PLGF對大鼠坐骨神經(jīng)離斷模型神經(jīng)遠(yuǎn)端恢復(fù)的影響

王婷，于灝，胡昕 ，魏侃，王寧

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院 手外科研究所，遼寧 沈陽 110024；3.手外1科）

外周神經(jīng)損傷病程持久，甚至造成殘疾，大大增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]，對患肢功能影響巨大，因此針對神經(jīng)修復(fù)治療方法的探尋十分重要。本實(shí)驗(yàn)在大鼠坐骨神經(jīng)離斷修復(fù)后，于斷端局部添加外源性PLGF，并以人工神經(jīng)鞘管包饒，創(chuàng)造軸突再生的營養(yǎng)微環(huán)境并減少PLGF向周圍組織浸潤[2]，通過觀察不同時間點(diǎn)遠(yuǎn)端神經(jīng)p75NGFR的表達(dá)及Bungner帶的形成數(shù)量，間接反映雪旺細(xì)胞的增殖及遷移情況，從而評定PLGF在不同時間段對Wallerian變性進(jìn)程的影響程度，以探索神經(jīng)修復(fù)治療的新途徑。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立

SD大鼠18只作為實(shí)驗(yàn)對象，體重200～300 g，由沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。于溫度適宜、食物充足、光照良好的環(huán)境中飼養(yǎng)。所有程序均按照動物倫理審查委員會批準(zhǔn)的協(xié)議進(jìn)行。

術(shù)前配制0.2%氯胺酮和0.2%地西泮混合溶液，按2.5 mL/100 g腹腔注射麻醉。麻醉成功后，取俯臥位于實(shí)驗(yàn)臺上，四肢外展固定，利用眼科剪于雙側(cè)大腿及臀部后側(cè)去毛備皮術(shù)區(qū)，碘酒常規(guī)消毒后鋪孔巾。取大腿背側(cè)縱行切口，銳性切開皮膚后，顯露出股二頭肌及股四頭肌，鈍性分離兩肌肉的肌間隙，小心游離坐骨神經(jīng) 15～20 mm（以便離斷）（圖1a），以坐骨大孔處即閉孔內(nèi)肌近端1 cm平面為離斷界面（圖1b）。

按照 PLGF（SRP4743，Sigma，美國）說明書制備工作液，此前實(shí)驗(yàn)證實(shí)其最適濃度為4 nM[3]。持眼科剪取得人工神經(jīng)鞘管（SSN 5/30，天義福，中國）3 mm，將其夾入之前分裝好實(shí)驗(yàn)濃度PLGF的小管內(nèi)，充分浸濕后備用。因而我們得到4nMⅠ型膠原神經(jīng)鞘管-PLGF復(fù)合物。規(guī)定以大鼠左肢為實(shí)驗(yàn)組，右肢為對照組。對照組用8/0可吸收縫合線作神經(jīng)外膜縫合神經(jīng)，縫合口外包繞并固定神經(jīng)鞘管（Ⅰ型膠原），而后逐層縫合皮膚。實(shí)驗(yàn)組用8/0可吸收縫合線縫合神經(jīng)外膜后，將Ⅰ型膠原神經(jīng)鞘管-PLGF復(fù)合物包繞并固定于神經(jīng)縫合口，逐層縫合肌肉皮膚。本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組采用神經(jīng)鞘管浸潤PLGF后包繞縫合口，以期通過鞘管降解來緩釋PLGF。對照組包繞鞘管為空白對照（圖1c，1d）。

1.2 樣本取材

分別于術(shù)后 1，4，7，15，30 d 各取出兩只大鼠，以空氣栓塞的方法處死，切取雙側(cè)神經(jīng)縫合口遠(yuǎn)端至少2 cm長的坐骨神經(jīng)，予4%多聚甲醛中浸泡固定，沿神經(jīng)長軸包埋并切片。

