氧化應(yīng)激在年齡相關(guān)性耳聾中的作用研究進(jìn)展

于慧檸 鄭體花 鄭慶印

濱州醫(yī)學(xué)院(煙臺264003)

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和醫(yī)療技術(shù)進(jìn)步，人們的生活水平日益提高，人均壽命不斷延長，隨之而來的是人口老齡化和年齡相關(guān)性疾病發(fā)病率的升高。年齡相關(guān)性聾 (Age-related hearing loss，ARHL)是其中所占比重較大的疾病之一。美國最新人口普查數(shù)據(jù)顯示，到2030年65歲以上人口數(shù)量將達(dá)到7300萬。其中有4100萬人會存在聽力損失，占65歲以上人口的56.2%[1]，其中，65歲以上人群中的發(fā)病率約25%-40%，75歲以上人群發(fā)病率為40%-66%，而85歲以上的人群發(fā)病率高達(dá)80%[2]。據(jù)報(bào)道，2025年到2040年之間，我國老年人口將從2.84億達(dá)到4億，其中有11.04%為聽力殘疾，致殘?jiān)蛑?，ARHL占66.78%[3]。耳聾不僅影響了患者本身的生活質(zhì)量，使患者變得孤立、抑郁，同時(shí)由于溝通困難失去生產(chǎn)力而對社會造成的間接損失也不容忽視[4]。目前為止，聽覺輔助裝置是防治ARHL最主要的方法，但由于其價(jià)格因素，在國內(nèi)老年性聾人群中應(yīng)用明顯受限[5]。因此，加快尋找明確的發(fā)病機(jī)制是研究防治ARHL的重要途徑。氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）過量累積導(dǎo)致衰老性疾病的理論在很多研究中得到了共識，在ARHL發(fā)病機(jī)制的研究中氧化應(yīng)激通路也受到了廣泛關(guān)注。

1 氧化應(yīng)激與衰老

氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基包括氧自由基和氮自由基，其中對ROS的研究相對較多。ROS可產(chǎn)生于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化還原反應(yīng)、一氧化氮合成中，也可產(chǎn)生于線粒體、微粒體、過氧化物酶進(jìn)行正常生理活動的進(jìn)程中。盡管低濃度的ROS對機(jī)體傳遞能量、保持活力、殺死細(xì)胞、消除炎癥和分解毒素等而言是必須的，但異常高水平的ROS則變成“污染物”[6]，機(jī)體內(nèi)抗氧化酶和ROS的平衡被打破可引起組織的病理改變。在組織內(nèi)ROS可使酶失活，破壞DNA成片段，攻擊不飽和脂肪酸，形成脂質(zhì)過氧化物，形成的脂質(zhì)過氧化物又可以引發(fā)臨近的不飽和脂肪酸的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，通過與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸反應(yīng)，抑制DNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄并產(chǎn)生乙二醇胸腺嘧啶及8-脫氧鳥苷，兩者都是氧化性DNA損傷的直接產(chǎn)物[7]。

ROS過量累積導(dǎo)致衰老性疾病的理論在很多研究中得到了共識，如：糖尿病、癌癥、心血管疾病、帕金森病和阿爾茨海默病等[8]。研究表明，過量累積的ROS也是導(dǎo)致應(yīng)激介導(dǎo)的耳聾的重要病理機(jī)制[9]，如噪音性聾[10]、藥物性聾[11]、耳鳴[12]、老年性聾。機(jī)體無時(shí)無刻不存在ROS的產(chǎn)生，即便是身體狀況一直健康的老年人在65歲之后也會出現(xiàn)耳聾的癥狀，這說明隨著年齡的增長而累積的ROS與ARHL的發(fā)生密切相關(guān)。因此ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激是研究ARHL必不可少的通路。

