慢性鼓膜穿孔動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

姚旭 黎歡 胡益 黃鈞濤 羅琳 沈毅*

1寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院（浙江315211）

2寧波大學(xué)附屬李惠利醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（寧波315040）

鼓膜穿孔（Tympanic membrane perforations,TMP）是耳鼻咽喉科臨床常見(jiàn)疾病，主要病因包括中耳炎癥、外傷以及醫(yī)源性損傷[1-3]。鼓膜之結(jié)構(gòu)分為三層：外側(cè)上皮層，中間纖維組織層，內(nèi)側(cè)黏膜層，其中纖維組織層含有放射形和環(huán)形纖維，對(duì)鼓膜的振動(dòng)傳聲功能起著重要作用，故鼓膜穿孔常導(dǎo)致傳導(dǎo)性聽(tīng)力損失。雖然多數(shù)急性鼓膜穿孔可在數(shù)周內(nèi)自愈，但仍有約20%患者不能愈合，當(dāng)穿孔遷延不愈達(dá)3月以上，可定義為慢性鼓膜穿孔[4,5]。慢性鼓膜穿孔可導(dǎo)致聽(tīng)力下降和中耳反復(fù)溢液，甚至可引發(fā)顳骨內(nèi)外并發(fā)癥（如迷路炎、周?chē)悦姘c和Bezold膿腫等）和顱內(nèi)并發(fā)癥（如硬腦膜外膿腫、乙狀竇血栓性靜脈炎、腦膜炎、腦膿腫和腦疝等）[6,7]，據(jù)報(bào)道死亡率甚至可高達(dá)18.6%[8]。

目前，手術(shù)是慢性鼓膜穿孔的主要治療方式，術(shù)中采用移植物修復(fù)鼓膜，從而重建中耳的傳聲結(jié)構(gòu)。臨床常用的自體移植材料包括顳肌筋膜和軟骨膜，但此類(lèi)材料均存在自身缺陷，如需術(shù)中擴(kuò)大切口以便取材、再次手術(shù)時(shí)難以獲取、延長(zhǎng)手術(shù)時(shí)間、增加手術(shù)費(fèi)用等[9]。近年來(lái)，隨著生物醫(yī)學(xué)和組織工程學(xué)技術(shù)發(fā)展，許多新型生物材料和治療方法不斷被報(bào)道，有望取代常規(guī)手術(shù)。在進(jìn)入臨床使用前，這些新材料和新方法的體內(nèi)安全性及有效性都需行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。但是，目前尚缺乏一種理想的慢性鼓膜穿孔動(dòng)物模型，故許多研究仍然使用急性鼓膜穿孔動(dòng)物模型，而動(dòng)物急性鼓膜穿孔均能在短期內(nèi)迅速自愈，故其不適合用于新材料和新方法臨床前的檢測(cè)[10]。由于缺乏理想的動(dòng)物模型，從而阻礙了慢性鼓膜穿孔治療的新進(jìn)展[11]。近期，一些新型慢性鼓膜穿孔動(dòng)物模型相繼被報(bào)道，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)許多仍為亞急性或延遲愈合的鼓膜穿孔模型[12]。因此，本文將就慢性鼓膜穿孔動(dòng)物模型的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。

1 慢性鼓膜穿孔動(dòng)物模型的造模方法

迄今為止，許多慢性鼓膜穿孔動(dòng)物模型的造模方法已被報(bào)道，這些方法包括化學(xué)方法（如絲裂霉素C、5-氟尿嘧啶和糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物等）、物理方法（如鼓膜熱燒灼法、鼓膜穿孔邊緣內(nèi)折法和鼓膜反復(fù)穿孔法等）、或以上兩種方法的結(jié)合。

1.1 化學(xué)方法

1.1.1 絲裂霉素C

絲裂霉素C是一種抗腫瘤藥物，通過(guò)選擇性阻斷DNA復(fù)制，從而抑制細(xì)胞有絲分裂和蛋白質(zhì)合成。既往研究顯示，鼓膜穿孔后予以局部使用絲裂霉素C可延遲鼓膜穿孔的愈合，平均延遲時(shí)間為44-84天，但不能成功建立慢性鼓膜穿孔動(dòng)物模型。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)絲裂霉素C濃度為0.4 mg/ml時(shí)為抑制鼓膜成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞增殖的最佳劑量，而高濃度絲裂霉素C（2.0 mg/m l）可導(dǎo)致聽(tīng)力受損和耳漏，并且增加絲裂霉素C的使用時(shí)間或次數(shù)對(duì)維持穿孔時(shí)間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Esteban等[13]報(bào)道絲裂霉素C和氫化可的松聯(lián)用8周后穿孔率為62.5%-77.7%，但在他之前，絲裂霉素C聯(lián)用地塞米松或氫化可的松制備慢性鼓膜穿孔動(dòng)物模型的成功率為72%-100%[14,15]。

