酶法動態(tài)動力學(xué)拆分制備R-(-)-乙?；徛缺馓宜?/h1>
2014-07-05 16:05:30沈薩薩姜靈陸杰于洪巍
化工進展 2014年9期
沈薩薩，姜靈，陸杰，于洪巍
（1江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江 杭州 310028）
酶法動態(tài)動力學(xué)拆分制備R-(-)-乙?；徛缺馓宜?/p>
沈薩薩1，姜靈2，陸杰1，于洪巍2
（1江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江 杭州 310028）
采用假單胞菌脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011催化乙酰基鄰氯扁桃酸進行不對稱水解，利用突變后的扁桃酸消旋酶(V29I)對拆分后的產(chǎn)物S-(-)-鄰氯扁桃酸進行消旋，消旋后的鄰氯扁桃酸經(jīng)過?；匦卤焕玫剿夥磻?yīng)中，實現(xiàn)了酶法動態(tài)動力學(xué)拆分制備R-(-)-乙?；徛缺馓宜?。通過對拆分反應(yīng)、拆分混合物的分離回收以及消旋反應(yīng)的工藝優(yōu)化，最終獲得光學(xué)純度ee>99.9%的R-(-)-乙?；徛缺馓宜幔涫章蔬_80%。本研究建立的R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的動態(tài)動力學(xué)拆分工藝，對其工業(yè)化應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。
酶法動態(tài)動力學(xué)拆分；脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011；扁桃酸消旋酶；乙酰基鄰氯扁桃酸；鄰氯扁桃酸
鄰氯扁桃酸是一種重要的精細化學(xué)品，在醫(yī)藥化學(xué)品領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。其中，R-(-)-鄰氯扁桃酸是合成新型血小板聚集抑制劑氯吡格雷的重要中間體[1-3]。隨著氯吡格雷、鄰氯扁桃酸及其衍生物用途的進一步開發(fā)，R-(-)-鄰氯扁桃酸的需求量日益增加，但由于受到傳統(tǒng)工藝的限制，市場需求難以得到滿足。
目前，R-(-)-鄰氯扁桃酸的制備主要有以下幾種方法。①直接利用不對稱合成或還原的方法制備光學(xué)活性的R-(-)-鄰氯扁桃酸。2009年，Yin等[4]利用金屬釕（Ru）作為催化劑催化不對稱氫化法合成R-(-)-鄰氯扁桃酸甲酯，產(chǎn)物的ee值為92%。但反應(yīng)條件較苛刻，且有毒的重金屬易污染底物。②非對映體鹽結(jié)晶法是目前工業(yè)上應(yīng)用最廣泛的一種拆分技術(shù)。它是利用手性試劑將外消旋體混合物中的兩個對映異構(gòu)體轉(zhuǎn)化成非對映異構(gòu)體，然后利用其物理性質(zhì)的差異將非對映異構(gòu)體分開，從而得到單一異構(gòu)體。但其面臨的共同問題是拆分劑價格昂貴，且有一定的毒性，因此在一定的程度上造成了資源的浪費和環(huán)境的污染。③酶催化拆分方法是利用具有立體選擇性的酶作為催化劑，在此催化劑的作用下，底物的其中一種異構(gòu)體優(yōu)先反應(yīng)，從而達到把兩種對映異構(gòu)體轉(zhuǎn)化成非對映異構(gòu)體，實現(xiàn)拆分的目的。如報道的商品酶CAL-A（Novozym 735）可以水解拆分鄰氯扁桃酸甲酯，產(chǎn)物ee值高達99%以上[5]。但這種方法的理論收率最多50%，造成了資源的浪費。然而動態(tài)動力學(xué)拆分技術(shù)的出現(xiàn)為解決這個問題提出了新的思路。動態(tài)動力學(xué)拆分在動力學(xué)拆分的基礎(chǔ)上添加了反應(yīng)活性較弱的對映體的原位消旋，拆分過程與反應(yīng)活性較弱的對映體原位消旋相繼或同時進行，即某一對映體不斷轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品，而另一對映體則不斷地消旋化補充原料，最終得到理論產(chǎn)率100%的光學(xué)純化合物[6-11]。
目前利用動態(tài)動力學(xué)拆分制備R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬难芯可形匆妶蟮?。如圖1所示，本研究采用假單胞菌脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011催化乙?；徛缺馓宜徇M行不對稱水解，獲得未反應(yīng)的R-(-)-乙?；徛缺馓宜岷彤a(chǎn)物S-(-)-鄰氯扁桃酸[12-13]。R-(-)-乙?；徛缺馓宜峤?jīng)過水解就可獲得R-(-)-鄰氯扁桃酸。同時，利用扁桃酸消旋酶使鄰氯扁桃酸產(chǎn)物消旋化，形成鄰氯扁桃酸消旋體，經(jīng)過乙酰化合成拆分底物乙?；徛缺馓宜幔匦伦鳛樵线M入反應(yīng)體系。因此，通過對乙酰基鄰氯扁桃酸進行動態(tài)動力學(xué)拆分獲得R-(-)-鄰氯扁桃酸前體物是R-(-)-乙?；徛缺馓宜嶂苽涞囊环N有前景的新工藝。
1 材料與方法
1.1 試劑
Pseudomonassp. ECU1011脂肪酶、乙?；徛缺馓宜幔兌葹?9.9%）和扁桃酸消旋酶（突變體V29I）由實驗室制備。R-(-)-乙?；徛缺馓宜岷袜徛缺馓宜幔ㄙ|(zhì)量分數(shù)為99%），由上海精純試劑有限公司購得。氯仿，分析純，購自上海精純試劑有限公司。乙酸乙酯，分析純，購自杭州化工有限公司。其他試劑均為分析純。
圖1 乙?；徛缺馓宜岬膭討B(tài)動力學(xué)拆分
1.2 實驗方法
1.2.1 乙酰基鄰氯扁桃酸的拆分反應(yīng)
配制磷酸緩沖液（200mmol/L，pH=6.2），取10mL置于25mL的錐形瓶中，加入50g/L的脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011凍干粉和20mmol/L的底物乙酰基鄰氯扁桃酸，反應(yīng)體系為密閉體系，將反應(yīng)體系置于45℃，200r/min的恒溫搖床中，反應(yīng)5h，獲得R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬孜锖袜徛缺馓宜岙a(chǎn)物。
1.2.2S-(-)-鄰氯扁桃酸的消旋反應(yīng)
配制磷酸緩沖液（200mmol/L，pH=7.5）和濃度10mmol/L的S-(-)-鄰氯扁桃酸。加入10%的鄰氯扁桃酸消旋酶的酶液，封閉反應(yīng)體系，將反應(yīng)體系置于30℃，200r/min的恒溫搖床中，反應(yīng)3.5h，獲得鄰氯扁桃酸的消旋體。
1.2.3 拆分反應(yīng)后的混合物分離實驗
首先，向拆分反應(yīng)液中加入不同體積的氯仿萃取溶劑，將該密閉體系置30℃，200r/min的恒溫搖床中，萃取30min。通過萃取收率的大小來確定萃取劑的使用量。然后，根據(jù)確定的萃取劑的使用量，分別研究了在20℃、30℃、40℃下，10min、20min、30min、40min、50min時的萃取收率，篩選出最佳萃取溫度和時間。在以上優(yōu)化條件下，本實驗還研究了萃取次數(shù)對萃取效果的影響。每個實驗均設(shè)置3個平行樣，取平均值。
1.2.4 乙酰基鄰氯扁桃酸的DKR反應(yīng)