1.3 免疫組化染色

經(jīng)脫蠟水化后，經(jīng)0.01 M的PBS清洗后，正常兔血清封閉30 min后傾掉，加入p75 NGFR重組抗體（EP1039Y，Abcam，美國），在 4℃環(huán)境下孵育過夜，第2天經(jīng)0.01 M的PBS清洗，滴加兔IgG（SA1022，博士德，中國），室溫封閉30 min后再以經(jīng)0.01 M的PBS清洗。加入新鮮DAB工作液濕盒封閉，于鏡下監(jiān)測到合適顯色后水洗，再入蘇木素復(fù)染后水洗，最后入酸乙醇分化后水洗，脫水封片。

1.4 組織學(xué)評價

應(yīng)用ImageProPlus6.0分析上述切片p75NGFR免疫組化陽性程度及Bungner帶數(shù)量。以平均光密度值Density(mean)表達(dá)免疫組化陽性程度；以3～5個連成一線的細(xì)胞核作為Bungner帶來計數(shù)。每張切片均于高倍視野下（×200）下隨機(jī)取三個視野進(jìn)行分析計算，數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來表達(dá)，利用SPSS 19.0軟件做同一時間點(diǎn)下實(shí)驗(yàn)組與對照組的成對單側(cè)t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p75NGFR免疫組化表達(dá)

p75NGFR免疫組化表達(dá)見圖2。p75 NGFR在視野中表達(dá)的面積（area）和IOD分別測定值見表1。

分別計算兩組每個時間點(diǎn)p75 NGFR的Density(mean)值。結(jié)果及趨勢變化見圖3，可見大鼠坐骨神經(jīng)離斷后對照組遠(yuǎn)端p75 NGFR的表達(dá)隨時間推移而增加，4 d后其表達(dá)進(jìn)入平臺期，15 d后表達(dá)逐漸下降；而實(shí)驗(yàn)組較對照組p75 NGFR的表達(dá)在術(shù)后24 h時間點(diǎn)顯著增加，而后其表達(dá)趨勢與對照組相似，30 d時表達(dá)雖有下降，但仍顯著高于對照組。

圖1 手術(shù)操作示意圖

2.2 Bungner帶計數(shù)

在術(shù)后1 d的時間點(diǎn)中我們觀察到Bungner帶并未廣泛形成，應(yīng)該尚處在形成過程中。離斷神經(jīng)遠(yuǎn)端雪旺細(xì)胞雖未明顯增殖，但實(shí)驗(yàn)組較對照組有多處3～5個細(xì)胞核成行排列（圖2a1，a2）。統(tǒng)計實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞核排列成行數(shù)量情況，可見實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組（圖4）。

3 討論

在神經(jīng)損傷后神經(jīng)遠(yuǎn)端發(fā)生Wallerian變性，這個過程中雪旺細(xì)胞激活并表達(dá)p75NGFR，經(jīng)歷去分化、增殖，并遷移形成Bungner帶是關(guān)鍵步驟。PLGF可以增加包括雪旺細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的遷移能力[3-6]，而Wallerian變性時雪旺細(xì)胞表達(dá)PLGF可促進(jìn)自身的增殖[7]，因此我們在離斷神經(jīng)縫合口添加外源性PLGF并通過與空白對照組比較，觀察不同時間點(diǎn)神經(jīng)遠(yuǎn)端p75 NGFR的免疫組化陽性的表達(dá)程度以及Bungner帶形成數(shù)量，反映其對受損神經(jīng)Wallerian變性進(jìn)程的影響。

本實(shí)驗(yàn)中在大鼠坐骨神經(jīng)離斷后，對照組遠(yuǎn)端p75 NGFR的表達(dá)隨時間推移而增加，4 d后其表達(dá)進(jìn)入平臺期，15 d后表達(dá)逐漸下降（圖3），這與其他學(xué)者的研究結(jié)果相似，有學(xué)者認(rèn)為在神經(jīng)損傷后神經(jīng)因子及其受體會有一個快速而短暫的的上調(diào)期，在一個月或更長時間以后回歸基線水平[8]，Heng Shao等[9]則證實(shí)損傷神經(jīng)遠(yuǎn)端的p75 NGFR強(qiáng)染色可持續(xù)14 d，而在28 d以后p75 NGFR的表達(dá)在細(xì)胞成分中明顯下降。然而在本研究中通過觀察實(shí)驗(yàn)組，我們發(fā)現(xiàn)p75 NGFR的表達(dá)在24 h時間點(diǎn)較對照組顯著增加，而后其表達(dá)趨勢與對照組相似，30 d時表達(dá)雖有下降，但仍顯著高于對照組（圖3），這說明在Wallerian變性中添加外源性PLGF具有促進(jìn)p75 NGFR表達(dá)的作用，而該促進(jìn)作用有可能由于外源性PLGF促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖及促進(jìn)雪旺細(xì)胞高表達(dá)p75 NGFR引起。

