響應(yīng)面法優(yōu)化預(yù)處理秸稈糖化條件的研究

■ 王 平 劉夢潔 劉超齊 常 娟 尹清強* 黨曉偉 高天增

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002；2.河南德鄰生物制品有限公司，河南新鄉(xiāng)453000；3.河南廣安生物科技股份有限公司，河南鄭州450001）

秸稈中木質(zhì)纖維素作為結(jié)構(gòu)性碳水化合物，是自然界存在數(shù)量巨大的可再生資源。在我國每年農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量高達7億多噸[1]，農(nóng)作物秸稈資源的不合理利用造成了巨大資源浪費和環(huán)境污染。同時隨著畜牧養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，未來畜牧業(yè)用糧將占據(jù)整個糧食生產(chǎn)的50%[2]，開發(fā)新型碳水化合物原料替代傳統(tǒng)能量原料至關(guān)重要。目前研究不同結(jié)構(gòu)碳水化合物(如非淀粉多糖)的消化代謝利用規(guī)律及合理加工替代傳統(tǒng)的能量原料，是畜牧飼料資源開發(fā)的熱點之一。而有效地將秸稈木質(zhì)纖維素降解成葡萄糖和易消化利用的低分子的碳水化合物進而轉(zhuǎn)化成能量飼料和蛋白質(zhì)飼料等，是制備和生產(chǎn)動物飼料的切入點。這將有助于解決秸稈資源浪費和畜牧生產(chǎn)中飼料短缺問題。

酶解技術(shù)應(yīng)用于秸稈飼料的開發(fā)是最有效、最安全的方法，也是提高秸稈飼料營養(yǎng)價值必不可少的步驟，主要作用是利用纖維素酶和木聚糖酶分解纖維素和半纖維素，轉(zhuǎn)化成葡萄糖和木糖[3]。單獨的酶解處理難以達到理想的效果。在酶解之前，適當(dāng)?shù)奈锢?、化學(xué)預(yù)處理是必需的，進而去除木質(zhì)素，破壞纖維素的結(jié)晶度和聚合度，使長鏈纖維素斷裂成小分子鏈，增加了酶與纖維素和半纖維素的接觸面積，加速酶解速率[4]。而酶解條件同樣是制約糖化效果的重要因素，它包括酶解溫度、pH值、酶解時間、酶負荷量和底物濃度等。為了達到最大的酶解效率和還原糖產(chǎn)量，減少酶的添加量，降低酶解成本，本試驗對預(yù)處理玉米秸稈糖化條件進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 預(yù)處理秸稈制備

試驗取15 g經(jīng)擠壓膨化處理的玉米秸稈裝入500 ml燒杯中，將秸稈按照液固比13∶1混勻，用錫箔紙密封，在1 000 W、80℃的條件下超聲波處理30 min；隨后加入6%石灰(w/w)+2%NaOH(w/w)，在溫度84℃條件下處理6 h。待溫度冷卻至室溫，加入3%雙氧水(V/V)30℃處理4 h。65℃ 烘干，粉碎。

1.1.2 纖維素酶和木聚糖酶

購于山東澤生生物技術(shù)有限公司。根據(jù)美國可再生能源實驗室（NREL）纖維素酶測定方法測定纖維素酶酶活和木聚糖酶酶活。纖維素酶中包括纖維素酶(323 FPU/g)和木聚糖酶(500 U/g)，其蛋白質(zhì)含量為142 mg/g；木聚糖酶中的酶活為5 000 U/g，其蛋白質(zhì)含量為6 mg/g；酶蛋白含量的測定采用Bradford方法[5]。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶的特性分析

1.2.1.1 最適酶解pH值

酶解處理是以5%（w/v）預(yù)處理秸稈加到蒸餾水中，酶負荷量為纖維素酶32.3 FPU/g秸稈 (相當(dāng)于14.2 mg蛋白質(zhì)/g秸稈)和木聚糖酶550 U/g秸稈(相當(dāng)于 0.6 mg蛋白質(zhì)/g秸稈)，用 0.05 mol/l HCl和H2SO4調(diào)整 pH 值至 3.8、4.3、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5，在50℃和180 r/min搖床中酶解48 h，酶解結(jié)束后100℃處理10 min使酶解反應(yīng)終止，酶解產(chǎn)物50℃烘干、粉碎。