2 年齡相關(guān)性聾

ARHL臨床上又稱老年性聾（Presbycusis），發(fā)病從高頻聽力損失開始，逐漸累積低頻聽力，以聽覺靈敏度降低為主，伴隨著言語識別力的下降，是雙耳對稱出現(xiàn)并緩慢發(fā)展的一種疾病，其具體的分子機(jī)制目前尚不清楚，被認(rèn)為是一種多因素共同作用的疾病，致病危險(xiǎn)因素包括外因(噪音，藥物，創(chuàng)傷，血管損傷，代謝變化和免疫系統(tǒng)疾病)、內(nèi)因、遺傳、基因等[13,14]。Schuknecht[15]提出的臨床常見的四種主要類型的ARHL，每一種都有不同的聽覺表征：1.感音性：耳蝸底回毛細(xì)胞退行性變，高頻聽力損失；2.神經(jīng)性：螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元丟失，言語識別力降低；3.代謝性：血管紋萎縮，純音聽力圖低平；4.機(jī)械傳導(dǎo)性：基底膜柔韌性降低，能量的機(jī)械傳導(dǎo)受損。在這4種類型獨(dú)立的分型比較少見，大部分ARHL的臨床類型是兩種或者兩種以上的混合類型，這樣的分型與其病理分型有關(guān)。ARHL的病理學(xué)特點(diǎn)包括毛細(xì)胞丟失、血管萎縮、螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的喪失以及中樞聽覺通路的退化，大多數(shù)的ARHL病例都是這些病理變化的混合物[16]。

目前的研究表明，氧化應(yīng)激和mtDNA損傷是ARHL的重要機(jī)制之一[9,17]，二者相輔相成，相互聯(lián)系共同作用于毛細(xì)胞的凋亡過程。有學(xué)者認(rèn)為氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量的ROS,ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡又分為內(nèi)、外兩種途徑[18]，細(xì)胞外途徑即ROS直接損傷細(xì)胞，通過刺激細(xì)胞外的跨膜受體激活Caspase8和下游的Caspase3啟動了細(xì)胞凋亡；細(xì)胞內(nèi)途徑則通過線粒體發(fā)揮損傷作用，線粒體除了細(xì)胞膜通透性改變，激活了Caspase9和其下游效應(yīng)因子細(xì)胞色素酶c引起細(xì)胞凋亡外，還釋放了大量的ROS，如此惡性循環(huán)加重了聽覺感受細(xì)胞不可逆凋亡的進(jìn)程，使得ARHL一旦發(fā)生便無法逆轉(zhuǎn)[18]。

3 氧化應(yīng)激與ARHL的研究進(jìn)展

3.1 氧化應(yīng)激與ARHL

如前所述，ARHL的發(fā)生與毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)不可逆的凋亡密切相關(guān)[16]。目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，ARHL的患者或動物模型體內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白或因子的表達(dá)量升高而抗氧化相關(guān)蛋白或因子含量明顯下調(diào)，證實(shí)了ARHL與氧化應(yīng)激存在一定的密切關(guān)系。

Neri等[19]在老年耳聾患者頸靜脈中檢測到高水平表達(dá)的丙二醛（MDA）和4羥基壬烯酸（4-HNE），而這兩個指標(biāo)是反映氧化應(yīng)激水平的標(biāo)志物，表達(dá)量升高可能與內(nèi)皮組織易遭受氧化應(yīng)激產(chǎn)物攻擊有關(guān)；Jiang等[20]利用谷胱甘肽共軛標(biāo)記蛋白監(jiān)測到H2O2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平在CBA∕J小鼠12月齡表達(dá)升高，4-HNE、硝基酪氨酸（3-NT）等羥自由基和過氧硝酸鹽的產(chǎn)物在18月齡表達(dá)升高，23月齡后在螺旋神經(jīng)節(jié)、血管紋和螺旋韌帶被檢測到。除了ROS外，NOS也與ARHL有關(guān)，NO是一種潛在的神經(jīng)毒素，過量產(chǎn)生的NO可作為自由基本身或在誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（Inducible Nitric-Oxide Synthse，iNOS）作用下與O2-結(jié)合形成過氧亞硝基，老齡的大鼠耳蝸中iNOS的表達(dá)量明顯高于幼齡鼠[21]。