圖2 大鼠坐骨神經(jīng)p75NGFR免疫組化染色（200×鏡下觀）

圖3 p75 NGFR不同時間點(diǎn)表達(dá)情況(*P＜0.05）

有學(xué)者報道神經(jīng)損傷3 d后去分化的雪旺細(xì)胞大量增殖并在基膜管內(nèi)形成Bungner帶[10]，從而為軸突再生提供引導(dǎo)路徑。因此本實(shí)驗(yàn)中我們欲計數(shù)各時間點(diǎn)Bungner帶并進(jìn)行組間對比，但在神經(jīng)損傷4 d以后的各時間點(diǎn)雪旺細(xì)胞高度增殖無法確切計數(shù)，而在神經(jīng)損傷后1 d的時間點(diǎn)中我們觀察到離斷神經(jīng)遠(yuǎn)端雪旺細(xì)胞雖未明顯增殖，但有多處3～5個細(xì)胞核成行排列（圖2a1）且實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核排列成行的數(shù)量顯著高于對照組。但此時Bungner帶并未廣泛形成，應(yīng)該尚處在形成過程中。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示外源性PLGF可以促進(jìn)雪旺細(xì)胞成行排列，考慮到Bungner帶的形成不僅單純是雪旺細(xì)胞增殖的結(jié)果，通過細(xì)胞遷移才能成行排列從而形成Bungner帶。因此我們推測外源性PLGF具有縮短Bungner帶形成時間且促進(jìn)Bungner帶形成數(shù)量的效應(yīng)。而該效應(yīng)主要通過促進(jìn)雪旺細(xì)胞遷移來完成。

表1 大鼠坐骨神經(jīng)p75 NGFR免疫組化結(jié)果（±s）

表1 大鼠坐骨神經(jīng)p75 NGFR免疫組化結(jié)果（±s）

注：實(shí)驗(yàn)組與對照組同一時間點(diǎn)p75 NGFR平均光密度值比較 *P＜0.05

時間（d） 面積(um2） IOD IOD/面積Density(mean)實(shí)驗(yàn)組 1 1115,048±109,573 9,466± 1,948 0.0086±0.0025*1,040,745±150,877 16,413± 6,486 0.0165±0.0086 15 1,108,992± 21,734 51,252±18,197 0.0461±0.0160 30 1,185,940± 58,788 24,428± 6,586 0.0205±0.0048*對照組 1 1,123,068±160,163 3,441± 3,207 0.0029±0.0025 4 957,977±119,385 30,867±19,142 0.0310±0.0155 7 929,473±103,460 10,801± 871 0.0116±0.0004 15 1,221,232± 3,521 30,219±20,459 0.0247±0.0167 30 1,222,087± 2,301 7,745± 5,403 0.0063±0.0044 4 764,772±172,577 17,293± 8,140 0.0217±0.0070 7

圖4 1 d時間點(diǎn)下實(shí)驗(yàn)組與對照組bungner帶計數(shù)比較（*P＜0.05）

本研究采用外源性PLGF應(yīng)用于大鼠離斷坐骨神經(jīng)的縫合口，其可促進(jìn)神經(jīng)遠(yuǎn)端p75 NGFR高表達(dá)，可促進(jìn)神經(jīng)再生雪旺細(xì)胞成行排列，間接反映出外源性PLGF可促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖及遷移，縮短Bungner帶形成時間，增加Bungner帶形成數(shù)量，結(jié)果證實(shí)外源性PLGF對于神經(jīng)損傷修復(fù)具有積極作用，為進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)再生及修復(fù)神經(jīng)缺損提供一個新的思路。