SLC26A4基因突變致前庭水管擴(kuò)大聽力損失機(jī)制的研究進(jìn)展

薛文悅 陳正儂

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

前庭水管擴(kuò)大（Enlarged Vestibular Aqueduct,EVA），又稱為擴(kuò)張型或大前庭水管（Dilated Vestibular Aqueduct,DVA或Large Vestibular Aqueduct,LVA），是一種常染色體隱性遺傳病，也是感音神經(jīng)性聾兒童的一種常見內(nèi)耳畸形。EVA患者聽力下降具有延遲發(fā)作和進(jìn)行性發(fā)展的特點(diǎn)。這一病程發(fā)展特點(diǎn)為預(yù)防或延緩EVA患者聽力損失提供了時(shí)間窗。明確EVA聽力損失的發(fā)生機(jī)制可以幫助我們有針對性地對EVA患者進(jìn)行早期干預(yù)和擬定治療方案，盡可能保護(hù)患者的聽力及語言功能。

1 EVA的臨床表型

1.1 EVA的臨床癥狀

EVA通常是一種非綜合征型耳聾，其主要臨床表現(xiàn)為聽力損失[1]。EVA患者的聽力損失主要為感音神經(jīng)性聾，不同患者間耳聾嚴(yán)重程度不等，同一患者雙耳可出現(xiàn)單側(cè)耳聾或兩側(cè)聽力損失程度不同，其發(fā)生時(shí)間可在語前或伴隨兒童語言發(fā)育的進(jìn)展。在一段時(shí)間內(nèi)，EVA患者的聽力保持波動(dòng)狀態(tài)，并呈整體下降的趨勢，也有一部分患者在很輕的頭部撞擊或氣壓傷后表現(xiàn)為突發(fā)性耳聾[2]。在一些遺傳綜合征患者中也可以發(fā)生EVA，包括伴有耳聾的遠(yuǎn)端腎小管酸中毒綜合征，CHARGE綜合征，Waardenburg綜合征和鰓-腎-腎綜合征，其中最常見是Pendred綜合征。

除了聽力下降以外，部分EVA患者還伴有前庭癥狀。在Zalewski等人對106例平均年齡12歲的EVA患者前庭功能研究中，45%的患者存在前庭癥狀與體征，包括旋轉(zhuǎn)性眩暈史、行為笨拙、語前頭部傾斜及嘔吐史和獨(dú)立行走延遲，但并不是所有具有前庭癥狀與體征的患者都存在前庭檢查結(jié)果異常[3]。

1.2 EVA的影像學(xué)表現(xiàn)

計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）是前庭水管等骨性結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像的最佳影像學(xué)方法。EVA的現(xiàn)代影像學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)為：倒“J”形前庭導(dǎo)水管中點(diǎn)直徑＞1.5mm或總體形態(tài)嚴(yán)重畸形[4]。而正常的前庭水管通常非常狹窄，在CT圖像中幾乎不可見。磁共振（MR）成像可以觀察前庭水管的軟組織和液體內(nèi)容情況：內(nèi)淋巴囊和淋巴管均擴(kuò)大[5]。

1.3 基于EVA臨床表型的致病機(jī)制假設(shè)

根據(jù)EVA相關(guān)的聽力損失具有其獨(dú)特聽力表型，人們提出了許多假設(shè)。較早的假設(shè)認(rèn)為頭部創(chuàng)傷或氣壓傷引起顱內(nèi)壓升高，內(nèi)淋巴囊和導(dǎo)管的內(nèi)容物逆流入中階，損傷毛細(xì)胞，導(dǎo)致聽力下降[2]。然而，無論是內(nèi)淋巴囊切除術(shù)還是內(nèi)淋巴囊減壓術(shù)均不能改善患者聽力，甚至加重了患者聽力損失程度[6]，說明該假設(shè)不成立。

