Xpert MTB/RIF技術(shù)對疑似淋巴結(jié)結(jié)核診斷價值

周 林 謝文君 聶姬鋒 朱 敏

作者單位：浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院微創(chuàng)外科（周林，聶姬鋒）、病理科（謝文君）、結(jié)核科（朱敏）（杭州 310004）

淋巴結(jié)結(jié)核是最常見的肺外結(jié)核，約占全部肺外結(jié)核的30%～40%。由于淋巴結(jié)核進展期常并發(fā)膿腫及竇道，患者傷口長期不愈，給患者帶來極大痛苦，所以早期快速診斷對其治療尤為重要。病理診斷和病原學診斷在淋巴結(jié)核中具有重要意義，然而由于相當一部分病例缺乏典型病理學形態(tài)及含菌量少，臨床診斷仍存在困難。Xpert MTB/RIF方法是一種快速、全自動的核酸擴增檢測。我們在既往研究中在采用該方法檢測臨床確診的淋巴結(jié)結(jié)核標本，取得滿意效果[1]。本研究探討Xpert MTB/RIF技術(shù)對疑似淋巴結(jié)結(jié)核診斷的價值，現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

1.1 研究對象 選取2016年4月—2018年4月在浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院門診及住院的初診疑似淋巴結(jié)結(jié)核患者100例作為研究對象，其中女性74例，男性 26 例，年齡 21～63 歲，平均（31.5±9.6）歲。所有患者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過（浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理臨審201603號）。

1.2 納入、排除標準 納入標準：（1）體表可觸及腫大的淋巴結(jié)，抗生素治療兩周及以上無效，同時伴有肺結(jié)核和/或其他部位結(jié)核；（2）淋巴結(jié)軟化形成膿腫，CT或B超提示淋巴結(jié)中央壞死；（3）外院淋巴結(jié)穿刺病理提示肉芽腫性淋巴結(jié)炎。滿足以上任意1條即納入研究組。排除標準：經(jīng)活檢或細針穿刺病理檢查，明確診斷為淋瘤，轉(zhuǎn)移性腫瘤等非淋巴結(jié)結(jié)核疾病者；不進行診斷性抗結(jié)核治療及隨訪。

2 方法

所有患者接受淋巴結(jié)細針穿刺或者淋巴結(jié)切除術(shù)，所取得的標本分別進行Xpert MTB/RIF檢查，病理學檢查（包含細胞學涂片和組織病理切片，同時進行HE染色和抗酸染色）以及BACTEC MGIT 960液體快速培養(yǎng)。

2.1 Xpert檢測 采用美國Cepheid公司全自動GeneXpert儀器及Xpert MTB/RIF試劑盒，取約1mL標本置于前處理管中，加入2mL前處理液。震蕩20s后靜置15min至標本完全溶解，利用移液槍將上清液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)盒中，將反應(yīng)試劑盒掃描二維碼，錄入信息，放入儀器中，2h后讀取數(shù)據(jù)。

2.2 BACTEC MGIT 960液體快速培養(yǎng) 采用美國BD公司生產(chǎn)BACTEC MGIT 960全自動分析儀，按標準操作程序進行分枝桿菌快速培養(yǎng)，陽性培養(yǎng)液進行一線抗結(jié)核藥的藥敏試驗。同時陽性培養(yǎng)液接種至羅氏固體培養(yǎng)基，采用對硝基苯甲醛法鑒定結(jié)核分支桿菌（MTB）或非結(jié)核分枝桿菌（NTM）。并采用改良羅氏絕對濃度間接法進行抗結(jié)核藥物的敏感性試驗。具體操作步驟參照《結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》[2]進行。

2.3 病理學檢查 每份標本制作2張病理切片或涂片（膿液標本），分別進行HE染色和抗酸染色。根據(jù)《中國結(jié)核病病理學診斷專家共識》[3]，病理結(jié)果判定：（1）膿液涂片或病理切片，經(jīng)抗酸染色染色可見分枝桿菌為確診淋巴結(jié)結(jié)核；（2）HE染色發(fā)現(xiàn)干酪樣肉芽腫或干酪樣壞死，為確診淋巴結(jié)結(jié)核；（3）HE染色顯示上皮樣肉芽腫性炎和（或）凝固性壞死，但抗酸染色陰性者判為疑似淋巴結(jié)結(jié)核；（4）不符合前3項任何1項者判為病理結(jié)果陰性。

2.4 淋巴結(jié)結(jié)核診斷標準[4]以臨床最后綜合診斷為金標準，滿足下列任意1項即可診斷為淋巴結(jié)結(jié)核：（1）病理學檢查確診；（2）結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性；（3）疑似患者經(jīng)診斷抗結(jié)核治療有效者，臨床診斷為淋巴結(jié)結(jié)核。