配制磷酸緩沖液（200mmol/L，pH=6.2），取100mL置于250mL的錐形瓶中，加入50g/L的脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011凍干粉和20mmol/L的底物乙酰基鄰氯扁桃酸，將反應(yīng)體系置于45℃、200r/min的恒溫搖床中，反應(yīng)5h，獲得R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸底物和鄰氯扁桃酸產(chǎn)物。拆分反應(yīng)結(jié)束后，將體系中的酶離心去除，調(diào)節(jié)pH值至7.5，加入10%的鄰氯扁桃酸消旋酶的酶液，將反應(yīng)體系置于30℃、200r/min的恒溫搖床中，反應(yīng)3.5h，獲得鄰氯扁桃酸的消旋體。采用溶劑萃取法將未反應(yīng)的R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸和鄰氯扁桃酸消旋體分離。將鄰氯扁桃酸的消旋體酰化后得到的乙?；徛缺馓宜嶂匦掠糜诓鸱址磻?yīng)。最終實現(xiàn)動態(tài)動力學(xué)拆分的整個過程。
1.3 分析方法
分析方法為液相分析法。液相色譜儀為Agilent 1100 series（美國），AD-H柱（4.6nm×250mm），柱溫保持在25℃，流動相為正己烷和異丙醇，流動相配比為90∶10，流速1mL/min，檢測波長λ=254nm，進樣量保持在20～50μL。在此液相條件下，測得S-(+)-乙酰基鄰氯扁桃酸和R-(-)-乙?；徛缺馓宜?、S-(+)-鄰氯扁桃酸和R-(-)-鄰氯扁桃酸的保留時間分別為7.847min、8.450min、13.234min、14.378min。
底物對映體過量值eeS=(CSR-CSS)/(CSR+CSS)× 100%，產(chǎn)物的對映體過量值eeP=(CPS-CPR)/(CPR+CPS)× 100%，轉(zhuǎn)化率由根據(jù)底物的減少計算而得，式中CSS、CSR、CPR和CPS分別為S-(+)-乙酰基鄰氯扁桃酸、R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸、R-(-)-鄰氯扁桃酸和S-(+)-鄰氯扁桃酸的含量。
2 結(jié)果與討論
2.1 乙?；徛缺馓宜岬牟鸱址磻?yīng)
徐建和課題組[11-12]研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011可以催化乙?；徛缺馓宜岬牟粚ΨQ水解，得到R-(-)-乙?；徛缺馓宜岷彤a(chǎn)物鄰氯扁桃酸。此脂肪酶可以優(yōu)先水解S-(-)-乙?；徛缺馓宜?，并且產(chǎn)物鄰氯扁桃酸的對映體過量值最高可達99%。此反應(yīng)也可同時得到對映體過量值較高的R-(-)-乙?；徛缺馓宜?。在徐建和課題組研究的基礎(chǔ)上，為了獲得高產(chǎn)率的光學(xué)高純度R-(-)-乙?；徛缺馓宜幔瑢χ久复呋鸱址磻?yīng)的條件進行了進一步的優(yōu)化。
2.1.1 拆分反應(yīng)的溫度
為了提高R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬漠a(chǎn)率，對拆分反應(yīng)的溫度進行了進一步的優(yōu)化研究。如圖2所示，在相同反應(yīng)時間內(nèi)，在40℃和45℃反應(yīng)時R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬膃e值較高，消旋效果較好。而反應(yīng)溫度在30℃或55℃時酶活受到溫度的影響，導(dǎo)致R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的對映體過量值明顯偏低。因此進一步對40℃和45℃下的R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬漠a(chǎn)率進行了分析。發(fā)現(xiàn)由于底物自水解的發(fā)生，R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬漠a(chǎn)率隨著反應(yīng)時間的延長而降低，而在45℃的反應(yīng)條件下，反應(yīng)3.5h內(nèi)(R)-乙酰基鄰氯扁桃酸的產(chǎn)率已經(jīng)開始降低，此時R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸對映體過量值還沒有達到理想值。而在溫度為40℃時，自水解比較緩慢，當R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的ee>99%時，R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的水解量還很少，見圖3。綜合考慮拆分反應(yīng)后R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的對映體過量和產(chǎn)率的最優(yōu)值，確定了最佳反應(yīng)溫度為40℃。
圖2 溫度對R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬膶τ丑w過量值的影響
圖3 溫度對R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸產(chǎn)率的影響
表1R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬膶τ丑w過量值和產(chǎn)率隨時間的變化
2.1.2 拆分反應(yīng)時間
拆分反應(yīng)時間對R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬膶τ丑w過量值和產(chǎn)率的影響如表1所示。隨著反應(yīng)時間的增加，(R)-乙酰基鄰氯扁桃酸的對映體過量值也隨之增大，當?shù)孜镛D(zhuǎn)化率超過50%時，eeS>99%。但是隨著反應(yīng)的繼續(xù)進行，底物轉(zhuǎn)化率繼續(xù)升高的同時還伴隨著R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的量逐漸減少。當反應(yīng)時間少于4.25h時，未反應(yīng)的(R)-乙酰基鄰氯扁桃酸的收率基本保持最大收率，但是對映體過量值不高。當反應(yīng)時間大于4.25h時，未反應(yīng)的R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬氖章书_始下降，但其對映體過量值穩(wěn)定在eeS>99.9%。綜合考慮拆分反應(yīng)后R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的對映體過量和收率的最優(yōu)值，確定最佳反應(yīng)時間為4.25h。
綜合考慮以上影響拆分效果的因素，從拆分反應(yīng)中R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬膶τ丑w過量和收率值的角度，確定了拆分反應(yīng)的最佳條件：以20mmol/L乙?；徛缺馓宜嶙鳛椴鸱值孜?，將反應(yīng)體系置于40℃、200r/min的恒溫搖床中，反應(yīng)4.25h。
2.2 鄰氯扁桃酸的消旋反應(yīng)
消旋酶是一種催化底物產(chǎn)生消旋化的酶，它可以將單一的對映體轉(zhuǎn)化為消旋體。本實驗中鄰氯扁桃酸的消旋反應(yīng)就是通過扁桃酸消旋酶催化的。將拆分后產(chǎn)生的鄰氯扁桃酸單一對映體經(jīng)過扁桃酸消旋酶催化產(chǎn)生消旋體鄰氯扁桃酸。得到的消旋體又可經(jīng)過乙?；磻?yīng)轉(zhuǎn)化為拆分底物繼續(xù)進行拆分反應(yīng)。從而在理論上可以使R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬霓D(zhuǎn)化率提高至100%。因此消旋反應(yīng)是動態(tài)動力學(xué)拆分過程中的重要反應(yīng)。為此本實驗對消旋反應(yīng)的條件進行了優(yōu)化，研究了pH值、溫度和鄰氯扁桃酸濃度對消旋反應(yīng)的影響，確定了消旋反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件。
