銅綠假單胞菌注射液對(duì)H22小鼠移植瘤的輔助治療效果*

饒子亮 鄭佳琳 黃 威 王 弋 潘詩(shī)云 黃綺玲 鄺少松

(1. 廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，佛山 528248)(2. 北京萬(wàn)特爾生物制藥有限公司，北京 100000)

銅綠假單胞菌注射液(Pseudomonasaeruginosa-mannosesensitive hemagglutinin，PA-MSHA)是一種細(xì)菌類生物制劑，是以自然界中的銅綠假單胞菌為載體，通過(guò)基因工程技術(shù)表達(dá)出周身密布甘露糖敏感性血凝素菌毛的滅活疫苗(圖1)。在臨床上用于多種惡性腫瘤的輔助治療，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、激活人體免疫反應(yīng)，預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移[1-2]。銅綠假單胞菌注射液作為腫瘤輔助治療藥物，目前聯(lián)合化療的協(xié)同效果缺乏實(shí)驗(yàn)研究。本研究選取了H22小鼠移植瘤，驗(yàn)證銅綠假單胞菌注射液聯(lián)合順鉑或阿霉素化療的輔助作用，為未來(lái)相關(guān)領(lǐng)域的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)條件

SPF級(jí)BALB/c小鼠55只，雄性，體質(zhì)量14.5～16.9 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：[SCXK(粵)2013-0002]，合格證號(hào)：0103987。

小鼠飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室IVC系統(tǒng)內(nèi)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(粵)2013-0002，室內(nèi)保持20～26 ℃，濕度40%～70%，采用10 h∶14 h晝夜間斷照明，自由飲水、進(jìn)食，水料充足，SPF級(jí)飼料產(chǎn)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

1.2 細(xì)胞

H22細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.3 主要試劑和儀器

主要儀器：倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司，型號(hào)：CKX41；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化有限公司，型號(hào)：SW-CJ-2FD；恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司，型號(hào)：HWS-28；低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)：TDL-5-A。

主要試劑：銅綠假單胞菌注射液，由北京萬(wàn)特爾生物制藥有限公司提供；RPMI1640培養(yǎng)基，GIBCO公司生產(chǎn)；新牛血清，GIBCO公司生產(chǎn)；青/鏈霉素雙抗，杭州吉諾生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)；胰酶，杭州吉諾生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)；順鉑，南京制藥廠有限公司生產(chǎn)；鹽酸阿霉素，MBCHEM；生理鹽水，廣東利泰制藥股份有限公司生產(chǎn)。

圖1 銅綠假單胞菌對(duì)H22移植瘤的影響注:A組：空白對(duì)照；B組：銅綠假單胞菌組；C組：聯(lián)合順鉑組；D組：聯(lián)合阿霉素組；E組：順鉑組；F組：阿霉素組Fig.1 Effect of PA-MSHA on H22 transplanted tumorNote: A: blank control； B: Pseudomonas aeruginosa group；C: combined with cisplatin group；D: combined with adriamycin group；E: cisplatin group；F: adriamycin group

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1接種：復(fù)蘇H22細(xì)胞，錐蟲藍(lán)染液染色計(jì)數(shù)，用 PBS配成濃度為1×l07個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，于2只小鼠腹腔注射細(xì)胞懸液0.2 mL/只。7 d后，無(wú)菌取小鼠腹水，以PBS配成濃度為1×l07個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，將檢疫合格的53只BALB/c小鼠先剪去左側(cè)腋下被毛，再用碘酒消毒，每只小鼠左側(cè)腋下注射0.2 mL的H22細(xì)胞懸液，每次注射前需混勻細(xì)胞懸液。

1.4.2分組：待大部分動(dòng)物的腫瘤直徑長(zhǎng)至約5 mm時(shí)，選取較均勻的48只動(dòng)物，按腫瘤體積將小鼠隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照、銅綠假單胞菌組、聯(lián)合順鉑組、聯(lián)合阿霉素組、順鉑組、阿霉素組，8只/組。

1.4.3配制：銅綠假單胞菌注射液直接使用，無(wú)需配制，灌胃給藥前恢復(fù)至室溫；順鉑的配制：準(zhǔn)確吸取1 mL的順鉑注射液，用生理鹽水定容至5 mL；阿霉素的配制：準(zhǔn)確稱取2 mg阿霉素，加入10 mL生理鹽水，混勻。