1.1.2 5-氟尿嘧啶

5-氟尿嘧啶（5-FU）是一種胸苷酸合成酶抑制劑，通過(guò)抑制脫氧胸苷酸合成酶,從而影響DNA合成。5-FU能干擾RNA中蛋白質(zhì)的合成，并能抑制成纖維細(xì)胞增殖和創(chuàng)傷愈合。文獻(xiàn)報(bào)道豚鼠鼓膜穿孔后局部使用濃度為50 mg/ml的5-FU可使穿孔延遲愈合最長(zhǎng)達(dá)3周，但也有學(xué)者使用大鼠動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)相同濃度的5-FU僅可使穿孔維持14.62天。研究顯示單獨(dú)使用5-FU僅能使鼓膜穿孔愈合延遲，故僅適用于慢性鼓膜穿孔動(dòng)物模型制作的輔助手段。

1.1.3 糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物

糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物最早應(yīng)用于皮膚科領(lǐng)域，此類(lèi)藥物可通過(guò)減少表皮和成纖維細(xì)胞復(fù)制，延緩巨噬細(xì)胞趨化性，減少交聯(lián)及細(xì)胞基質(zhì)中重要成分透明質(zhì)酸的合成來(lái)發(fā)揮其作用。Spandow和Hellstrom于1993年首次報(bào)道在SD大鼠鼓膜穿孔處局部使用氫化可的松，12周后鼓膜穿孔率為33.3%。之后此類(lèi)藥物常被單獨(dú)或聯(lián)合使用以制作慢性鼓膜穿孔動(dòng)物模型，其中包括地塞米松、氫化可的松和潑尼松龍等[16]，但研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用潑尼松龍不能使鼓膜延遲愈合。

1.1.4 秋水仙堿

秋水仙堿是一種生物堿，能通過(guò)阻止微管聚合來(lái)抑制有絲分裂，從而使染色體停滯在分裂中期。Haim等[17]報(bào)道，大鼠鼓膜穿孔后予以濃度為0.01%的秋水仙堿液滴耳，最長(zhǎng)僅能使穿孔維持3周左右，且高濃度（＞0.01%）秋水仙堿溶液具有耳毒性風(fēng)險(xiǎn)。

1.1.5 Mensa（2-巰基乙磺酸鈉）

Mensa是一種粘液溶解物質(zhì)，通常用來(lái)預(yù)防某些抗腫瘤藥物引起的尿路上皮損傷。Karli等[18]報(bào)道使用Mensa可延長(zhǎng)鼓膜切開(kāi)術(shù)后穿孔鼓膜的愈合時(shí)間，但最長(zhǎng)僅為7天，故其不適合作為慢性鼓膜穿孔的制作方法。

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1.1.6 戊二醛

戊二醛是一種低毒的有機(jī)化學(xué)溶劑，常用作殺菌消毒劑和防腐劑，可使蛋白質(zhì)變性，并可通過(guò)抑制鼓膜中間纖維層的血管再生來(lái)延緩創(chuàng)傷愈合。曾有學(xué)者用濃度為2%的戊二醛制作狗慢性鼓膜穿孔模型，觀(guān)察15周，其穿孔率為57%[19]，但該動(dòng)物模型之后未見(jiàn)再次報(bào)道，且研究發(fā)現(xiàn)使用戊二醛具有潛在耳毒性風(fēng)險(xiǎn)。

1.2 物理方法

1.2.1 鼓膜熱燒灼法

該方法為對(duì)鼓膜進(jìn)行熱燒灼以制作穿孔，觀(guān)察期內(nèi)如穿孔愈合則再次予以熱燒灼。既往研究報(bào)道顯示該方法的穿孔成功率為69%-83%[20,21]，然而熱燒灼可改變鼓膜的正常結(jié)構(gòu)，并影響后期修復(fù)效果的相關(guān)研究[21]。