1.2.1.2 最適溫度

酶解處理是以5%(w/v）預(yù)處理秸稈加到蒸餾水中，酶負荷量為纖維素酶32.3 FPU/g秸稈 (相當(dāng)于14.2 mg蛋白質(zhì)/g秸稈)和木聚糖酶550 U/g秸稈(相當(dāng)于0.6 mg蛋白質(zhì)/g秸稈)，用0.05 mol/l HCl和H2SO4調(diào)整至最適pH值，分別在30、35、40、45、50 ℃條件下，180 r/min搖床酶解48 h，酶解結(jié)束后100℃處理10 min終止酶解反應(yīng)，酶解產(chǎn)物50℃烘干、粉碎。

1.2.2 最佳酶解條件分析

1.2.2.1 單因素試驗

采用單因素的方法分別對纖維素酶量(0、1.615、3.23、6.46、12.92、19.38、25.84、32.3、38.76、45.22 FPU/g秸稈)和木聚糖酶量(0、2.5、50、100、200、300、400、500、600、700 U/g秸稈)、酶解時間(24、36、48、60、72、84、96、108、120 h)、液固比[4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1、20∶1(ml∶g)]進行分析。

1.2.2.2 最佳酶解條件響應(yīng)面設(shè)計

利用Design-Expert 8.0.5軟件，采用Box-Behnken設(shè)計，進行模型擬合和數(shù)據(jù)分析。響應(yīng)面優(yōu)化基于單因素試驗結(jié)果，各因素選擇范圍為糖化時間72～96 h、液固比 6∶1～10∶1、纖維素酶用量 19.38～32.3 FPU/g秸稈，試驗因素及水平見表1。

表1 試驗設(shè)計因素及編碼水平

為了體現(xiàn)自變量和因變量的關(guān)系，采用二次多項方程進行擬合，預(yù)測二次多項方程形式如下：

式中：Y——秸稈酶解后預(yù)測還原糖含量(mg/g干物質(zhì));

X1、X2、X3——自變量，分別對應(yīng)的糖化時間、液

固比和纖維素酶用量；

β0——截距；

β1、β2、β3——線性系數(shù)；

β11、β22、β33——平方系數(shù)；

β12、β13、β23——交叉系數(shù)。

1.2.3 還原糖測定

取處理后秸稈5.00 g，加入50 ml蒸餾水，浸泡24 h，濾紙過濾，取濾液測還原糖，采用DNS法[6]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel初步整理后，采用SPSS20統(tǒng)計分析軟件對各數(shù)據(jù)進行方差分析和Duncan's法多重比較，差異顯著用P＜0.05表示，所有結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 纖維素酶和木聚糖酶酶學(xué)特性分析(見表2和表3)

表2 不同酶解pH值對秸稈糖化效果的影響

表3 不同酶解溫度對秸稈糖化效果的影響

從表2可知，纖維素酶和木聚糖酶為酸性酶，在pH值為4.3時，還原糖產(chǎn)量最高，且顯著高于其它各組(P＜0.05)。當(dāng)pH值高于4.3時，隨著pH值的升高還原糖產(chǎn)量顯著降低(P＜0.05)。當(dāng)pH值低于4.3時，其糖化秸稈的能力顯著降低(P＜0.05)，當(dāng)pH值為6.5時其糖化秸稈的能力僅為最適pH值的1/3左右。

由表3可知，隨著溫度的增加還原糖產(chǎn)量顯著增加，在50℃時達到最高(P＜0.05)。

2.2 單因素條件對預(yù)處理秸稈糖化效果的影響

2.2.1 不同纖維素酶量對秸稈糖化效果的影響(見表4)

表4 不同纖維素酶量對秸稈糖化效果的影響

由表4可知，隨著纖維素酶量的增加，酶解秸稈還原糖產(chǎn)量顯著增加(P＜0.05)，當(dāng)酶量在25.84 FPU/g秸稈時還原糖產(chǎn)量達到最高(P＜0.05)，隨后再增加酶量酶解還原糖產(chǎn)量變化不顯著(P＞0.05)。所以選擇纖維素酶添加量為19.38、25.84、32.3 FPU/g秸稈進行響應(yīng)面設(shè)計分析。

2.2.2 不同木聚糖酶量對秸稈糖化效果的影響(見表5)