2.2.1 溫度對消旋反應(yīng)的影響
推力桿由推力桿頭、柱管、橡膠襯套總成、彈性擋圈組成，其中橡膠襯套總成由橡膠、銷軸構(gòu)成。平衡懸架中的推力桿結(jié)構(gòu)如圖2所示。
一般情況下，溫度的變化會使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致選擇性和反應(yīng)活性發(fā)生變化，因此必須考察反應(yīng)溫度對消旋反應(yīng)的影響。實驗采用相同反應(yīng)體系，分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的搖床內(nèi)反應(yīng)2h。結(jié)果如圖4所示：鄰氯扁桃酸的轉(zhuǎn)化率隨溫度的升高而逐漸增加，當溫度在25℃～30℃時，消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率達到最高，而隨著溫度的進一步升高，酶活隨著溫度的升高而降低，導(dǎo)致消旋效果進降低，使得消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率減少。因此消旋反應(yīng)的最佳溫度范圍為25～30℃。以下實驗溫度均采用30℃。
圖4 溫度對消旋反應(yīng)的影響
圖5 底物濃度對消旋反應(yīng)的影響
2.2.2 底物濃度對消旋反應(yīng)的影響
配制不同濃度的底物S-鄰氯扁桃酸，在相同的反應(yīng)條件下反應(yīng)2h。結(jié)果如圖5所示：隨著底物濃度的增加，消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率逐漸減少，消旋效果逐漸降低。原因可能是當?shù)孜餄舛冗^高時產(chǎn)生底物抑制效應(yīng)，對酶促反應(yīng)的活性產(chǎn)生了消極影響。雖然當?shù)孜餄舛葹?mmol/L時消旋效果最好，可實際得到的產(chǎn)物太少，不利于實驗檢測和回收純化，因此確定10mmol/L為適宜的底物濃度。
2.2.3 pH值對消旋反應(yīng)的影響
配制不同pH值（6.0～8.0）的緩沖液，在相同反應(yīng)條件下反應(yīng)2h，結(jié)果如圖6所示：隨著反應(yīng)體系pH值的增大，消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率逐漸增加，而當pH=7.5時，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率最大，達到39.4%。但隨著pH值的進一步增加，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率反而下降。當繼續(xù)增加消旋反應(yīng)的時間（從2h延長到8h），使反應(yīng)完全進行，結(jié)果顯示：當pH值在6～7范圍或大于7.5時，都有一定的消旋效果。在pH=7.5時，消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率可達50%，底物幾乎完全消旋。因此，消旋反應(yīng)的最佳pH值為7.5。
圖6 pH值對消旋反應(yīng)的影響
2.2.4 反應(yīng)時間對轉(zhuǎn)化率的影響
綜合以上的各項因素，采用優(yōu)化后的條件進行消旋反應(yīng)，考察了完全反應(yīng)所需要的時間。結(jié)果如圖7所示：隨著反應(yīng)的進行，消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率逐漸增加，當反應(yīng)時間超過3h后，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率接近50%，并且趨于平衡狀態(tài)。因此反應(yīng)3h時，消旋反應(yīng)已經(jīng)進行完全。
2.3 拆分產(chǎn)物的溶劑萃取分離過程
圖7 pH值7.5時，轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)時間的變化
目前對于拆分反應(yīng)后的混合物主要采用柱層析的方法進行分離。但是此方法分離過程繁瑣，分離量較少，經(jīng)濟費用較高，不適合工業(yè)化應(yīng)用。工業(yè)上較常用結(jié)晶和萃取的方法進行分離。從節(jié)約成本和降低耗能的角度，采用溶劑萃取法對乙?；徛缺馓宜岵鸱趾蟮幕旌衔镞M行分離。實驗對萃取劑進行了篩選，然后對R-(-)-乙?；徛缺馓宜彷腿┑氖褂昧?、萃取時的溫度和時間、萃取的次數(shù)進行了研究。
2.3.1 萃取劑的選擇
本研究從幾種實驗室較常用的有機溶劑中選擇合適的萃取劑，采用乙醚、石油醚、正己烷、氯仿、乙酸乙酯作為萃取劑，分別考察了他們的萃取效果。取相同的酶法制備液，在室溫下，分別加入等體積的上述5種有機溶劑進行1次萃取。萃取結(jié)果見表2。結(jié)果表明：石油醚和正己烷對R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸和鄰氯扁桃酸均沒有萃取作用，乙醚和乙酸乙酯對兩種物質(zhì)都有較高的萃取效果，但這兩種有機溶劑無法達到讓兩者分離的效果。只有氯仿能夠有選擇性的萃取R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸，而對鄰氯扁桃酸無萃取效果，因此可以實現(xiàn)前者的有效分離。而乙酸乙酯對兩種物質(zhì)的萃取收率都達到96%以上，因此后續(xù)制備余液中的產(chǎn)物鄰氯扁桃酸可直接用乙酸乙酯萃取回收。為達到兩者的有效分離，首先采用氯仿對酶制備液中的R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸進行萃取分離，再對剩余的余液直接用乙酸乙酯進行萃取，分離回收余液中的鄰氯扁桃酸。
2.3.2 萃取劑用量
表2 不同有機溶劑對R(-)-乙?；徛缺馓宜岷袜徛缺馓宜岬妮腿⌒Ч?/p>
工業(yè)中采用有機溶劑進行萃取時，為了減少有機溶劑的用量，減少環(huán)境污染，降低成本，會采用最優(yōu)的萃取劑量進行萃取，以期獲得最大的經(jīng)濟效益和環(huán)境效益。因此對萃取劑氯仿在萃取過程中的使用量進行了研究。實驗考察了氯仿/制備液體積比在(1∶4) ～(2∶1)（即氯仿量為2.5～20mL）時對R-(-)-乙?；徛缺馓宜彷腿⌒Ч挠绊?，見圖8。結(jié)果表明，當萃取劑氯仿的體積為10～20mL時，對制備液中R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的萃取效果基本保持不變，萃取收率大約在65%。隨著萃取劑體積的增加，萃取收率也不再提高；但萃取劑的體積低于10mL時，由于萃取劑體積比的減小，影響了物質(zhì)在兩相中的分配，導(dǎo)致萃取收率下降。綜合考慮氯仿對R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬妮腿』厥招Ч约斑^程中的能耗，宜選用等體積的氯仿（10mL）進行萃取，在此條件下的萃取收率為65%。
圖8 氯仿用量對R-(-)-乙?；徛缺馓宜彷腿∈章实挠绊?/p>
2.3.3 萃取溫度和時間
萃取過程中溫度的改變會導(dǎo)致萃取物的擴散速度以及在兩相分配系數(shù)的改變，從而使萃取效果受到較大影響；萃取物在兩相中達到一個分配平衡的狀態(tài)需要一定的時間。因此，萃取時需考慮溫度和時間對萃取效果的影響，期望節(jié)約成本和能耗，并獲得最好的萃取收率。由于萃取的制備液中有Pseudomonassp. ECU1011脂肪酶的存在，考慮到在萃取過程中水解仍在緩慢進行，為避免R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的進一步損失，實驗應(yīng)避開酶催化反應(yīng)的最佳溫度（50℃），因此選取20～40℃的溫度范圍進行萃取實驗。溫度以及時間對萃取效果的影響結(jié)果見圖9。結(jié)果表明：隨著萃取溫度的升高，萃取收率也在提高，而40℃時的萃取收率明顯高于其他兩個溫度下的萃取收率。同時隨著時間的延長，同溫度下的萃取收率逐漸提高。當萃取時間超過40min時，萃取效果趨于穩(wěn)定。因此在后續(xù)的實驗中選擇的萃取條件為：溫度40℃，時間40min。
