用Masslynx 4．1和TargetLynx軟件完成。

表1 CYP450酶各代謝產(chǎn)物質(zhì)譜參數(shù)

2.3 樣品的制備

2.3.1 溶液的配制 精密稱取的各探針代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品以甲醇溶液溶解后，用PBS溶液稀釋至濃度分別為 1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL 制成系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密稱取的安替比林和纈沙坦標(biāo)準(zhǔn)品以甲醇溶解，并制成濃度為100 ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液，于冰箱保存。各底物標(biāo)準(zhǔn)品以甲醇溶解后，用 PBS 溶液稀釋至 Phe、Tol、Mdzl、Chlo、Xds、Zsc 和Dex最終濃度分別為 10、5、5、5、50、10 和 5 μmol/L，制成混合底物溶液備用。

2．3．2 肝微粒體酶體外孵育體系 體外孵化反應(yīng)體系總體積為175μL，含有人肝微粒體蛋白（1mg/mL），混合探針底物溶液，NADPH溶液（5 mg/mL），將反應(yīng)體系在37°C恒溫水浴中預(yù)孵育10 min后加入25 μL的NADPH溶液作為啟動(dòng)液來啟動(dòng)反應(yīng)，總孵育體系中甲醇及其他有機(jī)試劑的含量不得超過1%[13-14]。37°C恒溫水浴孵育30 min，最后加入冰內(nèi)標(biāo)溶液100 μL終止反應(yīng)。

2.3.3 樣品的制備

2.3.3.1 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置 對(duì)照組:肝微粒體50 μL＋底物 50 μL＋PBS 溶液 50 μL，平行制備六份樣品。實(shí)驗(yàn)組：肝微粒體 50 μL＋底物 50 μL＋PSO 溶液 50 μL，平行制備6份樣品。

2.3.3.2 實(shí)驗(yàn)步驟 按各分組設(shè)置，將150 μL溶液置于EP管中，于肝微粒體酶體外孵育體系中孵育。將樣品渦旋2 min，14 000 r/min離心10 min，取上清液置于進(jìn)樣小瓶待檢測。以檢測所得代謝產(chǎn)物濃度與原底物濃度的比值所得轉(zhuǎn)化率（%）為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3 結(jié)果

3.1 專屬性 取空白人肝微粒體，加入各代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品，按樣品制備方法制備專屬性考察樣品，進(jìn)樣后所得檢測結(jié)果顯示肝微粒體中各種內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)所測的9個(gè)化合物沒有干擾，不影響結(jié)果測定，且各化合物在此條件下測定峰形良好，適合于實(shí)驗(yàn)測定，專屬性結(jié)果見圖1。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低定量限 將系列混合標(biāo)準(zhǔn)品樣品進(jìn)樣檢測后，分析各成分與其對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的峰面積比對(duì)濃度進(jìn)行權(quán)重系數(shù)為1/X的線性回歸，得到各成分的線性回歸方程，各成分線性回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)以及定量限和檢測限見表2。各成分在1～200 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 CYP450酶各代謝產(chǎn)物的回歸方程與最低定量限

3.3 精密度與準(zhǔn)確度 制備人肝微粒體中分別含有低、中、高3個(gè)濃度的各代謝產(chǎn)物的混合質(zhì)控樣品，與樣品按照相同方法進(jìn)行處理，每個(gè)濃度平行制備6份樣品，各樣品連續(xù)測定3 d，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算各成分的精密度和準(zhǔn)確度，測定結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)所用方法適合于肝微粒體中各代謝產(chǎn)物成分的檢測，精密度與準(zhǔn)確度結(jié)果見表3。

3.4 穩(wěn)定性考察 取空白人肝微粒體，配制高、中、低濃度的各代謝產(chǎn)物樣品考察其在室溫放置4 d、進(jìn)樣器（15℃）放置24 h、-20℃下放置48 h和-80℃下放置7 d以及凍融3次的穩(wěn)定性，將樣品實(shí)測值與實(shí)際值進(jìn)行比較，以RSD值小于15%為標(biāo)準(zhǔn)，檢測證明穩(wěn)定性良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可信，穩(wěn)定性結(jié)果見表4。