表5 不同木聚糖酶量對秸稈糖化效果的影響

由表5可知，隨著木聚糖酶量的增加酶解還原糖產(chǎn)量增加不顯著(P＞0.05)。其原因為預(yù)處理秸稈中半纖維素含量較低，木聚糖酶對其作用效果不顯著，同時由于纖維素酶中含有一定量的木聚糖酶。綜合考慮以不添加木聚糖酶為宜。

2.2.3 不同酶解液固比對秸稈糖化效果的影響(見表6)

表6 不同酶解液固比對秸稈糖化效果的影響

由表6可知，隨著液固比的增加，還原糖產(chǎn)量在液固比8∶1時達到最高(P＜0.05)；隨后再增加液固比還原糖含量變化不顯著(P＞0.05)；在高于18∶1時，還原糖含量顯著降低(P＜0.05)。所以選擇液固比為6∶1、8∶1、10∶1進行響應(yīng)面設(shè)計分析。

2.2.4 不同酶解時間對秸稈糖化效果的影響(見表7)

表7 不同酶解時間對秸稈糖化效果的影響

由表7可知，隨著酶解時間的增加，還原糖產(chǎn)量顯著增加(P＜0.05)，并且在84 h時達到最高(P＜0.05)，隨后顯著降低(P＜0.05)。所以選擇酶解時間為72、84、96 h進行響應(yīng)面設(shè)計分析。

2.3 最佳糖化條件響應(yīng)面分析

根據(jù)Design Expert 8.0.5軟件中Box-Behnken試驗設(shè)計，設(shè)計了17個試驗點的響應(yīng)面分析試驗，建立響應(yīng)面二次回歸模型，尋求最優(yōu)因素水平，試驗結(jié)果與回歸方程方差分析見表8和表9。

表8 Box-Behnken設(shè)計參數(shù)與響應(yīng)值還原糖含量

Design-Expert 8.0.5對數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，得出回歸方程及方差分析結(jié)果。

表9 響應(yīng)面回歸方程系數(shù)的方差分析

從表9可以看出，上述模型P=0.000 1，表明該模型統(tǒng)計學(xué)上有意義。在顯著水平（P＜0.05）條件下，總還原糖回歸模型中糖化時間X1(P=0.429 8)、液固比X2(P＜0.000 1)、纖維素酶添加量X3(P=0.000 1)，表明液固比和纖維素酶量對響應(yīng)值有顯著影響；X1X3(P=0.008 7)表現(xiàn)顯著，表明酶解時間和纖維素酶添加量之間存在交互作用。失擬項P值為0.642 7＞0.005即方程模型失擬不顯著，說明方程的擬合度較好?；貧w模型的決定系數(shù)為R2=0.972 6＞0.80和 R2adj=0.937 4＞0.80，決定系數(shù)越接近1，說明回歸方程的擬合度越好，可以較好地解釋模型的變化[7-9]。因此，可用該模型對預(yù)處理玉米秸稈糖化效果進行分析和預(yù)測。

基于響應(yīng)面分析，通過軟件模擬尋優(yōu)，當(dāng)酶解條件為：酶解時間82.08 h，液固比10∶1，纖維素酶添加量32.30 FPU/g秸稈(10%)，木聚糖酶量50 U/g秸稈(包含在纖維素酶中)，總還原糖含量最高，預(yù)測結(jié)果為572.77 mg/g干物質(zhì)。

響應(yīng)面圖和對應(yīng)的等值線圖見圖1(A、B、C)，結(jié)合表9，每個3D響應(yīng)面圖表示在其中一個因素在0水平的條件下，另外兩個因素對響應(yīng)值還原糖的影響關(guān)系。

由圖1(A)可以看出，酶解時間與液固比交互作用對還原糖產(chǎn)量影響不顯著。在酶解時間一定，還原糖產(chǎn)量隨液固比的增大而顯著增加，這種趨勢隨著酶解時間的增加而逐漸減??；當(dāng)酶解時間大于82 h時，還原糖產(chǎn)量逐漸降低。

圖1 不同因素響應(yīng)面優(yōu)化趨勢圖

由圖1(B)可以看出，酶解時間和纖維素酶量交互作用對還原糖產(chǎn)量影響顯著。在較短酶解時間內(nèi)，還原糖產(chǎn)量隨纖維素酶量增加而顯著增加，這種趨勢隨著酶解時間的增加而逐漸減??；當(dāng)酶解時間大于82 h時，還原糖產(chǎn)量降低，增加纖維素酶量對還原糖產(chǎn)量無影響。