圖9 萃取溫度和時間對R-(-)-乙?；徛缺馓宜彷腿∈章实挠绊?/p>
2.3.4 萃取次數(shù)
根據(jù)前面確定的萃取條件，氯仿對制備液單次萃取時，R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸底物的萃取收率僅為75%，為了進一步提高萃取收率，研究考察了萃取次數(shù)對底物萃取效果的影響。在40℃的實驗溫度下，采用等體積的氯仿進行萃取，每次萃取時間均為40min。萃取次數(shù)對萃取效果的影響結(jié)果見圖10。結(jié)果表明：在相同的條件下，對酶制備液萃取不同次數(shù)后，底物R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的萃取收率最高可達到94%。在第2次萃取后，萃取收率明顯升高；而當萃取次數(shù)大于2次時，萃取收率變化不大。因此，在后續(xù)的實驗中確定適宜的萃取次數(shù)為2次。
綜合考慮以上影響萃取效果的各因素，從節(jié)約成本和降低耗能的角度，確定R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的最優(yōu)萃取條件為：等體積的氯仿進行萃取，萃取溫度為40℃，萃取次數(shù)2次，每次萃取時間均為40min。最終獲得的R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬妮腿∈章蕿?6%。
2.4 產(chǎn)物鄰氯扁桃酸的萃取
圖10 萃取次數(shù)對R-(-)-乙?；徛缺馓宜彷腿∈章实挠绊?/p>
萃取劑篩選實驗證明乙酸乙酯對鄰氯扁桃酸具有很好的分離效果（室溫萃取收率達到96%以上），因此采用等體積的乙酸乙酯直接對剩余液進行萃取?？紤]一次萃取可能無法達到完美的萃取效果，為了進一步提高產(chǎn)物的萃取收率，將萃取次數(shù)提高到2次。最終獲得鄰氯扁桃酸產(chǎn)物的萃取收率為98%。
對溶劑萃取各條件進行優(yōu)化后，進一步考察了萃取過程對酶反應(yīng)混合物的實際分離效果。采用乙酸乙酯直接萃取酶法制備液得到的R-(-)-乙?；徛缺馓宜岷袜徛缺馓宜岬幕旌衔颷圖11(a)]作為對照，在實驗研究的最優(yōu)萃取條件下，通過氯仿萃取得到高純度的R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸底物[圖11(b)]，萃取收率為96%。并通過乙酸乙酯萃取剩余液得到高純度的鄰氯扁桃酸產(chǎn)物[圖11(c)]，萃取收率為98%。用液相色譜分別對3種萃取物進行檢測。結(jié)果表明：采用氯仿和乙酸乙酯依次萃取后，可有效地分離R-(-)-乙?；徛缺馓宜岷袜徛缺馓宜岬幕旌衔?，兩者的純度均達到99.9%。
圖11 液相色譜檢測結(jié)果
采用以上實驗獲得的優(yōu)化條件，最終得到R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬氖章蕿?0%，eeS>99.9%。
3 結(jié) 論
采用動態(tài)動力學(xué)方法對乙酰基鄰氯扁桃酸消旋體進行拆分制備R-(-)-乙?；徛缺馓宜?。為獲得高產(chǎn)率光學(xué)純的R-(-)-乙?；徛缺馓宜?，實驗對拆分反應(yīng)和消旋反應(yīng)過程分別進行了條件優(yōu)化。在此優(yōu)化條件下，乙?；徛缺馓宜嵯w拆分獲得R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬漠a(chǎn)率為47%，對映體過量值ee>99%。將拆分后的混合物通過氯仿和乙酸乙酯進行萃取分離后，將反應(yīng)得到的鄰氯扁桃酸進行消旋化，經(jīng)過3h后就可獲得完全消旋化的鄰氯扁桃酸消旋體。將消旋體鄰氯扁桃酸轉(zhuǎn)化成乙酰基扁桃酸消旋體原料后，繼續(xù)作為原料用于拆分反應(yīng)。反應(yīng)循環(huán)4次，最終得到的R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的收率為80%。此試驗研究打破了傳統(tǒng)動力學(xué)拆分反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)率低的局限，實現(xiàn)了高產(chǎn)率光學(xué)純R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的制備分離過程。
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R-(-)-acetyl-o-mandelic acid preparation via enzymatic dynamic kinetic resolution
SHEN Sasa1，JIANG Ling2，LU Jie1，YU Hongwei2
（1School of Chemical and Material Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China；2School of Chemical and Biological Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310028，Zhejiang，China）
In this study，asymmetric hydrolysis of acetyl chloromandelic acid was catalyzed byPseudomonassp. ECU1011，and theS-(-)-chloromandelic acid in the resolution mixture was then racemerized using the mutated mandelate racemase and fed back into the hydrolysis reaction after acylation，realizing enzymatic dynamic kinetic resolution for preparation ofR-(-)-acetyl chloromandelic acid. Firstly，the conditions for enzymatic resolution，separation of resolution mixture，and enzymatic racemization were optimized. Subsequently，dynamic kinetic resolution of acetyl chloromandelic acid was conducted under the optimal conditions，obtaining optically pureR-(-)-acetyl chloromandelic acid with final yield of 80%. The conditions for enzymatic resolution，chloromandelic acid recycling and racemization were optimized in this study，leading to preliminary establishment of the dynamic kinetic resolution process forR-(-)-acetyl chloromandelic acid preparation，with guiding significance for future industrial applications.