與氧化應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)上調(diào)相反的是，抗氧化系統(tǒng)相關(guān)因子在老年性耳聾發(fā)生時(shí)其表達(dá)量明顯下調(diào)，例如在Jiang等[20]的實(shí)驗(yàn)中觀察到凋亡誘導(dǎo)因子和超氧化物歧化酶在CBA∕2J小鼠18月齡Corti氏器和螺旋神經(jīng)節(jié)中表達(dá)量下降。Liu等[22]認(rèn)為正常情況下耳蝸中存在兩類抗氧化酶：與谷胱甘肽還原酶代謝相關(guān)的谷胱甘肽過氧化物酶-1(GPX1)、谷胱甘肽還原酶(GSR)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)；與分解超氧陰離子和過氧化氫相關(guān)的過氧化氫酶（CAT）和Cu∕Zn超氧化物歧化酶（SOD1），如果抗氧化酶功能受損則會導(dǎo)致細(xì)胞損傷。動物實(shí)驗(yàn)證明，敲除Gpx1和Sod1基因的小鼠模型對年齡相關(guān)性聾和噪音性聾更易感[23-25]。GST是已知的由多個基因編碼的、發(fā)揮抗氧化作用和解毒作用的超家族酶的總稱，可能也發(fā)揮了保護(hù)毛細(xì)胞的作用[26]，其中GSTM1和GSTT1是GST家族系統(tǒng)遺傳學(xué)的主要研究對象，編碼GSTM1和GSTT1的基因在人群中存在基因變異，多達(dá)50%的ARHL人群存在GSTM1無效表型[27]，這種突變使得抗氧化酶與代謝產(chǎn)物無法準(zhǔn)確結(jié)合，導(dǎo)致基因突變攜帶者更容易遭受氧化應(yīng)激損傷，而且GSTM1基因突變攜帶者與正常人相比，高頻聽力的振幅更小，因而可能更易感年齡相關(guān)性聾[28]。除此之外，維生素A和鋅具有抗氧化衰老的功效，Lasisi等[29]研究了126例老年性耳聾患者的血清發(fā)現(xiàn)，高頻聽力損失的老年性耳聾患者血清里的維生素A和鋅的含量顯著降低。

正常情況下機(jī)體產(chǎn)生的ROS能被內(nèi)源性抗氧化酶如過氧化物歧化酶、谷胱甘肽等清除，從而保持組織所處微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[30]。隨著年齡的增長，衰老打破了這個平衡，使得ROS不能被充分清除，過量積累的ROS攻擊靶點(diǎn)線粒體，造成線粒體內(nèi)膜的損傷，影響跨越線粒體膜的質(zhì)子濃度梯度，使線粒體合成ATP的功能受損；同時(shí)，線粒體功能受損使生成的ROS增多，不能被及時(shí)清除，造成生物膜結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過氧化，損傷生物膜通透性，引起電子傳遞連的活性進(jìn)一步下降，形成的惡性循環(huán)最終引起細(xì)胞凋亡[31]。因此，氧化應(yīng)激不僅能直接造成毛細(xì)胞凋亡，還能通過攻擊線粒體造成損傷。

3.2 mtDNA損傷與ARHL

線粒體功能紊亂在聽力損失中的作用得到了證實(shí)：Sediman等[7]在老年性耳聾患者的顳骨切片中檢測到了mtDNA的缺失；我國學(xué)者韓維舉等[32]通過采用基因重組，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等技術(shù)，檢測到老年性耳聾患者組和老年正常聽力組mtDNA4977表達(dá)量存在差異，老年性耳聾患者組mtDNA4977的缺失率明顯高于老年正常聽力組，兩組數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。劉俊等[33]在Wistar大鼠模型上檢測mtDNA4977同源基因mtDNA4834發(fā)現(xiàn)，與青年大鼠相比，老年大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)和耳蝸核中mtDNA4834缺失率分別為66.7%和100%，而青年大鼠無mtDNA4834的缺失。

考慮到以人為老年性耳聾疾病研究對象的局限性，建立相關(guān)動物模型更利于研究。動物實(shí)驗(yàn)證明，敲除與線粒體相關(guān)的某些因子后，實(shí)驗(yàn)動物的聽力與正常組相比明顯下降[34]，例如mtDNA聚合酶Polg負(fù)責(zé)線粒體的復(fù)制和修復(fù)，Polg基因敲除的小鼠衰老速度要明顯快于正常小鼠，同時(shí)伴有聽力損失[35]。谷胱甘肽過氧化物酶1（Gpx1）通過降低過氧化氫的含量而在線粒體抗氧化防御中發(fā)揮重要作用，Gpx1基因敲除小鼠與正常小鼠相比更易感噪聲性聾。除了上述的動物模型以外，長期注射D-半乳糖(D-gal)的大鼠最近被用作老化或抗老化藥理學(xué)研究的動物模型[36]。長期注射D-gal可以誘導(dǎo)mtDNA4977缺失，模仿哺乳動物的自然老化過程[37]。Chen等[38]認(rèn)為D-gal誘導(dǎo)的老化大鼠模型內(nèi)耳的抗氧化酶活性降低，脂質(zhì)過氧化顯著，聽力水平較正常大鼠明顯降低。此外，在老化大鼠模型的聽覺皮層、耳蝸核和下丘上也發(fā)現(xiàn)了mtDNA的缺失。眾多對mtDNA突變的研究顯示，線粒體功能紊亂嚴(yán)重影響了聽力水平。