由圖1(C)可以看出，液固比與纖維素酶量交互作用不顯著。隨著液固比和纖維素酶量的增加還原糖產(chǎn)量顯著增加。

3 討論

3.1 酶學(xué)特性分析

纖維素酶和木聚糖酶在酶解玉米秸稈時作為一種特殊的催化劑，有其特定的pH值和溫度適用范圍。酶解體系pH值對酶反應(yīng)速度的影響尤為明顯。pH值直接或間接影響酶的催化活性。不適當(dāng)?shù)膒H值會使酶活性基團或催化基團解離，造成酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致酶活性喪失，并使底物呈解離狀態(tài)，不能和酶結(jié)合[10]。溫度主要影響酶蛋白的熱變性，在一定范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度的升高酶促反應(yīng)加快；溫度降低，則導(dǎo)致反應(yīng)速度下降，使反應(yīng)時間延長[11]。一般纖維素酶和木聚糖酶的最適pH值為4.0～6.0范圍，溫度范圍為40～60℃[12-13]，酶的最適pH值與酶的來源和性質(zhì)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，該研究所用纖維素酶和木聚糖酶最適pH值為4.3，最適溫度為50℃。

3.2 最佳糖化條件分析

影響秸稈糖化效果的主要因素，除原料和酶自身特性外，還有基質(zhì)濃度、酶量和酶解時間。底物濃度是影響酶水解速率主要因素之一，在低濃度水平，增加基質(zhì)含量能夠提高反應(yīng)速率，增加產(chǎn)物[14]；高濃度基質(zhì)會產(chǎn)生底物抑制作用，從而降低反應(yīng)速率，底物濃度范圍取決于酶量多少[15]。纖維素酶分解纖維素大致可分為三個步驟，首先纖維素酶通過吸附作用吸附到纖維素的表面，分解纖維素轉(zhuǎn)化成糖，然后吸附作用消失。纖維素酶完成這三步之后，其活性減弱，不再具有吸附作用[16]。在一定范圍內(nèi)增加酶載荷量，能夠提高酶解反應(yīng)速率和產(chǎn)物產(chǎn)量，但是酶的成本顯著增加。纖維素酶在短時間內(nèi)反應(yīng)迅速，隨著反應(yīng)時間的增加，產(chǎn)物濃度增加抑制酶反應(yīng)速度，所以足夠的反應(yīng)時間是必須的。

因酶解秸稈時使用酶不同，所以在前人的研究中酶添加量、酶解時間、酶解溫度和pH值均有所不同[17-18]。根據(jù)本研究所選擇的酶，基于響應(yīng)面分析，通過軟件模擬尋優(yōu)，當(dāng)酶解條件為：酶解時間82.08 h、液固比10∶1、纖維素酶量32.30 FPU/g秸稈(10%)，木聚糖酶量50 U/g秸稈（包含在纖維素酶中），總還原糖含量達到最高，預(yù)測結(jié)果為572.77 mg/g干物質(zhì)，與試驗值560.09 mg/g干物質(zhì)基本一致，表明優(yōu)化模型具有較高的可靠性。

Dwyer等(2007)[19]通過HCH-1模型來推測石灰處理秸稈酶解抑制作用，該模型指出石灰處理秸稈酶負荷量為0.25～50 FPU/g，對應(yīng)的底物濃度為10～100 g/l。本研究結(jié)果纖維素酶量為32.30 FPU/g秸稈。Jeoh等(2007)[20]指出，由于預(yù)處理秸稈中殘余的木質(zhì)素存在，纖維素酶在載荷量低于5 FPU/g時，酶解效果較低，其主要原因是纖維素酶會競爭性地吸附在木質(zhì)素上，而纖維素酶這種不可逆的吸附作用，使酶活降低。

4 結(jié)論

通過對纖維素酶和木聚糖酶酶學(xué)特性分析，預(yù)處理秸稈最佳糖化pH值為4.3，最佳溫度為50℃。通過單因素和響應(yīng)面分析，最佳糖化條件為酶解時間82.08 h，液固比10∶1，纖維素酶量32.30 FPU/g秸稈，木聚糖酶量50 U/g秸稈(包含在纖維素酶中)，總還原糖含量最高，預(yù)測結(jié)果為572.77 mg/g干物質(zhì)，與試驗值560.09 mg/g干物質(zhì)基本一致，表明優(yōu)化模型具有較高的可靠性。