enzymatic dynamic kinetic resolution；Pseudomonassp. ECU1011 lipase；mandelate racemase；R-(-)-acetyl-o-mandelic acid；chloromandelic acid
TQ 463；Q 819
A
1000-6613（2014）09-2425-07
10.3969/j.issn.1000-6613.2014.09.032
2014-01-02；修改稿日期：2014-01-22。
國家自然科學(xué)基金（21176102、21176215、GZ935）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20131100）、江蘇省環(huán)?？蒲姓n題基金（2012004）及浙江省自然科學(xué)基金杰出青年基金（21076181）項目。
沈薩薩（1985—），女，碩士。E-mail sasashen@163.com。聯(lián)系人：陸杰，男，教授，從事結(jié)晶分離和藥物合成等研究。E-mail lujie@jiangnan.edu.cn。
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沈薩薩，姜靈，陸杰，于洪巍
（1江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江 杭州 310028）
酶法動態(tài)動力學(xué)拆分制備R-(-)-乙?；徛缺馓宜?/p>
沈薩薩1，姜靈2，陸杰1，于洪巍2
（1江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江 杭州 310028）
采用假單胞菌脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011催化乙酰基鄰氯扁桃酸進行不對稱水解，利用突變后的扁桃酸消旋酶(V29I)對拆分后的產(chǎn)物S-(-)-鄰氯扁桃酸進行消旋，消旋后的鄰氯扁桃酸經(jīng)過?；匦卤焕玫剿夥磻?yīng)中，實現(xiàn)了酶法動態(tài)動力學(xué)拆分制備R-(-)-乙?；徛缺馓宜?。通過對拆分反應(yīng)、拆分混合物的分離回收以及消旋反應(yīng)的工藝優(yōu)化，最終獲得光學(xué)純度ee>99.9%的R-(-)-乙?；徛缺馓宜幔涫章蔬_80%。本研究建立的R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的動態(tài)動力學(xué)拆分工藝，對其工業(yè)化應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。
酶法動態(tài)動力學(xué)拆分；脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011；扁桃酸消旋酶；乙酰基鄰氯扁桃酸；鄰氯扁桃酸
鄰氯扁桃酸是一種重要的精細化學(xué)品，在醫(yī)藥化學(xué)品領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。其中，R-(-)-鄰氯扁桃酸是合成新型血小板聚集抑制劑氯吡格雷的重要中間體[1-3]。隨著氯吡格雷、鄰氯扁桃酸及其衍生物用途的進一步開發(fā)，R-(-)-鄰氯扁桃酸的需求量日益增加，但由于受到傳統(tǒng)工藝的限制，市場需求難以得到滿足。
目前，R-(-)-鄰氯扁桃酸的制備主要有以下幾種方法。①直接利用不對稱合成或還原的方法制備光學(xué)活性的R-(-)-鄰氯扁桃酸。2009年，Yin等[4]利用金屬釕（Ru）作為催化劑催化不對稱氫化法合成R-(-)-鄰氯扁桃酸甲酯，產(chǎn)物的ee值為92%。但反應(yīng)條件較苛刻，且有毒的重金屬易污染底物。②非對映體鹽結(jié)晶法是目前工業(yè)上應(yīng)用最廣泛的一種拆分技術(shù)。它是利用手性試劑將外消旋體混合物中的兩個對映異構(gòu)體轉(zhuǎn)化成非對映異構(gòu)體，然后利用其物理性質(zhì)的差異將非對映異構(gòu)體分開，從而得到單一異構(gòu)體。但其面臨的共同問題是拆分劑價格昂貴，且有一定的毒性，因此在一定的程度上造成了資源的浪費和環(huán)境的污染。③酶催化拆分方法是利用具有立體選擇性的酶作為催化劑，在此催化劑的作用下，底物的其中一種異構(gòu)體優(yōu)先反應(yīng)，從而達到把兩種對映異構(gòu)體轉(zhuǎn)化成非對映異構(gòu)體，實現(xiàn)拆分的目的。如報道的商品酶CAL-A（Novozym 735）可以水解拆分鄰氯扁桃酸甲酯，產(chǎn)物ee值高達99%以上[5]。但這種方法的理論收率最多50%，造成了資源的浪費。然而動態(tài)動力學(xué)拆分技術(shù)的出現(xiàn)為解決這個問題提出了新的思路。動態(tài)動力學(xué)拆分在動力學(xué)拆分的基礎(chǔ)上添加了反應(yīng)活性較弱的對映體的原位消旋，拆分過程與反應(yīng)活性較弱的對映體原位消旋相繼或同時進行，即某一對映體不斷轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品，而另一對映體則不斷地消旋化補充原料，最終得到理論產(chǎn)率100%的光學(xué)純化合物[6-11]。
目前利用動態(tài)動力學(xué)拆分制備R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬难芯可形匆妶蟮?。如圖1所示，本研究采用假單胞菌脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011催化乙?；徛缺馓宜徇M行不對稱水解，獲得未反應(yīng)的R-(-)-乙?；徛缺馓宜岷彤a(chǎn)物S-(-)-鄰氯扁桃酸[12-13]。R-(-)-乙?；徛缺馓宜峤?jīng)過水解就可獲得R-(-)-鄰氯扁桃酸。同時，利用扁桃酸消旋酶使鄰氯扁桃酸產(chǎn)物消旋化，形成鄰氯扁桃酸消旋體，經(jīng)過乙酰化合成拆分底物乙?；徛缺馓宜幔匦伦鳛樵线M入反應(yīng)體系。因此，通過對乙酰基鄰氯扁桃酸進行動態(tài)動力學(xué)拆分獲得R-(-)-鄰氯扁桃酸前體物是R-(-)-乙?；徛缺馓宜嶂苽涞囊环N有前景的新工藝。
1 材料與方法
1.1 試劑
Pseudomonassp. ECU1011脂肪酶、乙?；徛缺馓宜幔兌葹?9.9%）和扁桃酸消旋酶（突變體V29I）由實驗室制備。R-(-)-乙?；徛缺馓宜岷袜徛缺馓宜幔ㄙ|(zhì)量分數(shù)為99%），由上海精純試劑有限公司購得。氯仿，分析純，購自上海精純試劑有限公司。乙酸乙酯，分析純，購自杭州化工有限公司。其他試劑均為分析純。
圖1 乙?；徛缺馓宜岬膭討B(tài)動力學(xué)拆分
1.2 實驗方法
1.2.1 乙酰基鄰氯扁桃酸的拆分反應(yīng)
配制磷酸緩沖液（200mmol/L，pH=6.2），取10mL置于25mL的錐形瓶中，加入50g/L的脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011凍干粉和20mmol/L的底物乙酰基鄰氯扁桃酸，反應(yīng)體系為密閉體系，將反應(yīng)體系置于45℃，200r/min的恒溫搖床中，反應(yīng)5h，獲得R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬孜锖袜徛缺馓宜岙a(chǎn)物。
1.2.2S-(-)-鄰氯扁桃酸的消旋反應(yīng)
配制磷酸緩沖液（200mmol/L，pH=7.5）和濃度10mmol/L的S-(-)-鄰氯扁桃酸。加入10%的鄰氯扁桃酸消旋酶的酶液，封閉反應(yīng)體系，將反應(yīng)體系置于30℃，200r/min的恒溫搖床中，反應(yīng)3.5h，獲得鄰氯扁桃酸的消旋體。
1.2.3 拆分反應(yīng)后的混合物分離實驗
首先，向拆分反應(yīng)液中加入不同體積的氯仿萃取溶劑，將該密閉體系置30℃，200r/min的恒溫搖床中，萃取30min。通過萃取收率的大小來確定萃取劑的使用量。然后，根據(jù)確定的萃取劑的使用量，分別研究了在20℃、30℃、40℃下，10min、20min、30min、40min、50min時的萃取收率，篩選出最佳萃取溫度和時間。在以上優(yōu)化條件下，本實驗還研究了萃取次數(shù)對萃取效果的影響。每個實驗均設(shè)置3個平行樣，取平均值。
1.2.4 乙酰基鄰氯扁桃酸的DKR反應(yīng)