另一種假設(shè)是基于同樣內(nèi)淋巴結(jié)構(gòu)擴(kuò)大的內(nèi)淋巴積水模型，其波動(dòng)性聽力損失與EVA聽力變化存在表型相似性。假設(shè)認(rèn)為內(nèi)淋巴積水增加了內(nèi)淋巴滲透壓，造成耳蝸Reissner氏膜破裂，外淋巴滲入內(nèi)淋巴，引起內(nèi)淋巴成分改變以及毛細(xì)胞受損，出現(xiàn)聽力下降的表現(xiàn)。但這一假設(shè)也被否定了，研究顯示內(nèi)淋巴積水只是細(xì)胞或分子病變的非特異性表現(xiàn)，并不是引起聽力損失的直接原因[7]。

2 EVA致病基因及其功能

2.1 EVA的突變基因

1996年，Griffith等發(fā)現(xiàn)前庭水管擴(kuò)大具有家族聚集傾向[8]。1999年，Abe和Usami等的研究表明前庭水管擴(kuò)大是一種常染色體隱性遺傳性疾病，其發(fā)生與位于7q31的SLC26A4（Gene ID:5172）基因突變有關(guān)[9]。一項(xiàng)大規(guī)模研究顯示由SLC26A4基因突變引起的兒童耳聾約占全球耳聾人口的5%-10%。已報(bào)道的EVA耳聾患者SLC26A4基因的突變率和熱點(diǎn)突變存在著明顯的地域和種族差異。在歐美多中心研究中，1∕4的EVA患者可檢測到SLC26A4雙等位基因突變，另1∕4患者群體存在單等位基因突變，余下的一半患者未檢測到突變[10]。中國人群大前庭水管患者SLC26A4基因的研究顯示，92.1%的EVA患者存在基因的突變[11]。在對中國華東地區(qū)135例非綜合征性EVA耳聾先證者SLC26A4基因篩查，74.07%（100∕135）的患者攜帶有SLC26A4雙等位基因突變，7.41%的（10∕135）的患者攜帶SLC26A4單等位基因突變，而18.52%（25∕135）的患者未檢測到任何SLC26A4基因突變，熱點(diǎn)突變方式為c.919-2A＞G和p.H723R[12]。通過基因檢測結(jié)果與聽力檢查分析可以發(fā)現(xiàn)，與單等位基因突變及無基因突變EVA患者相比，雙等位基因患者雙側(cè)EVA發(fā)生率更高，但聽力損失程度則并不統(tǒng)一。

2.2 SLC26A4表達(dá)產(chǎn)物及其功能

SLC26A4基因含21個(gè)外顯子，開放閱讀框架2343bp，編碼由780個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)，稱為pendrin[13]。Pendrin蛋白是一種跨膜陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，存在12個(gè)及以上跨膜結(jié)構(gòu)域，在上皮細(xì)胞的頂端膜上交換各種陰離子（Cl-和I-）和堿性基團(tuán)（如OH-和HCO3-）[13]，除了在內(nèi)耳、甲狀腺分布外，在腎臟、乳腺[14]、子宮[15]、睪丸、胎盤[16]中均有分布。Wangemann等人的研究顯示在小鼠內(nèi)耳，pendrin分布于耳蝸側(cè)壁外側(cè)螺旋溝的上皮細(xì)胞、螺旋凸的表面上皮細(xì)胞、血管紋的梭形細(xì)胞頂端膜、前庭迷路的過渡細(xì)胞和內(nèi)淋巴囊的富線粒體細(xì)胞中[16]，是Cl-∕HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)體[17]。

Pendrin蛋白在建立聽力的過程中發(fā)揮重要作用。已知Foxi1基因僅對Slc26a4（Gene ID:23985）在內(nèi)淋巴囊和淋巴管的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)Foxi1敲除小鼠存在聽力下降，由此推斷內(nèi)淋巴囊上pendrin表達(dá)對于聽力正常很重要[18]。Nishio等人還發(fā)現(xiàn)若在Slc26a4基因敲除（Slc26a4-∕-）小鼠內(nèi)耳蝸電位成熟前（出生后第6天）再次誘導(dǎo)pendrin表達(dá)，小鼠早期聽力的波動(dòng)情況將得到改善，這提示了pendrin對出生后聽力保持穩(wěn)定有著非常重要的作用[19]。