1.2.2 鼓膜穿孔邊緣內(nèi)翻法

自Amoils等人首次報(bào)道以來(lái)，該方法一直是最常用的慢性鼓膜穿孔動(dòng)物造模方法，具體為切開(kāi)鼓膜后，對(duì)鼓膜穿孔邊緣的內(nèi)側(cè)面進(jìn)行搔刮，并把穿孔邊緣上皮內(nèi)翻以制作光滑的鼓膜穿孔。既往報(bào)道的成功率為55-100%[22]，但近期Emami等[23]報(bào)道使用該方法制作栗鼠慢性鼓膜穿孔模型，6周后所有栗鼠的穿孔均愈合，且平均愈合時(shí)間為4.8周，這可能與動(dòng)物個(gè)體差異、飼養(yǎng)環(huán)境、手術(shù)器械和實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)水平等因素相關(guān)。該方法缺點(diǎn)包括技術(shù)操作難度較大，有繼發(fā)膽脂瘤風(fēng)險(xiǎn)，不能使用大鼠而僅能使用栗鼠，因后者外耳道短寬且鼓膜面積較大，然而有些國(guó)家例如如澳大利亞禁止飼養(yǎng)栗鼠，故該方法的使用具有一定的局限性[21]。

1.2.3 鼓膜反復(fù)穿孔法

1.2.4 錘骨柄部分切除法

據(jù)報(bào)道，行鼓膜穿孔后，部分切除錘骨柄并聯(lián)用絲裂霉素C，10周后87%的鼓膜穿孔仍存在。但該方法切除了部分錘骨柄，而既往研究早已證實(shí)錘骨柄在鼓膜創(chuàng)傷愈合過(guò)程中起著極其重要的作用，因該部位與鼓環(huán)為鼓膜愈合過(guò)程中干細(xì)胞的增殖區(qū)域，故該方法破壞了鼓膜正常結(jié)構(gòu)，影響鼓膜穿孔愈合過(guò)程，從而不利于后續(xù)的鼓膜修復(fù)研究[25]。

1.2.5 鼓膜通氣管植入法

臨床上，鼓膜通氣管植入常用來(lái)治療保守?zé)o效的分泌性中耳炎，但通氣管長(zhǎng)期植入后有導(dǎo)致患者慢性鼓膜穿孔的風(fēng)險(xiǎn)，據(jù)報(bào)道其發(fā)生率可高達(dá)10-30%[26]。因此，近期Wang等[27]利用鼓膜通氣管植入2周后，局部聯(lián)用絲裂霉素C（0.5 mg/ml）和地塞米松法成功建立了大鼠慢性鼓膜穿孔模型，10周后慢性鼓膜穿孔的造模成功率達(dá)70%。

2 鼓膜穿孔動(dòng)物模型的局限性

綜上所述，單獨(dú)使用化學(xué)藥物如絲裂霉素C、地塞米松、氫化可的松、5-氟尿嘧啶、秋水仙堿或Mensa均只能延長(zhǎng)穿孔愈合時(shí)間，因而不能制作慢性鼓膜穿孔模型。同樣，單獨(dú)使用鼓膜反復(fù)穿孔法非但不能使穿孔延遲愈合，反而會(huì)促進(jìn)鼓膜穿孔愈合。目前報(bào)道成功且具有應(yīng)用價(jià)值的方法包括絲裂霉素C和地塞米松或氫化可的松的聯(lián)用法、穿孔邊緣內(nèi)翻法、鼓膜通氣管植入并聯(lián)用絲裂霉素C和地塞米松法這三種。首先，絲裂霉素C和地塞米松或氫化可的松的聯(lián)用法在絲裂霉素C的濃度、使用時(shí)間和重復(fù)次數(shù)以及地塞米松的使用方法（如局部滴注或明膠海綿浸泡留置）、持續(xù)時(shí)間和重復(fù)次數(shù)等方面均存在爭(zhēng)議，目前尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，仍需后續(xù)進(jìn)一步的研究證實(shí)。其次，鼓膜穿孔邊緣內(nèi)翻法自1992年首次報(bào)道以來(lái)被廣為接受，是目前最為常用的方法，常與鼓膜熱燒灼或反復(fù)穿孔法聯(lián)用，雖然成功率較高，但其操作難度大、對(duì)動(dòng)物種類(lèi)要求高（需選擇栗鼠等較大動(dòng)物），近期也屢被質(zhì)疑，故其不是理想的造模方法。此外，鼓膜通氣管植入并聯(lián)用絲裂霉素C和地塞米松法由Wang等[27]研究者首次報(bào)道，其方法為鼓膜穿孔后留置鼓膜通氣管2周，并在制作穿孔及移除通氣管時(shí)，在穿孔邊緣局部使用地塞米松與絲裂霉素C，觀(guān)察8周后約70%的鼓膜穿孔仍存在。其機(jī)制為大鼠急性鼓膜穿孔通常在5-12天內(nèi)愈合，而通氣管留置2周可有效降低急性穿孔愈合率，絲裂霉素C可抑制細(xì)胞DNA復(fù)制和有絲分裂，地塞米松則可延遲巨噬細(xì)胞趨化及細(xì)胞增殖。雖然其成功率可達(dá)70%，但該方法仍較為繁瑣，而理論上理想的慢性鼓膜穿孔模型制作方法應(yīng)為簡(jiǎn)單實(shí)用且易于推廣，故今后仍需繼續(xù)探索使其更為簡(jiǎn)便有效。