那么ROS的產(chǎn)生和線粒體損傷存在怎樣的聯(lián)系呢？

線粒體是有氧活動的供能者和細(xì)胞死亡的調(diào)解者。它既可以利用氧進(jìn)行氧化磷酸化形成ATP供能，又是ROS損傷的靶點(diǎn)，還能在此過程中產(chǎn)生ROS破壞細(xì)胞[31]。人類的每個細(xì)胞都含有大量的線粒體，毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和血管紋中的含量更多，是高氧代謝需求器官，且毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均為終端分化細(xì)胞，數(shù)量有限且不可再生，mtDNA突變極易在這兩種細(xì)胞中累積[39]。隨著年齡增加和機(jī)體衰老的發(fā)生，內(nèi)耳供血供氧不足，線粒體作為有氧代謝的主要場所對缺血缺氧十分敏感，加上局部ROS的大量累積，線粒體功能受損明顯，起初ATP產(chǎn)生低下，依靠ATP的生理活動受抑制，離子運(yùn)輸紊亂、聲信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效率降低，聽覺出現(xiàn)異常；隨著mtDNA突變率增加，最終啟動了細(xì)胞凋亡程序?qū)е铝嗣?xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡[40]，造成了ARHL不可逆轉(zhuǎn)的發(fā)生。Someya[41]的實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了ROS和mtDNA損傷的存在一定聯(lián)系，過表達(dá)線粒體過氧化氫酶的轉(zhuǎn)基因小鼠（MCAT）與正常野生型小鼠相比毛細(xì)胞缺失率下降，DNA損傷減少，ARHL的發(fā)病時(shí)間明顯延緩。

4 抗氧化劑與ARHL

無論是ROS的直接作用還是通過損傷mtDNA間接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，多數(shù)研究證實(shí)了ROS參與并介導(dǎo)了ARHL的發(fā)生發(fā)展，那么阻止或延緩ROS的過量積累也許是預(yù)防或治療ARHL的一種方法。

預(yù)防ARHL是一個相對較新的研究領(lǐng)域。在過去的幾年里，研究人員試圖阻止或減緩ARHL的發(fā)病或進(jìn)展，主要方法包括增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)能力和增加外源性抗氧化劑。關(guān)于補(bǔ)充抗氧化劑干預(yù)ARHL的基本觀點(diǎn)來自于幾個以人群為對象的研究，這些研究表明飲食中的維生素?cái)z入量與ARHL的患病率有顯著的相關(guān)性[42]。然而更多的抗氧化劑的聽力保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)還是以動物模型作為研究對象。Seidman曾進(jìn)行過一項(xiàng)隨機(jī)前瞻性研究[43]，對344只Fischer大鼠持續(xù)喂養(yǎng)維生素E（VE）、維生素C(VC)、拉扎洛依（預(yù)防阿爾茲海默癥藥物）和褪黑素，觀察小鼠體內(nèi)抗氧化水平和聽力損失情況，發(fā)現(xiàn)喂食抗氧化劑的動物聽力水平要高于正常喂食的動物。VE是一種有效的脂溶性抗氧化劑，易提供氫原子來終止氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，且對保護(hù)循環(huán)脂蛋白以及細(xì)胞膜的正確功能和穩(wěn)定性也至關(guān)重要。VC或抗壞血酸是一種水溶性維生素，它是超氧化物、硫醇、單基氧和羥基自由基的有效清除劑。褪黑素能直接中和羥基自由基和過氧化自由基，還能通過激活GSH過氧化物酶，抑制一氧化氮合酶的活性，起到間接抗氧化的作用。拉扎洛依通過抑制脂質(zhì)過氧化、維持細(xì)胞膜中VE含量、增加細(xì)胞表面黏度等來增加細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。2002年Seidman等[44]又探討了卵磷脂與ARHL的關(guān)系。卵磷脂是一種多不飽和的磷脂酰膽堿，它在激活大量的膜定位酶中發(fā)揮限速作用，其中包括SOD和GSH，是保護(hù)細(xì)胞膜免受ROS損傷的重要抗氧化劑。Seidman指出，所有抗氧化劑治療組，包括VE、VC、褪黑素、拉扎洛依、以及卵磷脂，都有較好的聽覺敏感性，與安慰劑組相比，mtDNA缺失的更少。補(bǔ)充VC的實(shí)驗(yàn)組動物聽閾甚至下降了10dB。另有研究表明，抗氧化劑α-硫辛酸和輔酶Q10可減少耳蝸毛細(xì)胞的死亡并有效預(yù)防或延緩老年性耳聾的發(fā)生[45,46]。α-硫辛酸是一種親脂的自由基清除劑，具有低毒性和高滲透性，易穿過血腦屏障，能明顯降低Wistar大鼠內(nèi)耳mtDNA4834 bp的缺失，提高了老年受試鼠的聽力水平；輔酶Q10是一種線粒體輔酶，對ATP的產(chǎn)生至關(guān)重要。最新研究發(fā)現(xiàn)，給Ggt1dwg∕dwg小鼠喂食N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）可有效保護(hù)毛細(xì)胞，延緩毛細(xì)胞的凋亡[47]。NAC具有較強(qiáng)的抗氧化性能，能有效清除活性氧。NAC還上調(diào)了GSH和谷胱甘肽過氧化物酶的含量，通過防止脂質(zhì)過氧化而抑制了ROS的生成。另外，某些具有抗氧化作用的中藥成分也用來研究對ARHL的預(yù)防作用，例如，葡萄籽提取物低聚原花青素對Wistar大鼠老年性耳聾的發(fā)生具有延緩作用[48]。因此，以氧化應(yīng)激為靶點(diǎn)的抗氧化藥物也許能為延緩ARHL尋找新的治療方法。