2.3 用于EVA發(fā)病機(jī)制研究的動(dòng)物模型

三種小鼠模型曾經(jīng)用于EVA發(fā)病機(jī)制研究，包括Slc26a4敲除小鼠（Slc26a4-∕-）[20,21]、Slc26a4敲入小 鼠（Slc26a4tm1Dontuh∕tm1Dontuh）[22]和 ENU 轉(zhuǎn) 基 因 小 鼠（Slc26a4loop∕loop）[23]，三種小鼠模型均能使小鼠內(nèi)耳pendrin表達(dá)不足，前庭水管擴(kuò)大，最終造成聽力不同程度下降。目前對于EVA聽損機(jī)制的研究主要通過Slc26a4敲除小鼠進(jìn)行，這類小鼠的Slc26a4基因外顯子8缺失[21]，形成pendrin截短蛋白，無法發(fā)揮其正常的生理功能，最終出現(xiàn)EVA的病理變化。然而Slc26a4-∕-小鼠模型雖能反映Slc26a4基因突變的內(nèi)耳變化，但其聽力損失的程度較嚴(yán)重、發(fā)展速度較快與人類臨床聽力表型不相符?，F(xiàn)已知Slc26a4在E16.5到P2的表達(dá)對于小鼠出生1個(gè)月內(nèi)形成正常聽力十分必要。Choi等人開發(fā)出一種tet-on系統(tǒng)模型。在這個(gè)模型中，將非基因關(guān)聯(lián)的效應(yīng)子和反應(yīng)子轉(zhuǎn)入Slc26a4-∕-小鼠（Tg[E];Tg[R];Slc26a4-∕-），通過多西環(huán)素誘導(dǎo)來調(diào)控 pendrin蛋白表達(dá)的時(shí)間[24]，使得小鼠聽力更好地模擬EVA相關(guān)聽力損失的聽力表型。近幾年，這個(gè)基于tet-on系統(tǒng)的新模型已開始逐步運(yùn)用到EVA相關(guān)聽力損失的機(jī)制研究中。

3 EVA內(nèi)耳的發(fā)育及聽力損失機(jī)制

EVA的病理變化始于內(nèi)耳胚胎發(fā)育期。內(nèi)耳由外胚層內(nèi)陷分化而來，形成原始聽泡。在胚胎期（E）第9.5天時(shí)小鼠開始形成聽泡，此時(shí)聽泡充滿羊水，其成分與血漿類似。發(fā)育中的上皮細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)容物成分轉(zhuǎn)換的時(shí)間與方式目前尚不清楚[1]。在約E10.5時(shí)聽泡發(fā)出兩處突起，一處逐漸形成耳蝸結(jié)構(gòu)，另一突起則構(gòu)成了內(nèi)淋巴囊，沿蝸軸走行的前庭迷路也在此時(shí)形成。在E14.5小鼠耳蝸管腔形成[25]。

