閏盤蛋白在心律失常中的研究

陳奕帆 李學文

閏盤作為一個復雜的蛋白網(wǎng)，參與心肌肥大、心肌纖維化、心肌重構和心肌傳導等多種病理生理過程。研究表明，閏盤連接成分的突變和缺失常常引起閏盤結構的紊亂和致死性心肌損傷[1]。在心肌細胞的多種病理狀態(tài)下，閏盤蛋白的改變及不同閏盤蛋白之間的相互作用與心律失常的發(fā)生息息相關?，F(xiàn)就閏盤蛋白及其相互作用與心律失常的關系進行綜述。

1 閏盤蛋白

閏盤包括三種主要結構：橋粒連接、黏著連接(AJs)和縫隙連接(GJs)[2]。其中橋粒連接主要參與細胞的錨定支撐，黏著連接主要參與細胞的支架黏附作用，縫隙連接主要參與細胞之間信號轉(zhuǎn)導和物質(zhì)交換作用。

橋粒連接包含兩個部分，在細胞間的部分由跨膜蛋白構成，包括橋粒芯蛋白(DSG)和橋粒膠蛋白(DSC)，它們使得橋粒對細胞骨架的支撐作用較黏著連接更強。附著于跨膜蛋白上的部分為黏附蛋白，其主要包括斑珠蛋白(PKG)、橋粒斑蛋白(DSP)和新斑蛋白-2(PKP2)，它們平衡細胞間的收縮壓力和摩擦力，避免細胞損傷，并把肌間線蛋白連接到橋粒上。

黏著連接是肌原纖維的錨定點，可傳導細胞間的機械力[3]。黏著連接主要包括斑珠蛋白、連鎖蛋白(a-連鎖蛋白、β-連鎖蛋白、P-120)、黏著斑蛋白(Vcl)、a-輔肌動蛋白(a-actinin)。其中a-連鎖蛋白與肌原纖維肌球蛋白的微絲相連，通過β-連鎖蛋白和P-120再與胞外N-鈣黏蛋白部分相連。黏著斑蛋白是細胞基質(zhì)和細胞間與肌動蛋白結合的膜蛋白，除了把β-連鎖蛋白連接到肌動蛋白上，a-連鎖蛋白還錨定和組裝肌動蛋白骨架到細胞膜上[4]。

縫隙連接是包含細胞間通道的特殊膜區(qū)域，它包括多種縫隙蛋白(CX)及相關連接蛋白如緊密連接蛋白1(ZO-1)、N-鈣黏蛋白、周圍連接等[5]?？p隙連接主要由12個連接蛋白組成的兩個六聚體在細胞間相互對接形成。在心肌細胞中CX43是縫隙連接的主要成分，不僅存在于細胞膜表面也存在于線粒體中，參與心肌細胞間<1 000Da小分子(如離子、氨基酸、核苷、代謝分子、第二信使)的運輸、電偶聯(lián)以及信號轉(zhuǎn)導[6]。周圍連接主要位于神經(jīng)元閏盤上，它與CX43相鄰并列于基膜上參與神經(jīng)元間的接觸傳導，具有延展性和離子通透性[7]。在心房傳導阻滯中，周圍連接的延伸和寬度與心律失常的嚴重程度密切相關。N-鈣黏蛋白是單獨跨膜的鈣依賴性黏附蛋白，通過把CX43錨定到閏盤上參與閏盤通道的形成[8]。

此外，與閏盤相關的其他重要結構還包括離子通道、錨蛋白-G(Ank-G)等。閏盤中的離子通道主要分三類：電壓門控鉀通道(Kv通道)、ATP依耐性鉀通道(Kir通道)、電壓門控鈉通道(Nav通道 )。心臟中的鈉通道包括Nav1.3、Nav1.5，其中Nav1.5(電壓門控鈉通道)在動作電位快速上升期起重要作用。錨蛋白包括錨蛋白-G和錨蛋白-B，錨蛋白-B主要存在于T管中，而錨蛋白-G主要存在于閏盤中。