配制磷酸緩沖液（200mmol/L，pH=6.2），取100mL置于250mL的錐形瓶中，加入50g/L的脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011凍干粉和20mmol/L的底物乙酰基鄰氯扁桃酸，將反應(yīng)體系置于45℃、200r/min的恒溫搖床中，反應(yīng)5h，獲得R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸底物和鄰氯扁桃酸產(chǎn)物。拆分反應(yīng)結(jié)束后，將體系中的酶離心去除，調(diào)節(jié)pH值至7.5，加入10%的鄰氯扁桃酸消旋酶的酶液，將反應(yīng)體系置于30℃、200r/min的恒溫搖床中，反應(yīng)3.5h，獲得鄰氯扁桃酸的消旋體。采用溶劑萃取法將未反應(yīng)的R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸和鄰氯扁桃酸消旋體分離。將鄰氯扁桃酸的消旋體酰化后得到的乙?；徛缺馓宜嶂匦掠糜诓鸱址磻?yīng)。最終實現(xiàn)動態(tài)動力學(xué)拆分的整個過程。
1.3 分析方法
分析方法為液相分析法。液相色譜儀為Agilent 1100 series（美國），AD-H柱（4.6nm×250mm），柱溫保持在25℃，流動相為正己烷和異丙醇，流動相配比為90∶10，流速1mL/min，檢測波長λ=254nm，進樣量保持在20～50μL。在此液相條件下，測得S-(+)-乙酰基鄰氯扁桃酸和R-(-)-乙?；徛缺馓宜?、S-(+)-鄰氯扁桃酸和R-(-)-鄰氯扁桃酸的保留時間分別為7.847min、8.450min、13.234min、14.378min。
底物對映體過量值eeS=(CSR-CSS)/(CSR+CSS)× 100%，產(chǎn)物的對映體過量值eeP=(CPS-CPR)/(CPR+CPS)× 100%，轉(zhuǎn)化率由根據(jù)底物的減少計算而得，式中CSS、CSR、CPR和CPS分別為S-(+)-乙酰基鄰氯扁桃酸、R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸、R-(-)-鄰氯扁桃酸和S-(+)-鄰氯扁桃酸的含量。
2 結(jié)果與討論
2.1 乙?；徛缺馓宜岬牟鸱址磻?yīng)
徐建和課題組[11-12]研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011可以催化乙?；徛缺馓宜岬牟粚ΨQ水解，得到R-(-)-乙?；徛缺馓宜岷彤a(chǎn)物鄰氯扁桃酸。此脂肪酶可以優(yōu)先水解S-(-)-乙?；徛缺馓宜?，并且產(chǎn)物鄰氯扁桃酸的對映體過量值最高可達99%。此反應(yīng)也可同時得到對映體過量值較高的R-(-)-乙?；徛缺馓宜?。在徐建和課題組研究的基礎(chǔ)上，為了獲得高產(chǎn)率的光學(xué)高純度R-(-)-乙?；徛缺馓宜幔瑢χ久复呋鸱址磻?yīng)的條件進行了進一步的優(yōu)化。
2.1.1 拆分反應(yīng)的溫度
為了提高R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬漠a(chǎn)率，對拆分反應(yīng)的溫度進行了進一步的優(yōu)化研究。如圖2所示，在相同反應(yīng)時間內(nèi)，在40℃和45℃反應(yīng)時R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬膃e值較高，消旋效果較好。而反應(yīng)溫度在30℃或55℃時酶活受到溫度的影響，導(dǎo)致R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的對映體過量值明顯偏低。因此進一步對40℃和45℃下的R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬漠a(chǎn)率進行了分析。發(fā)現(xiàn)由于底物自水解的發(fā)生，R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬漠a(chǎn)率隨著反應(yīng)時間的延長而降低，而在45℃的反應(yīng)條件下，反應(yīng)3.5h內(nèi)(R)-乙酰基鄰氯扁桃酸的產(chǎn)率已經(jīng)開始降低，此時R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸對映體過量值還沒有達到理想值。而在溫度為40℃時，自水解比較緩慢，當R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的ee>99%時，R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的水解量還很少，見圖3。綜合考慮拆分反應(yīng)后R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的對映體過量和產(chǎn)率的最優(yōu)值，確定了最佳反應(yīng)溫度為40℃。
圖2 溫度對R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬膶τ丑w過量值的影響
圖3 溫度對R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸產(chǎn)率的影響
表1R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬膶τ丑w過量值和產(chǎn)率隨時間的變化
2.1.2 拆分反應(yīng)時間
拆分反應(yīng)時間對R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬膶τ丑w過量值和產(chǎn)率的影響如表1所示。隨著反應(yīng)時間的增加，(R)-乙酰基鄰氯扁桃酸的對映體過量值也隨之增大，當?shù)孜镛D(zhuǎn)化率超過50%時，eeS>99%。但是隨著反應(yīng)的繼續(xù)進行，底物轉(zhuǎn)化率繼續(xù)升高的同時還伴隨著R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的量逐漸減少。當反應(yīng)時間少于4.25h時，未反應(yīng)的(R)-乙酰基鄰氯扁桃酸的收率基本保持最大收率，但是對映體過量值不高。當反應(yīng)時間大于4.25h時，未反應(yīng)的R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬氖章书_始下降，但其對映體過量值穩(wěn)定在eeS>99.9%。綜合考慮拆分反應(yīng)后R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的對映體過量和收率的最優(yōu)值，確定最佳反應(yīng)時間為4.25h。
綜合考慮以上影響拆分效果的因素，從拆分反應(yīng)中R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬膶τ丑w過量和收率值的角度，確定了拆分反應(yīng)的最佳條件：以20mmol/L乙?；徛缺馓宜嶙鳛椴鸱值孜?，將反應(yīng)體系置于40℃、200r/min的恒溫搖床中，反應(yīng)4.25h。
2.2 鄰氯扁桃酸的消旋反應(yīng)
消旋酶是一種催化底物產(chǎn)生消旋化的酶，它可以將單一的對映體轉(zhuǎn)化為消旋體。本實驗中鄰氯扁桃酸的消旋反應(yīng)就是通過扁桃酸消旋酶催化的。將拆分后產(chǎn)生的鄰氯扁桃酸單一對映體經(jīng)過扁桃酸消旋酶催化產(chǎn)生消旋體鄰氯扁桃酸。得到的消旋體又可經(jīng)過乙?；磻?yīng)轉(zhuǎn)化為拆分底物繼續(xù)進行拆分反應(yīng)。從而在理論上可以使R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬霓D(zhuǎn)化率提高至100%。因此消旋反應(yīng)是動態(tài)動力學(xué)拆分過程中的重要反應(yīng)。為此本實驗對消旋反應(yīng)的條件進行了優(yōu)化，研究了pH值、溫度和鄰氯扁桃酸濃度對消旋反應(yīng)的影響，確定了消旋反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件。
2.2.1 溫度對消旋反應(yīng)的影響