在E11.5時(shí)，正常小鼠內(nèi)淋巴囊中首先出現(xiàn)pendrin表達(dá)，并且其表達(dá)量在E14.5迅速上升。當(dāng)E14.5時(shí)，即Slc26a4-∕-小鼠內(nèi)淋巴囊不能正常表達(dá)pendrin后的第3天，小鼠內(nèi)耳出現(xiàn)第一個(gè)病理變化：內(nèi)淋巴囊和耳蝸管擴(kuò)大[18]。此時(shí)Slc26a4-∕-小鼠耳蝸橫截面積明顯擴(kuò)大，相當(dāng)于正常大小的10倍。小鼠內(nèi)淋巴囊和耳蝸管的形成是前庭迷路液體分泌和內(nèi)淋巴囊液體吸收的共同作用。為了研究Slc26a4-∕-小鼠前庭水管擴(kuò)大究竟是前庭分泌功能亢進(jìn)引起還是內(nèi)淋巴囊吸收障礙導(dǎo)致，Kim等人分別對胚胎期耳蝸進(jìn)行前庭迷路和內(nèi)淋巴囊結(jié)扎。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示pendrin蛋白缺乏的Slc26a4-∕-小鼠蝸管擴(kuò)大程度與內(nèi)淋巴囊結(jié)扎所引起的蝸管擴(kuò)大相類似[25]，提示內(nèi)淋巴的吸收障礙是前庭水管擴(kuò)大的主要原因。而前庭迷路的液體分泌功能僅在胚胎期幫助耳蝸管腔形成，pendrin蛋白對胚胎期前庭迷路液體分泌功能幾乎沒有影響[25]。內(nèi)淋巴囊上皮主要由富含核糖體的細(xì)胞組成，其被富含線粒體的細(xì)胞穿插。富線粒體細(xì)胞頂端膜上存在著質(zhì)子泵和轉(zhuǎn)運(yùn)Cl-∕HCO3-的pendrin蛋白。富核糖體細(xì)胞表達(dá)Na+通道，由H+-ATP酶產(chǎn)生的電流驅(qū)動(dòng)Na+通過Na+通道重吸收。Pendrin蛋白主要將質(zhì)子泵產(chǎn)H+時(shí)分解出的HCO3-排出，而pendrin蛋白缺失會引起富線粒體細(xì)胞內(nèi)HCO3-濃度上升，H+生成受阻，繼而使得Na+重吸收的驅(qū)動(dòng)力降低，影響Na+轉(zhuǎn)運(yùn)，內(nèi)淋巴液中Na+濃度增加，導(dǎo)致內(nèi)淋巴囊液體吸收功能障礙[25]。最終內(nèi)淋巴體系容量增大，耳蝸管腔隨之增大。

在E13.5-16.5時(shí)pendrin逐漸在耳蝸、球囊和橢圓囊上表達(dá)。耳蝸pendrin無表達(dá)后的1-2天，即約E15.5時(shí)，Slc26a4-∕-小鼠出現(xiàn)第二個(gè)病理變化：耳蝸內(nèi)淋巴液發(fā)生酸化[18]。內(nèi)淋巴囊酸化出現(xiàn)稍晚，約E17.5時(shí)出現(xiàn)，提示內(nèi)淋巴對于腔內(nèi)液體具有較強(qiáng)的緩沖能力。內(nèi)淋巴液的pH主要取決于HCO3-與H+分泌以及碳酸酐酶活性。血管紋邊緣細(xì)胞是耳蝸中CO2最主要的來源[26]。血管紋是一種高代謝組織，其呼吸商為1.2，即每消耗1摩爾氧氣將釋放1.2摩爾的CO2[17]。正常情況下，血管紋產(chǎn)生的大量CO2會被螺旋凸分泌的碳酸酐酶分解為H+和HCO3-。另外，螺旋韌帶的纖維細(xì)胞通過Na+-HCO3-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Slc4a7吸收HCO3-并通過縫隙連接向周圍細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。正常情況下，Cl-∕HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)體pendrin蛋白介導(dǎo)血管紋中HCO3-分泌，使內(nèi)淋巴中的HCO3-濃度較外淋巴液高，內(nèi)淋巴液呈堿性。反之，當(dāng)pendrin蛋白缺乏時(shí)，血管紋不能有效地轉(zhuǎn)運(yùn)HCO3-，內(nèi)淋巴液出現(xiàn)酸化[17]。

由于內(nèi)淋巴液酸化，內(nèi)淋巴Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)也會繼發(fā)受到影響。生理?xiàng)l件下，內(nèi)淋巴中的Ca2+濃度為20-30 mol∕L，遠(yuǎn)低于細(xì)胞外液中的Ca2+濃度。內(nèi)淋巴Ca2+濃度過高或過低均會抑制換能電流和微音電位，影響聽覺換能。當(dāng)內(nèi)淋巴酸化時(shí)，酸敏感Ca2+通道Trpv5和Trpv6的重吸收功能會被抑制，造成內(nèi)淋巴液內(nèi)Ca2+濃度上升。生理情況下，通過換能通道進(jìn)入毛細(xì)胞束的大部分Ca2+會通過Ca2+-ATP酶排出[27]。毛細(xì)胞上Ca2+-ATP酶的轉(zhuǎn)運(yùn)功能有限，一旦Ca2+過量流入感覺細(xì)胞就會導(dǎo)致細(xì)胞中 Ca2+超載。毛細(xì)胞 Ca2+超載可能是Slc26a4-∕-小鼠出生后（P）7-15天外毛細(xì)胞變性的原因。聽覺細(xì)胞變性將使得Slc26a4-∕-小鼠，甚至EVA患者，失去了重建聽力的機(jī)會[17]。