2 閏盤蛋白與心律失常

2.1橋粒連接

研究表明，約有一半的致右室心律失常疾病有橋粒黏附蛋白的基因突變,包括斑珠蛋白、新斑蛋白-2的基因突變。致心律失常右室心肌病(ARVC)特征是右室游離壁中纖維細胞和脂肪細胞替代心肌細胞并頻發(fā)致命性心律失常甚至發(fā)生心源性猝死。參與ARVC發(fā)生的橋粒突變基因包括PKP2、DSP、DSG2、DSC2、PKG等[9]。有研究報道，常染色體隱形遺傳性ARVC中Carvajar綜合征和Naxos綜合征分別與橋粒斑蛋白基因缺失和斑珠蛋白基因JUP的缺失有關[10]。Mazurek等[11]發(fā)現(xiàn)經(jīng)MHC-miR130a轉(zhuǎn)染的小鼠在出現(xiàn)心室功能異常之前即出現(xiàn)CX43和橋粒膠蛋白-2(DSC2)的表達下降，這表明DSC2減少在增加心肌的纖維化和脂質(zhì)沉積并促發(fā)右室擴張和室性心律失常中發(fā)揮作用。另外，橋粒與黏著連接共同維持細胞的機械性支撐和心肌完整性作用。實驗發(fā)現(xiàn)，當新斑蛋白2表達下降時也會降低縫隙連接的表達，改變心肌鈉電流的幅度和動能，從而在解剖學異常處形成渦流、波裂和回旋，并最終引發(fā)折返性沖動[12]。Chen等[13]研究發(fā)現(xiàn)，6名ARVC伴有室性心動過速患者中有4名出現(xiàn)細胞橋粒斑蛋白基因的突變并伴有CX43的重塑，其中PKP2和DSP基因突變會破壞膜的轉(zhuǎn)運和下調(diào)CX43的表達。李丹丹等[14]構建DSC2沉默的P19細胞株并分化為心肌樣細胞，其纖維化和脂肪化相關基因表達顯著升高，并具有與ARVC患者病理和分子生物學特點相似的表性特征。

2.2黏著連接

黏著連接大多通過與其他蛋白的相互作用參與心律失常的發(fā)生。黏著斑蛋白與ZO-1的直接作用并通過ZO-1與CX43氨基酸結合定位于縫隙連接上。而CX43的分布，表達程度，磷酸化水平與心律失常密切相關。Alice等[15]的動物實驗中，將幼鼠心肌細胞的黏著斑蛋白基因敲除后，ZO-1和CX43的表達下降同時伴有心肌細胞凋亡。Swope等[16]實驗中發(fā)現(xiàn)當特異性敲除小鼠心臟組織的斑珠蛋白不出現(xiàn)明顯的傳導異常反而表現(xiàn)出生存率的延長。當同時敲除β-連鎖蛋白和斑珠蛋白的基因后老鼠表現(xiàn)為黏著蛋白的缺失所致的閏盤結構分散、心肌病、心肌纖維組織替代，并最終出現(xiàn)傳導異常甚至心臟驟停。

2.3縫隙連接

縫隙連接通道直接影響相鄰心肌細胞間的微環(huán)境并參與細胞間各種信息的傳遞，調(diào)控心肌電傳導。CX由超過20個不同基因編碼組成，這些基因結構相似，但N端保守，參與CX六聚體的組裝；C端胞內(nèi)尾部的長度和組成具有可變性，故CX基因突變可以導致縫隙連接功能的障礙[17]。

2.3.1分類 在縫隙連接中，不同的CX的分布，數(shù)量和功能均不相同。分布在心臟上的縫隙蛋白主要包括CX40、CX43、CX45,它們在不同的心肌細胞上表達各不相同[18]。CX43主要表達于心房和心室，而CX40、CX45的表達具有區(qū)域選擇性。在心房肌上，主要是CX40和少量的CX45共表達，但在心室肌上，CX43高表達的同時并與微量的CX45共表達[19]。心肌不同部位的縫隙連接的異常也參與不同類型心律失常的形成。當縫隙連接異常發(fā)生在竇房結和肺靜脈時，引起的電興奮異常與房性心律失常有關[20]。當縫隙連接異常發(fā)生在心肌缺血損傷所致的房室結時，導致PQ間期延長，傳導阻滯[21]。

2.3.2CX40、CX45 CX40在心房中選擇性表達并具有調(diào)節(jié)心房的電興奮作用。當CX40基因的P88S、G30D、A96S位點突變后，表達產(chǎn)物可以通過作用于與CX43共有的縫隙連接負性功能區(qū)減慢心肌傳導，增加心房顫動(AF)的發(fā)生[22]。此外，CX40基因GJA5的多態(tài)性改變可以通過改變TATA盒序列來調(diào)控CX40mRNA表達，最終誘發(fā)AF[23]。心房中CX40、CX43的正常表達具有維持心房電生理穩(wěn)定性作用，當CX40、CX43表達下降時可以導致AF的發(fā)生[24]。研究發(fā)現(xiàn)，增加代謝綜合征模型鼠的極低密度脂蛋白水平可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上降低CX40、CX43的表達并導致CX40、CX43糖基化，同時伴有房室傳導減慢，房室重塑和收縮功能異常最終誘發(fā)心律失常[25]。CX45主要在竇房結和房室結中表達，Ye等[26]用閏盤缺乏細胞重建CX40/CX45和CX43/CX45不同結構的閏盤，發(fā)現(xiàn)人類和啃齒類動物CX43/CX45功能相似，能夠減慢閏盤間傳導，降低動作電位頻率，進而減慢房室結的傳導。