推力桿由推力桿頭、柱管、橡膠襯套總成、彈性擋圈組成，其中橡膠襯套總成由橡膠、銷軸構(gòu)成。平衡懸架中的推力桿結(jié)構(gòu)如圖2所示。
一般情況下，溫度的變化會使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致選擇性和反應(yīng)活性發(fā)生變化，因此必須考察反應(yīng)溫度對消旋反應(yīng)的影響。實驗采用相同反應(yīng)體系，分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的搖床內(nèi)反應(yīng)2h。結(jié)果如圖4所示：鄰氯扁桃酸的轉(zhuǎn)化率隨溫度的升高而逐漸增加，當溫度在25℃～30℃時，消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率達到最高，而隨著溫度的進一步升高，酶活隨著溫度的升高而降低，導(dǎo)致消旋效果進降低，使得消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率減少。因此消旋反應(yīng)的最佳溫度范圍為25～30℃。以下實驗溫度均采用30℃。
圖4 溫度對消旋反應(yīng)的影響
圖5 底物濃度對消旋反應(yīng)的影響
2.2.2 底物濃度對消旋反應(yīng)的影響
配制不同濃度的底物S-鄰氯扁桃酸，在相同的反應(yīng)條件下反應(yīng)2h。結(jié)果如圖5所示：隨著底物濃度的增加，消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率逐漸減少，消旋效果逐漸降低。原因可能是當?shù)孜餄舛冗^高時產(chǎn)生底物抑制效應(yīng)，對酶促反應(yīng)的活性產(chǎn)生了消極影響。雖然當?shù)孜餄舛葹?mmol/L時消旋效果最好，可實際得到的產(chǎn)物太少，不利于實驗檢測和回收純化，因此確定10mmol/L為適宜的底物濃度。
2.2.3 pH值對消旋反應(yīng)的影響
配制不同pH值（6.0～8.0）的緩沖液，在相同反應(yīng)條件下反應(yīng)2h，結(jié)果如圖6所示：隨著反應(yīng)體系pH值的增大，消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率逐漸增加，而當pH=7.5時，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率最大，達到39.4%。但隨著pH值的進一步增加，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率反而下降。當繼續(xù)增加消旋反應(yīng)的時間（從2h延長到8h），使反應(yīng)完全進行，結(jié)果顯示：當pH值在6～7范圍或大于7.5時，都有一定的消旋效果。在pH=7.5時，消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率可達50%，底物幾乎完全消旋。因此，消旋反應(yīng)的最佳pH值為7.5。
圖6 pH值對消旋反應(yīng)的影響
2.2.4 反應(yīng)時間對轉(zhuǎn)化率的影響
綜合以上的各項因素，采用優(yōu)化后的條件進行消旋反應(yīng)，考察了完全反應(yīng)所需要的時間。結(jié)果如圖7所示：隨著反應(yīng)的進行，消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率逐漸增加，當反應(yīng)時間超過3h后，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率接近50%，并且趨于平衡狀態(tài)。因此反應(yīng)3h時，消旋反應(yīng)已經(jīng)進行完全。
2.3 拆分產(chǎn)物的溶劑萃取分離過程
圖7 pH值7.5時，轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)時間的變化
目前對于拆分反應(yīng)后的混合物主要采用柱層析的方法進行分離。但是此方法分離過程繁瑣，分離量較少，經(jīng)濟費用較高，不適合工業(yè)化應(yīng)用。工業(yè)上較常用結(jié)晶和萃取的方法進行分離。從節(jié)約成本和降低耗能的角度，采用溶劑萃取法對乙?；徛缺馓宜岵鸱趾蟮幕旌衔镞M行分離。實驗對萃取劑進行了篩選，然后對R-(-)-乙?；徛缺馓宜彷腿┑氖褂昧?、萃取時的溫度和時間、萃取的次數(shù)進行了研究。
2.3.1 萃取劑的選擇
本研究從幾種實驗室較常用的有機溶劑中選擇合適的萃取劑，采用乙醚、石油醚、正己烷、氯仿、乙酸乙酯作為萃取劑，分別考察了他們的萃取效果。取相同的酶法制備液，在室溫下，分別加入等體積的上述5種有機溶劑進行1次萃取。萃取結(jié)果見表2。結(jié)果表明：石油醚和正己烷對R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸和鄰氯扁桃酸均沒有萃取作用，乙醚和乙酸乙酯對兩種物質(zhì)都有較高的萃取效果，但這兩種有機溶劑無法達到讓兩者分離的效果。只有氯仿能夠有選擇性的萃取R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸，而對鄰氯扁桃酸無萃取效果，因此可以實現(xiàn)前者的有效分離。而乙酸乙酯對兩種物質(zhì)的萃取收率都達到96%以上，因此后續(xù)制備余液中的產(chǎn)物鄰氯扁桃酸可直接用乙酸乙酯萃取回收。為達到兩者的有效分離，首先采用氯仿對酶制備液中的R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸進行萃取分離，再對剩余的余液直接用乙酸乙酯進行萃取，分離回收余液中的鄰氯扁桃酸。
2.3.2 萃取劑用量
表2 不同有機溶劑對R(-)-乙?；徛缺馓宜岷袜徛缺馓宜岬妮腿⌒Ч?/p>
工業(yè)中采用有機溶劑進行萃取時，為了減少有機溶劑的用量，減少環(huán)境污染，降低成本，會采用最優(yōu)的萃取劑量進行萃取，以期獲得最大的經(jīng)濟效益和環(huán)境效益。因此對萃取劑氯仿在萃取過程中的使用量進行了研究。實驗考察了氯仿/制備液體積比在(1∶4) ～(2∶1)（即氯仿量為2.5～20mL）時對R-(-)-乙?；徛缺馓宜彷腿⌒Ч挠绊?，見圖8。結(jié)果表明，當萃取劑氯仿的體積為10～20mL時，對制備液中R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的萃取效果基本保持不變，萃取收率大約在65%。隨著萃取劑體積的增加，萃取收率也不再提高；但萃取劑的體積低于10mL時，由于萃取劑體積比的減小，影響了物質(zhì)在兩相中的分配，導(dǎo)致萃取收率下降。綜合考慮氯仿對R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬妮腿』厥招Ч约斑^程中的能耗，宜選用等體積的氯仿（10mL）進行萃取，在此條件下的萃取收率為65%。
圖8 氯仿用量對R-(-)-乙?；徛缺馓宜彷腿∈章实挠绊?/p>
2.3.3 萃取溫度和時間
萃取過程中溫度的改變會導(dǎo)致萃取物的擴散速度以及在兩相分配系數(shù)的改變，從而使萃取效果受到較大影響；萃取物在兩相中達到一個分配平衡的狀態(tài)需要一定的時間。因此，萃取時需考慮溫度和時間對萃取效果的影響，期望節(jié)約成本和能耗，并獲得最好的萃取收率。由于萃取的制備液中有Pseudomonassp. ECU1011脂肪酶的存在，考慮到在萃取過程中水解仍在緩慢進行，為避免R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的進一步損失，實驗應(yīng)避開酶催化反應(yīng)的最佳溫度（50℃），因此選取20～40℃的溫度范圍進行萃取實驗。溫度以及時間對萃取效果的影響結(jié)果見圖9。結(jié)果表明：隨著萃取溫度的升高，萃取收率也在提高，而40℃時的萃取收率明顯高于其他兩個溫度下的萃取收率。同時隨著時間的延長，同溫度下的萃取收率逐漸提高。當萃取時間超過40min時，萃取效果趨于穩(wěn)定。因此在后續(xù)的實驗中選擇的萃取條件為：溫度40℃，時間40min。
圖9 萃取溫度和時間對R-(-)-乙?；徛缺馓宜彷腿∈章实挠绊?/p>
2.3.4 萃取次數(shù)