小鼠剛出生時(shí)聽覺尚未形成，P10開始小鼠內(nèi)耳逐漸形成穩(wěn)定的內(nèi)耳蝸電位（EP），在P12時(shí)開始建立聽力。Wangemann等人對新生尚未建立聽力的Slc26a4-∕-小鼠進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，在 P10Slc26a4-∕-小鼠內(nèi)淋巴中可檢測微弱的EP,但隨著小鼠進(jìn)一步成長發(fā)育，EP逐漸消失，這與小鼠血管紋Kcnj10的表達(dá)情況相一致[17]。內(nèi)耳蝸電位由血管紋產(chǎn)生，是聽覺換能的主要驅(qū)動(dòng)力[26]。EP本質(zhì)上是K+的平衡電位，通過血管紋中間細(xì)胞頂端膜上K+通道Kcnj10的內(nèi)向整流作用建立[28]。對成年Slc26a4-∕-小鼠進(jìn)行檢測可以發(fā)現(xiàn)其血管紋缺乏Kcnj10蛋白表達(dá)，不能建立正常的EP且聽力喪失[16]，提示由K+通道Kcnj10蛋白表達(dá)下降所引起的EP異常是EVA患者聽力下降的直接原因。

從血管紋的結(jié)構(gòu)入手我們可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前庭水管擴(kuò)大時(shí)，上皮細(xì)胞間以及上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞間的距離延長、疏松，細(xì)胞間的信息通訊將受到影響。細(xì)胞間通訊在耳蝸Corti氏器發(fā)育過程中起著重要的作用，Slc26a4-∕-小鼠血管紋發(fā)育延遲可能也與此有關(guān)[29]。前庭水管擴(kuò)大可能導(dǎo)致細(xì)胞間縫隙連接受損，進(jìn)而引起細(xì)胞信息傳遞異?？赡苁荢lc26a4-∕-小鼠聽力障礙的另一個(gè)原因[25]。

Nishio等人采用tet-on系統(tǒng)模型嘗試在母鼠受孕至E17.5及P6之后兩階段誘導(dǎo)pendrin蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Tg[E];Tg[R];Slc26a4-∕-小鼠出生后 1 個(gè)月是仍保有較穩(wěn)定的EP及較好的聽力[19]，提示pendrin蛋白在小鼠出生后聽力維持中起著重要作用。在小鼠內(nèi)耳血管紋中，pendrin蛋白與Kcnj10蛋白分布在不同的細(xì)胞中，pendrin主要分布在螺旋突起及螺旋外溝的上皮細(xì)胞中，而Kcnj10僅分布于血管紋中間細(xì)胞頂端膜，所以pendrin蛋白表達(dá)缺失并不是Kcnj10蛋白損失的直接原因。在對Slc26a4-∕-小鼠和從交配期到E16.5誘導(dǎo)pendrin表達(dá)的Tg[E];Tg[R];Slc26a4-∕-小鼠的觀察中我們可以發(fā)現(xiàn)雖然二者出生時(shí)聽力程度不同，但在它們的血管紋冰凍切片中均存在中間細(xì)胞的色素沉著較正常小鼠的數(shù)量多、顆粒大[16,30]，這提示了小鼠血管紋中間細(xì)胞存在著氧化應(yīng)激反應(yīng)。Slc26a4-∕-小鼠的內(nèi)耳蛋白檢測發(fā)現(xiàn)小鼠血管紋中氧化蛋白及硝化蛋白含量明顯上升，而其抗氧化的防御機(jī)制則相對減弱[31]，則進(jìn)一步佐證了Slc26a4-/-小鼠內(nèi)耳血管紋氧化應(yīng)激反應(yīng)的存在。