臨床上慢性鼓膜穿孔患者常常伴有咽鼓管功能障礙、耳漏和鼓室黏膜病變，因此制備單一鼓膜穿孔的動(dòng)物模型往往不足以反映臨床患者所有的病理改變。故Peter等[28]使用聽(tīng)泡填塞明膠海綿的方法制作了伴有咽鼓管功能障礙的小鼠慢性鼓膜穿孔模型，為今后制作出與臨床患者更為相近的動(dòng)物模型提供了新思路。此外，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)一些以往報(bào)道為成功的動(dòng)物模型其實(shí)并不是真正意義上的慢性鼓膜穿孔動(dòng)物模型，許多仍為亞急性或愈合延遲的動(dòng)物模型，并且既往研究缺乏耳內(nèi)窺鏡和病理組織學(xué)依據(jù)來(lái)科學(xué)評(píng)價(jià)此類(lèi)動(dòng)物模型，故今后需要更多研究來(lái)對(duì)以往報(bào)道成功的造模方法進(jìn)一步明確[10]。

此外，動(dòng)物種類(lèi)的選擇也極其重要。目前常用的動(dòng)物種類(lèi)包括大鼠、小鼠、豚鼠和栗鼠等，研究者需了解每種動(dòng)物的優(yōu)缺點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)于人類(lèi)鼓膜的解剖結(jié)構(gòu)差異。許多學(xué)者常選用小鼠來(lái)制作鼓膜穿孔模型，但小鼠鼓膜的平均表面積僅為3.9 mm2，與人類(lèi)鼓膜組織（平均表面積65-85 mm2）相比組織太小，因而不易于手術(shù)操作[27]。栗鼠鼓膜的平均表面積為56 mm2，其大小和結(jié)構(gòu)與人類(lèi)鼓膜相似，且栗鼠耳道短、寬、直，故有利于中耳手術(shù)操作[21]，但缺點(diǎn)為購(gòu)買(mǎi)和飼養(yǎng)成本較高，并且澳大利亞等國(guó)家禁止進(jìn)口和飼養(yǎng)栗鼠，因而在這些國(guó)家和地區(qū)便不能開(kāi)展栗鼠的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。大鼠價(jià)格便宜且飼養(yǎng)方便，但其鼓膜組織較?。ㄆ骄砻娣e僅11 mm2），也不利于手術(shù)操作。豚鼠聽(tīng)覺(jué)靈敏，其鼓膜大小和結(jié)構(gòu)與人類(lèi)非常相近，雖然外耳道較彎曲，但因外耳道短，故操作也相對(duì)容易，故適用于鼓膜穿孔模型的制作。狗的鼓膜平均表面積為30-55 mm2，但其外耳道異常彎曲而不適合手術(shù)操作，故近年來(lái)鼓膜相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究極少選用狗。

總之，理想的慢性鼓膜穿孔動(dòng)物模型應(yīng)具備以下特征：①穿孔時(shí)間≥8周，且具備病理組織學(xué)依據(jù)；②造模方法簡(jiǎn)單易學(xué)、微創(chuàng)、可重復(fù)性高、死亡率小、成功率高、無(wú)毒副作用；③動(dòng)物種類(lèi)的選擇應(yīng)是解剖結(jié)構(gòu)最接近人類(lèi)，且易于手術(shù)操作、獲得簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜、易于飼養(yǎng)、對(duì)麻醉藥物有較好的耐受性。

3 展望

雖然既往有許多種類(lèi)的造模方法被報(bào)道，但目前仍缺乏一種真正有效、理想的慢性鼓膜穿孔動(dòng)物模型，從而使得鼓膜穿孔及其修復(fù)再生研究領(lǐng)域的發(fā)展受到限制。一種理想的慢性鼓膜穿孔動(dòng)物模型其穿孔時(shí)間應(yīng)維持在8周以上，并具備病理組織學(xué)依據(jù)，而目前多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的模型并不能完全滿(mǎn)足這些要求，故一些以往較常使用的方法其可靠性現(xiàn)屢被質(zhì)疑。此外，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇應(yīng)當(dāng)價(jià)廉且易于獲取，實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)當(dāng)操作簡(jiǎn)單、可靠性高且易于推廣，這都有待今后的進(jìn)一步研究。