根據(jù)前面確定的萃取條件，氯仿對制備液單次萃取時，R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸底物的萃取收率僅為75%，為了進一步提高萃取收率，研究考察了萃取次數(shù)對底物萃取效果的影響。在40℃的實驗溫度下，采用等體積的氯仿進行萃取，每次萃取時間均為40min。萃取次數(shù)對萃取效果的影響結(jié)果見圖10。結(jié)果表明：在相同的條件下，對酶制備液萃取不同次數(shù)后，底物R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的萃取收率最高可達到94%。在第2次萃取后，萃取收率明顯升高；而當萃取次數(shù)大于2次時，萃取收率變化不大。因此，在后續(xù)的實驗中確定適宜的萃取次數(shù)為2次。
綜合考慮以上影響萃取效果的各因素，從節(jié)約成本和降低耗能的角度，確定R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的最優(yōu)萃取條件為：等體積的氯仿進行萃取，萃取溫度為40℃，萃取次數(shù)2次，每次萃取時間均為40min。最終獲得的R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬妮腿∈章蕿?6%。
2.4 產(chǎn)物鄰氯扁桃酸的萃取
圖10 萃取次數(shù)對R-(-)-乙?；徛缺馓宜彷腿∈章实挠绊?/p>
萃取劑篩選實驗證明乙酸乙酯對鄰氯扁桃酸具有很好的分離效果（室溫萃取收率達到96%以上），因此采用等體積的乙酸乙酯直接對剩余液進行萃取?？紤]一次萃取可能無法達到完美的萃取效果，為了進一步提高產(chǎn)物的萃取收率，將萃取次數(shù)提高到2次。最終獲得鄰氯扁桃酸產(chǎn)物的萃取收率為98%。
對溶劑萃取各條件進行優(yōu)化后，進一步考察了萃取過程對酶反應(yīng)混合物的實際分離效果。采用乙酸乙酯直接萃取酶法制備液得到的R-(-)-乙?；徛缺馓宜岷袜徛缺馓宜岬幕旌衔颷圖11(a)]作為對照，在實驗研究的最優(yōu)萃取條件下，通過氯仿萃取得到高純度的R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸底物[圖11(b)]，萃取收率為96%。并通過乙酸乙酯萃取剩余液得到高純度的鄰氯扁桃酸產(chǎn)物[圖11(c)]，萃取收率為98%。用液相色譜分別對3種萃取物進行檢測。結(jié)果表明：采用氯仿和乙酸乙酯依次萃取后，可有效地分離R-(-)-乙?；徛缺馓宜岷袜徛缺馓宜岬幕旌衔?，兩者的純度均達到99.9%。
圖11 液相色譜檢測結(jié)果
采用以上實驗獲得的優(yōu)化條件，最終得到R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬氖章蕿?0%，eeS>99.9%。
3 結(jié) 論
采用動態(tài)動力學(xué)方法對乙酰基鄰氯扁桃酸消旋體進行拆分制備R-(-)-乙?；徛缺馓宜?。為獲得高產(chǎn)率光學(xué)純的R-(-)-乙?；徛缺馓宜?，實驗對拆分反應(yīng)和消旋反應(yīng)過程分別進行了條件優(yōu)化。在此優(yōu)化條件下，乙?；徛缺馓宜嵯w拆分獲得R-(-)-乙?；徛缺馓宜岬漠a(chǎn)率為47%，對映體過量值ee>99%。將拆分后的混合物通過氯仿和乙酸乙酯進行萃取分離后，將反應(yīng)得到的鄰氯扁桃酸進行消旋化，經(jīng)過3h后就可獲得完全消旋化的鄰氯扁桃酸消旋體。將消旋體鄰氯扁桃酸轉(zhuǎn)化成乙酰基扁桃酸消旋體原料后，繼續(xù)作為原料用于拆分反應(yīng)。反應(yīng)循環(huán)4次，最終得到的R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的收率為80%。此試驗研究打破了傳統(tǒng)動力學(xué)拆分反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)率低的局限，實現(xiàn)了高產(chǎn)率光學(xué)純R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的制備分離過程。
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R-(-)-acetyl-o-mandelic acid preparation via enzymatic dynamic kinetic resolution
SHEN Sasa1，JIANG Ling2，LU Jie1，YU Hongwei2
（1School of Chemical and Material Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China；2School of Chemical and Biological Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310028，Zhejiang，China）
In this study，asymmetric hydrolysis of acetyl chloromandelic acid was catalyzed byPseudomonassp. ECU1011，and theS-(-)-chloromandelic acid in the resolution mixture was then racemerized using the mutated mandelate racemase and fed back into the hydrolysis reaction after acylation，realizing enzymatic dynamic kinetic resolution for preparation ofR-(-)-acetyl chloromandelic acid. Firstly，the conditions for enzymatic resolution，separation of resolution mixture，and enzymatic racemization were optimized. Subsequently，dynamic kinetic resolution of acetyl chloromandelic acid was conducted under the optimal conditions，obtaining optically pureR-(-)-acetyl chloromandelic acid with final yield of 80%. The conditions for enzymatic resolution，chloromandelic acid recycling and racemization were optimized in this study，leading to preliminary establishment of the dynamic kinetic resolution process forR-(-)-acetyl chloromandelic acid preparation，with guiding significance for future industrial applications.
enzymatic dynamic kinetic resolution；Pseudomonassp. ECU1011 lipase；mandelate racemase；R-(-)-acetyl-o-mandelic acid；chloromandelic acid
TQ 463；Q 819
A
1000-6613（2014）09-2425-07
10.3969/j.issn.1000-6613.2014.09.032
2014-01-02；修改稿日期：2014-01-22。
國家自然科學(xué)基金（21176102、21176215、GZ935）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20131100）、江蘇省環(huán)?？蒲姓n題基金（2012004）及浙江省自然科學(xué)基金杰出青年基金（21076181）項目。
沈薩薩（1985—），女，碩士。E-mail sasashen@163.com。聯(lián)系人：陸杰，男，教授，從事結(jié)晶分離和藥物合成等研究。E-mail lujie@jiangnan.edu.cn。
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