雖然目前已經(jīng)構(gòu)建了大量的動物模型來尋找ARHL最佳的預(yù)防和治療策略，但是不同鼠種模型之間存在高度變異性，目前尚不清楚哪一類模型與人類老年性耳聾最相似。抗氧化劑治療ARHL在人群中的首次研究是在一組40人的老年人中進(jìn)行的[49]，研究表明實(shí)驗(yàn)組人群在服用VE和VA 28-48天后聽力得到了改善。另有一項(xiàng)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在服用VC 8-52周后服藥組的聽力損失要比對照組低約5 dB。Durga等[50]對728名ARHL患者中進(jìn)行了3年的跟蹤試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，服用葉酸組的患者與對照組患者相比，低頻聽力閾值有細(xì)微的差異，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

抗氧化劑治療ARHL真的有效嗎？縱觀近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，雖然大多數(shù)實(shí)驗(yàn)表明，補(bǔ)充抗氧化劑可以有效延緩ARHL的發(fā)展，但仍有部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明抗氧化劑的作用并不顯著。Kashio等[51]的實(shí)驗(yàn)表明，即使給C57BL∕6小鼠補(bǔ)充了抗氧化劑VC，也并沒有在小鼠的耳蝸內(nèi)檢測到VC濃度的提高，也沒有觀察到ARHL的延緩。Bielefeld等[52]設(shè)計(jì)不同劑量的抗氧化劑乙酰肉堿對Fischer 344∕NHsd大鼠進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果證明，乙酰肉堿并不能改善ARHL。Polanski在一項(xiàng)雙盲隨機(jī)臨床試驗(yàn)中，對銀杏干提取物、α-硫辛酸、VC、VE的抗氧化效果進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組人群聽力閾值與安慰劑組的相比并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[53]。分析這些差異的原因，可能與實(shí)驗(yàn)所用模型、抗氧化劑藥物特性、給藥劑量、給藥持續(xù)時(shí)間等都有關(guān)系。

5 總結(jié)與展望

氧化應(yīng)激是大多數(shù)衰老性疾病的共同通路，但其確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。近年來隨著新技術(shù)的出現(xiàn)，基因治療和干細(xì)胞治療發(fā)展勢頭迅猛，基礎(chǔ)的藥物治療研究并沒有太多進(jìn)展，美國NIDCD發(fā)布的2017-2021年工作指南中提出尋找ARHL的發(fā)病機(jī)制仍是未來聽力研究方向的重點(diǎn)。因此探索氧化應(yīng)激通路在ARHL發(fā)病中的明確機(jī)制具有重要意義。