在聽力形成前（P10），Slc26a4-∕-小鼠內(nèi)耳即開始產(chǎn)生自由基應(yīng)激。Slc26a4-∕-小鼠因pendrin蛋白缺乏而引起前庭水管擴(kuò)大和內(nèi)淋巴液酸化都可以促使氧化應(yīng)激發(fā)生。在擴(kuò)大的前庭水管中，為了維持內(nèi)淋巴液正常的離子濃度，血管紋上Na+、K+等離子通道的轉(zhuǎn)運(yùn)速率增快，代謝活動(dòng)增多。酸化的內(nèi)淋巴液活化酸激活Kcnq1通道，進(jìn)一步增加血管紋代謝活動(dòng)[1]，生成大量自由基。當(dāng)自由基產(chǎn)生過多，超過內(nèi)耳的抗氧化防御機(jī)制后，自由基敏感的Kcnj10蛋白就會遭到損壞[31]，Kcnj10蛋白表達(dá)量下降，從而影響EP穩(wěn)態(tài)，聽力出現(xiàn)下降。

4 EVA患者聽力波動(dòng)性下降的機(jī)制探討

如果用Slc26a4-∕-小鼠的觀察結(jié)果來解釋EVA患者波動(dòng)性聽力損失的病因，我們可以確認(rèn)EVA患者聽力波動(dòng)是由于內(nèi)耳蝸電位敏感地隨內(nèi)耳氧化應(yīng)激反應(yīng)變化[30]。內(nèi)耳蝸電位和氧化應(yīng)激組成一個(gè)負(fù)反饋系統(tǒng)，引起聽覺所需的內(nèi)耳蝸電位波動(dòng)變化。這一負(fù)反饋假設(shè)由三個(gè)元素組成。其一，分泌K+時(shí)血管紋邊緣細(xì)胞產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物活性氧（ROS），其二是向邊緣細(xì)胞提供K+以產(chǎn)生內(nèi)耳蝸電位的ROS敏感鉀離子通道KCNJ10；其三是K+誘導(dǎo)的K+分泌[1]。ROS敏感的KCNJ10在ROS作用下表達(dá)減少，正常內(nèi)耳蝸電位和聽力受到破壞。同時(shí)K+流減少，邊緣細(xì)胞K+分泌功能受到限制，其代謝和ROS產(chǎn)生的速率降低。而ROS產(chǎn)量的降低又使得KCNJ10表達(dá)得到部分恢復(fù)，耳蝸內(nèi)耳電位及聽覺也隨之恢復(fù)。但此時(shí)流向邊緣細(xì)胞的K+流再次增加，又會刺激血管紋邊緣細(xì)胞K+分泌，代謝增加和ROS生成增多，KCNJ10蛋白再次受到損傷，在反復(fù)這一循環(huán)的過程中，KCNJ10的表達(dá)不能得到完全的恢復(fù)，總體呈減少的趨勢，直至最終無法形成聽力所需的EP，患者最終聽力喪失。而當(dāng)內(nèi)淋巴Ca2+濃度升高并且毛細(xì)胞Ca2+超載時(shí)則會對患者導(dǎo)致不可逆的聽力損失[17]。

5 總結(jié)與展望

前庭水管擴(kuò)大是兒童感音神經(jīng)性耳聾中相對常見的病因，但目前我們對EVA引起聽力下降的機(jī)制了解還不夠透徹。EVA患者聽力損失的延遲發(fā)作和進(jìn)行性發(fā)展特點(diǎn)，為臨床進(jìn)行干預(yù)以防止或減緩聽力損失進(jìn)展提供了治療時(shí)間窗，尤其對于處于語音習(xí)得階段的嬰幼兒來說至關(guān)重要。小鼠模型的研究表明，內(nèi)耳耳蝸管與內(nèi)淋巴囊增大、內(nèi)淋巴液酸化是聽力喪失發(fā)病機(jī)制中的早期事件。接下來，我們研究聽力損失的機(jī)制應(yīng)集中在耳蝸發(fā)育過程中液體運(yùn)輸和耳蝸外側(cè)壁細(xì)胞和分子功能改變。這些研究的結(jié)果可能會指導(dǎo)制定相應(yīng)的治療方案，以最大限度地保留SLC26A4突變患者的聽力。