1.4.4給藥：空白組灌胃給予PBS溶液；銅綠假單胞菌組灌胃給予PA-MSHA(1 000×108個(gè)/mL)溶液；聯(lián)合順鉑組灌胃給予PA-MSHA(1 000×108個(gè)/mL)溶液，同時(shí)腹腔注射順鉑(0.2 mg/mL)；聯(lián)合阿霉素組灌胃給予PA-MSHA(1 000×108個(gè)/mL)溶液，同時(shí)腹腔注射阿霉素(0.2 mg/mL)；順鉑組腹腔注射順鉑(0.2 mg/mL)；阿霉素組腹腔注射阿霉素(0.2 mg/mL)。每天灌胃給藥0.2 mL/10 g，隔天腹腔注射0.1 mL/10 g，連續(xù)給藥14 d。

1.4.5觀察：每天觀察動(dòng)物1次，每周測(cè)量2次動(dòng)物體質(zhì)量；每周測(cè)量2次腫瘤長(zhǎng)短徑，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線；腫瘤體積按公式：V=1/2ab2測(cè)量計(jì)算，a、b分別表示長(zhǎng)和寬；相對(duì)腫瘤增殖率T/C(%)計(jì)算公式如下：T/C%=TRTV/ CRTV×100%。(TRTV：治療組RTV；CRTV：陰性對(duì)照組RTV)。根據(jù)測(cè)量的結(jié)果計(jì)算出相對(duì)腫瘤體積(relative tumor volume，RTV)，計(jì)算公式為：RTV=Vt/ V0。其中V0為分籠給藥時(shí)(即0 d)測(cè)量所得腫瘤體積，Vt為每一次測(cè)量時(shí)的腫瘤體積。

1.4.6實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，完整剝離腫瘤稱重，分組排列照相，計(jì)算腫瘤抑制率：腫瘤生長(zhǎng)抑瘤率(%)=(空白對(duì)照組平均瘤質(zhì)量-治療組平均瘤質(zhì)量)/空白對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 銅綠假單胞菌聯(lián)合化療對(duì)一般臨床表現(xiàn)的影響

接種H22細(xì)胞后第4天，小鼠左背部皮下逐漸長(zhǎng)出腫瘤。各組小鼠口、眼、耳、鼻均未見異常分泌物，精神狀態(tài)正常，大便無(wú)稀爛，尿量未見異常，尿液澄清透明。

2.2 銅綠假單胞菌聯(lián)合化療對(duì)體質(zhì)量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與空白對(duì)照組比較，聯(lián)合順鉑組、聯(lián)合阿霉素組、順鉑組、阿霉素組體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)，銅綠假單胞菌組體質(zhì)量無(wú)顯著性變化(P>0.05)，見表1。

2.3 銅綠假單胞菌聯(lián)合化療對(duì)腫瘤體積的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與空白對(duì)照組比較，聯(lián)合順鉑組、聯(lián)合阿霉素組、順鉑組、阿霉素組的腫瘤體積顯著降低(P<0.05)，銅綠假單胞菌組的腫瘤體積無(wú)顯著性變化(P>0.05)，見表2。

表1 銅綠假單胞菌對(duì)H22移植瘤小鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of PA-MSHA on body weight of H22 transplanted tumor

注：*表示與空白對(duì)照組比較，P<0.05，△表示與順鉑組比較P<0.05，▼表示與阿霉素組比較P<0.05

Note：Compared with blank control group,*P<0.05；Compared with cisplatin group,△P<0.05；Compared with adriamycin group,▼P<0.05

表2 銅綠假單胞菌對(duì)H22移植瘤生長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of PA-MSHA on the growth of H22 transplanted

注：*表示與空白對(duì)照組比較P<0.05，△表示與順鉑組比較P<0.05，▼表示與阿霉素組比較P<0.05

Note：Compared with blank control group,*P<0.05；Compared with cisplatin group,△P<0.05；Compared with adriamycin group,▼P<0.05