2.5 診斷性抗結(jié)核治療指征及治療結(jié)果判定 （1）診斷性抗結(jié)核治療指證：病理診斷疑似且Xpert檢測陽性者但培養(yǎng)陰性患者進行HRZE方案1～3個月診斷性抗結(jié)核治療。病理檢測，培養(yǎng)和Xpert檢測皆為陰性患者進行密切隨診，如淋巴結(jié)進行性腫大或者出現(xiàn)壞死者進行診斷性抗結(jié)核治療。

2.6 治療結(jié)果判定 經(jīng)過診斷性抗結(jié)核治療后，臨床觀察病情有緩解，影像學檢查顯示最大淋巴結(jié)長徑縮小1/3以上者認為抗結(jié)核治療有效。

2.7 統(tǒng)計學方法 使用簡明統(tǒng)計14.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計算Xpert方法檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度。使用卡方檢驗比較三種檢測方法的敏感度及特異度差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 病例納入及最后診斷結(jié)果 本組100例疑似淋巴結(jié)結(jié)核患者納入研究，最后確診淋巴結(jié)結(jié)核88例，其中頸部淋巴結(jié)結(jié)核83例，腋下淋巴結(jié)結(jié)核4例，腹股溝淋巴結(jié)結(jié)核1例。確診非淋巴結(jié)結(jié)核12例，其中貓抓病性淋巴結(jié)炎4例，壞死性淋巴結(jié)炎4例，結(jié)節(jié)病2例，異物肉芽腫1例，非結(jié)核分支桿菌性淋巴結(jié)炎1例。

3.2 三種方法在88例確診淋巴結(jié)結(jié)核中的檢測結(jié)果 以最后臨床確診的88例淋巴結(jié)結(jié)核病例為標準，Xpert檢測、病理及960快速培養(yǎng)檢出結(jié)核分支桿菌的敏感度分別為 95.45%（84/88），69.32%（61/88）和 23.86%（21/88），特異度為 100%（12/12），100%（12/12）及 91.67%（11/12）。Xpert檢測的敏感度明顯高于病理（χ2=20.711，P＜0.01）和 960 快速培養(yǎng)（χ2=93.701，P＜0.01）。

3.3 三種方法在12例確診非淋巴結(jié)結(jié)核中的檢測結(jié)果 在12例非淋巴結(jié)結(jié)核病例中，病理疑似有8例，960培養(yǎng)陽性1例，經(jīng)菌種鑒定為非結(jié)核分枝桿菌，三種檢測方法特異度無明顯差別（χ2=2.057，P＞0.05）。

3.4 Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測淋巴結(jié)結(jié)核的利福平耐藥結(jié)果 在21份MTB培養(yǎng)陽性的標本中，經(jīng)抗結(jié)核藥物敏感試驗確定有5例耐藥菌株，1例為利福平及異煙肼耐藥，3例為利福平耐藥，1例為利福平、異煙肼和鏈霉素耐藥。在5例耐藥樣本中，Xpert MTB/RIF全部檢測出rpoB基因突變，檢測敏感度為100%（5/5）。在培養(yǎng)陰性的確診淋巴結(jié)結(jié)核病例中，XpertMTB/RIF檢測出1例利福平耐藥陽性，經(jīng)過復(fù)檢仍為陽性。

4 討論

淋巴結(jié)結(jié)核目前臨床主要依靠病理，分枝桿菌培養(yǎng)和影像學來診斷。由于淋巴結(jié)結(jié)核組織中含菌量少，臨床上培養(yǎng)陽性率并不高，培養(yǎng)陰性也不能否定淋巴結(jié)結(jié)核的診斷，而且培養(yǎng)周期長，即使是960液體培養(yǎng)最快也需要13天，常常延誤治療。病理檢查在淋巴結(jié)結(jié)核診斷中具有重要的意義，其確診依據(jù)主要有發(fā)現(xiàn)干酪樣壞死的肉芽腫及抗酸染色發(fā)現(xiàn)分枝桿菌。然而由于病期不同和病理形態(tài)的多樣性，相當一部分病例中只有肉芽腫樣改變，而無典型的干酪樣肉芽腫和壞死結(jié)構(gòu)，其他非結(jié)核性疾病也可以出現(xiàn)類似的肉芽腫，常導(dǎo)致鑒別困難。而且對于液化壞死的淋巴結(jié)結(jié)核，其標本難以獲得結(jié)構(gòu)較完整的組織學行病理學檢查，加上抗酸染色陽性檢出率較低，導(dǎo)致臨床病理常無法做出確切診斷[5]。菌陰及病理不典型的病例往往是臨床診斷的難點所在。