3.5 方法學(xué)考察結(jié)果 實(shí)驗(yàn)建立了LC-MS/MS方法同時(shí)檢測人肝微粒體中各CYP450酶探針的代謝產(chǎn)物，方法學(xué)在生物樣品分析方法指導(dǎo)原則下進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)曲線、穩(wěn)定性、專屬性、精密度及準(zhǔn)確度等內(nèi)容的全面考察與驗(yàn)證，證明所建立的檢測方法靈敏度可靠，符合生物樣品測定要求，可用于人肝微粒體中各CYP450酶探針的代謝產(chǎn)物的定量分析。

3.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 照實(shí)驗(yàn)分組和步驟制備樣品，檢測后計(jì)算得各組樣品中各探針底物轉(zhuǎn)化率（%）實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。

表3 CYP450酶各代謝產(chǎn)物的精密度與準(zhǔn)確度

表4 CYP450酶各代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性

圖1 CYP450酶各代謝產(chǎn)物多反映離子檢測圖

圖2 各分組CYP450酶代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)比實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)，以實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)化率相對(duì)對(duì)照組降低的百分比計(jì)算補(bǔ)骨脂素對(duì)各人肝微粒體P450探針底物轉(zhuǎn)化的抑制率（%）結(jié)果見表5。

表5 補(bǔ)骨脂素對(duì)各CYP450探針底物轉(zhuǎn)化的抑制率

由圖2結(jié)果可知，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中各探針底物的代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率均下降，說明PSO的加入能使人肝微粒體中 Zsc、Mdzl、Tol、Phe、Xds、Dex和 Chlo 的代謝產(chǎn)物 6α-OH Zsc、α-OH Mdzl、4-OH Tol、Apap、7-OH Xds、Dex de 和 6-OH Chlo 的轉(zhuǎn)化減弱。由表5可知，雖然總體上各人肝微粒體P450酶代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率均下降，但PSO對(duì)各亞型的抑制程度并不相同。7種代謝產(chǎn)物中，以7-OH Xds的轉(zhuǎn)化率下降最為顯著，PSO對(duì)其轉(zhuǎn)化的抑制率為95．84%，而對(duì)6α-OH Zsc的轉(zhuǎn)化的抑制最不明顯，僅為10．39%。PSO對(duì)其他幾種代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化抑制率均在82%～91%之間。

4 討論

PSO屬于呋喃香豆素類化合物，其代謝主要包括7-羥化、內(nèi)酯環(huán)開環(huán)等途徑[15]。文獻(xiàn)報(bào)道，呋喃香豆素類在體內(nèi)主要經(jīng)細(xì)胞色素P450酶（CYP）代謝并對(duì)CYP酶有抑制或誘導(dǎo)作用，應(yīng)用大鼠肝微粒體研究發(fā)現(xiàn)，PSO對(duì)CYP1A2有較強(qiáng)的抑制作用[16]。研究顯示[17]，PSO在肝微粒體系中能夠被代謝，PSO容易在肝臟內(nèi)蓄積，酶亞型2E1、2D6等參與PSO的代謝。

本實(shí)驗(yàn)采用“Cocktail”體外探針法，通過PSO與探針?biāo)幬锏母偁幮源x，來研究其對(duì)人肝微粒體P450 酶中 CYP2C9、2D6、3A4、2A6、2E1、1A2 和 2C8 7種亞型的影響。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，7種代謝產(chǎn)物中，PSO對(duì)CYP2A6所對(duì)應(yīng)代謝產(chǎn)物7-OH Xds的轉(zhuǎn)化的抑制程度最強(qiáng)，其次為Apap和Dexde，而對(duì)6α-OH Zsc的抑制最不明顯。即補(bǔ)骨脂素對(duì)CYP2A6亞型的代謝抑制作用最強(qiáng)，其次為CYP1A2和2D6及其他亞型，而對(duì)CYP2C8的作用不顯著。說明補(bǔ)骨脂素在肝臟的代謝主要通過CYP2A6、1A2 和 2D6 3 種亞型，CYP2C9、3A4 和2E1也參與，對(duì)CYP2A6、1A2和2D6 3種亞型代謝依賴性藥物需關(guān)注藥物相互作用。硝苯地平為人肝微粒體中CYP3A4亞型的特異性底物[18]，其代謝有3A4亞型的參與，故其與補(bǔ)骨脂聯(lián)合使用時(shí)出現(xiàn)的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化也找到了原因。

聯(lián)合用藥中各藥物之間產(chǎn)生代謝性相互作用的原因多為所含的各種有效成分對(duì)CYP酶產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用，從而造成與其合用藥物的藥代動(dòng)力學(xué)行為特征的變化。