2.4 銅綠假單胞菌聯(lián)合化療對(duì)腫瘤質(zhì)量的影響

與空白對(duì)照組比較，聯(lián)合順鉑組、聯(lián)合阿霉素組、順鉑組的腫瘤質(zhì)量顯著降低(P<0.05)，阿霉素組的腫瘤質(zhì)量無(wú)顯著性變化(P>0.05)，見表2和圖1。聯(lián)合順鉑組、順鉑組的抑瘤率為49.2%、46.6%，聯(lián)合阿霉素組、阿霉素組的抑瘤率為32.1%、19.8%，見表2。

2.5 銅綠假單胞菌聯(lián)合化療對(duì)臟器系數(shù)的影響

與空白對(duì)照組比較，聯(lián)合順鉑組、聯(lián)合阿霉素組、順鉑組、阿霉素組的胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)顯著降低(P<0.05)；與順鉑組比較，銅綠假單胞菌組的胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)顯著增加(P<0.05)；與阿霉素組比較，銅綠假單胞菌組的脾臟系數(shù)顯著增加(P<0.05)，見表3。

表3 銅綠假單胞菌對(duì)H22移植瘤小鼠臟器系數(shù)的影響Table 3 Effect of PA-MSHA on organ coefficient of H22 transplanted tumor

注：*表示與空白對(duì)照組比較P<0.05，△表示與順鉑組比較P<0.05，▼表示與阿霉素組比較P<0.05

Note：Compared with blank control group,*P<0.05；Compared with cisplatin group,△P<0.05；Compared with adriamycin group,▼P<0.05

3 討論

人類利用細(xì)菌治療腫瘤已有一百多年的歷史[3]。銅綠假單胞菌注射液是一種通過(guò)基因工程手段制備的銅綠假單胞菌生物制劑[4]，其不僅能有效激活人體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，還能直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[5]，包括胃癌、肝癌、乳腺癌、腸癌、膀胱癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等[6-8]。銅綠假單胞菌注射液是以自然界的綠膿桿菌為載體，通過(guò)基因工程技術(shù)表達(dá)出密布周身甘露糖敏感性(mannose sensitive hemagglutinin，MSHA)菌毛的制劑。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，銅綠假單胞菌注射液是一種免疫增強(qiáng)劑，通過(guò)活化人體的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，從而間接發(fā)揮抗腫瘤和抗感染的作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，其物質(zhì)基礎(chǔ)是銅綠假單胞菌注射液菌毛上的甘露糖結(jié)合蛋白，該蛋白能與腫瘤細(xì)胞表面的甘露糖發(fā)生特異性結(jié)合，并產(chǎn)生兩方面的作用：① 靶向結(jié)合后改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，并誘導(dǎo)其凋亡；② 放大癌細(xì)胞的抗原信號(hào)，以刺激抗原遞呈細(xì)胞，幫助重建免疫監(jiān)視功能，從而阻止腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步播散和轉(zhuǎn)移[8]。進(jìn)一步的機(jī)理研究表明，銅綠假單胞菌注射液特有的MSHA 菌毛通過(guò)甘露糖分子的介導(dǎo)，阻斷細(xì)胞表面EGFR 受體的活化，從而導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡，該理論稱為甘露糖通道途徑[10-13]。

銅綠假單胞菌制劑為我國(guó)學(xué)者自主研發(fā)，國(guó)內(nèi)主要用于惡性腫瘤的輔助治療[14]。但其輔助治療效果如何，目前需要實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的進(jìn)一步支持。本次研究結(jié)果證實(shí)，銅綠假單胞菌注射液(1 000×108個(gè)/mL)對(duì)BALB/c小鼠一般狀態(tài)、體質(zhì)量、腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量無(wú)顯著性影響；對(duì)H22小鼠移植瘤的直接抑制效果不明顯，對(duì)順鉑化療的輔助治療效果不明顯，對(duì)阿霉素化療的輔助治療有一定的增強(qiáng)效果；提高了脾臟系數(shù)，降低了胸腺系數(shù)。本實(shí)驗(yàn)探討了銅綠假單胞菌注射液的輔助抗腫瘤活性，為未來(lái)相關(guān)領(lǐng)域和臨床研究打下了基礎(chǔ)。