Xpert MTB/RIF技術(shù)又稱為半巢式實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù)，能同時進行結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥性檢測，檢測時間僅需2h。既往大量研究里，該技術(shù)已顯示出在肺結(jié)核診斷的優(yōu)異性能[6-7]。2013年，WHO推薦將Xpert技術(shù)用于肺外結(jié)核的診斷。Tadesse等[8]應(yīng)用Xpert MTB/RIF檢測143例，疑似淋巴結(jié)結(jié)核細針穿刺活檢樣本，以培養(yǎng)陽性或涂片陽性為金標準做比較，檢測的敏感性為87.8%，特異性為91.1%。近年來國內(nèi)也陸續(xù)有少量類似研究[9-10]。但上述研究多單純以培養(yǎng)或病理作為金指標比較，這樣容易遺漏菌陰性及病理不典型的淋巴結(jié)結(jié)核，低估Xpert方法的診斷效能。有的只是在確診淋巴結(jié)結(jié)核樣本中檢測，缺乏前瞻性的研究。既往研究中將Xpert MTB/RIF技術(shù)用于檢測臨床確診淋巴結(jié)結(jié)核樣本中的結(jié)核分枝桿菌，并以非結(jié)核樣本作為陰性對照，結(jié)果顯示該技術(shù)具有極為優(yōu)異的敏感度和特異度[1]。在此基礎(chǔ)上，本研究納入疑似淋巴結(jié)結(jié)核病例進行前瞻性研究，并綜合病原學，病理以及診斷性抗結(jié)核結(jié)果，以臨床綜合診斷作為標準，對Xpert MTB/RIF方法的診斷效能進行更真實的評價。本研究顯示，Xpert MTB/RIF技術(shù)在疑似淋巴結(jié)結(jié)核病例中具有較高的診斷效能。在最后臨床確診88例淋巴結(jié)結(jié)核中，Xpert MTB/RIF技術(shù)的檢測敏感度高達95.45%，明顯優(yōu)于病理檢測及960液體培養(yǎng)，而特異度無明顯差別，與我們前期研究結(jié)果一致。在臨床確診的淋巴結(jié)結(jié)核中，病理檢查結(jié)果為疑似的有27例，960液體培養(yǎng)陰性的為67例，而Xpert方法仍能在上述病例中分別檢測出24例和63例陽性，這可能與該方法只需檢測出標本中少量存在的結(jié)核分枝桿菌DNA，而無需完整的菌體或者活菌有關(guān)，也顯示出該方法在病理不典型和菌陰性病例中的特殊診斷優(yōu)勢。我們發(fā)現(xiàn)在12例非淋巴結(jié)結(jié)核病例中，960液體培養(yǎng)有1例陽性，經(jīng)菌種鑒定證實為非結(jié)核分枝桿菌，而Xpert方法檢測結(jié)果為陰性。由于具有相似的臨床表現(xiàn)及病原學形態(tài)，在培養(yǎng)陰性的情況下非結(jié)核分支桿菌淋巴結(jié)炎與結(jié)核性淋巴結(jié)炎極難鑒別[11]，而Xpert方法只針對結(jié)核分枝桿菌DNA進行擴增，理論上該技術(shù)應(yīng)能快速有效鑒別結(jié)核及非結(jié)核分支桿菌感染，但還需更多病例研究證實。

Xpert MTB/RIF技術(shù)可通過檢測是否存在rpoB基因突變來證實有無利福平耐藥。研究顯示，在5例耐藥樣本中，Xpert MTB/RIF全部檢測出rpoB基因突變，檢測敏感度為100%（5/5）。在培養(yǎng)陰性的確診淋巴結(jié)結(jié)核病例中，Xpert MTB/RIF方法發(fā)現(xiàn)1例利福平耐藥陽性，經(jīng)過復(fù)檢仍為陽性，我們推測該樣本存在利福平耐藥，但由于含菌量少，所以導(dǎo)致液體培養(yǎng)陰性。由于檢測時間短，Xpert MTB/RIF方法的利福平耐藥檢測可以有效指導(dǎo)早期抗結(jié)核方案，但由于二線抗結(jié)核藥物昂貴，在沒有藥敏結(jié)果的情況下，我們建議針對Xpert MTB/RIF方法檢測出的利福平耐藥應(yīng)復(fù)檢，如仍為耐藥可以結(jié)合臨床抗結(jié)核治療效果改用二線藥物。

綜上所述，Xpert MTB/RIF方法具有操作簡便、耗時短、敏感度及特異度高的特點，能同時在淋巴結(jié)結(jié)核標本中行結(jié)核分枝桿菌檢測及利福平耐藥診斷，在診斷淋巴結(jié)結(jié)核中具有較高的診斷效能，并能早期指導(dǎo)有效抗結(jié)核治療，尤其是在病理疑似和菌陰性淋巴結(jié)結(jié)核的診斷中具有特殊優(yōu)勢，值得作為診斷淋巴結(jié)結(jié)核的方法常規(guī)推廣應(yīng)用。