2.3.3CX43及其相關連接 各種原因引起的CX43的異常包括CX43的分布異常、數(shù)量變化、磷酸化水平、重塑和功能異常。在心室肌細胞中，CX43主要分布于心肌細胞的縱向接觸面，而在細胞側面則分布較少，這使得心室肌在垂直軸上的傳導速率是側邊傳導速率的3倍[27]。因此當急性心肌梗死后心肌損傷邊緣區(qū)(IBZ)的CX43分布異常，垂直軸向CX43數(shù)量減少會導致心肌傳導減慢、傳導不均甚至傳導阻滯并誘發(fā)折返性心律失常[28]。Gonzalez等[29]發(fā)現(xiàn)在杜氏營養(yǎng)不良性心肌肥厚(DMD)患者和動物模型中，CX43異常定位到了側面心肌細胞上，而抑制心肌細胞側面CX43的功能會降低心律失常的發(fā)生率和死亡率。另外，縫隙蛋白表達于心肌細胞的同時也表達于非心肌細胞(成纖維細胞，內(nèi)皮細胞，巨噬細胞)。Wilhelm等[30]用完整的慢病毒將CX43穩(wěn)定轉(zhuǎn)移到心肌缺血損傷瘢痕區(qū)的成纖維細胞和CD45+免疫細胞上，發(fā)現(xiàn)這些細胞能夠轉(zhuǎn)移心肌細胞側面的CX43，進而閏盤中CX43的表達增加可以降低缺血損傷，增加瘢痕區(qū)的傳導速率。因此他們認為通過非心肌細胞的活性傳導，CX43基因治療可望成為臨床上簡單易行的降低心肌梗死后室性心律失常的生物治療方式。

現(xiàn)研究表明，多種心臟病理狀態(tài)伴有心肌CX43表達量的下降，而上調(diào)CX43具有心臟保護作用。Dhein等[31]收集160例AF和竇性心律患者的左房組織，發(fā)現(xiàn)AF病人的CX43表達增加并伴有CX43側邊分布，橫向傳導增多。當應用美托洛爾后，CX43表達進一步增加，側邊分布減少，橫向傳導減慢。另外CX43作為許多絲-蘇氨酸蛋白激酶的靶向位點，可以通過改變蛋白激酶和磷酸酶的興奮性來改變CX43的磷酸化水平并參與心肌電紊亂和心律失常的發(fā)生[32]。研究發(fā)現(xiàn)micRNA-1下調(diào)會導致CX43異常分布并誘發(fā)室性快速性心律失常，而選擇性的血管緊張素受體Ⅰ型(AT1R)抑制劑可以通過改善micRNA-1的表達降低CX43的磷酸化水平。Antonio等[33]構建主動脈縮窄的小鼠左室肥厚模型，檢測到micRNA-1水平下降，CX43表達增加，在細胞水平上，用病毒轉(zhuǎn)染使micRNA-1在異丙腎上腺素所致的左室肥厚小鼠中過表達會降低CX43的表達和磷酸化水平。

CX43不僅存在于縫隙連接，也存在于線粒體中。CX43參與線粒體的呼吸、鉀電流的調(diào)控、活性氧(ROS)形成、滲透孔的開放和自噬等過程[34]。Masahito等[35]用CX43抑制劑CBX不僅可以阻斷細胞CX43半通道和線粒體上的CX43，還可以阻斷線粒體KATP通道，這表明CX43可能通過調(diào)控線粒體K-ATP通道引發(fā)心律失常。還有學者認為ROS可以引發(fā)局灶性興奮和折返，用線粒體靶向抗氧化劑可以起到改善CX43重塑和心肌電偶聯(lián)的作用，對保護氧化應激導致的縫隙連接重塑和心律失常發(fā)揮重要作用[36]。

CX43發(fā)揮功能還與一些連接蛋白有關。在心肌中，ZO-1是定位于閏盤和細胞側膜的支架蛋白，可以直接調(diào)控CX43的數(shù)量，分布和功能[37]。Siragam等[38]將小鼠心房肌細胞(HL-1)心肌細胞CX43基因p.S358L穩(wěn)定突變后，ZO-1的表達和分布都會下降，傳導減慢。當ZO-1減少時，CX43磷酸化水平降低，細胞傳導減慢。Indra等[39]發(fā)現(xiàn)CX43的C端的最后5個氨基酸殘基(378-372)在CX43與ZO-1相互連接中起重要作用，如果刪除CX43的C端這5個殘基，胎鼠和成年鼠的體表ECG均表現(xiàn)出明顯廣泛的QRS波異常。

2.4離子通道

鈉通道由1個a亞基和2個β亞基組成。對鈉電流起主要作用的是β1亞基，它能夠使通道迅速回到靜息狀態(tài)并促進NAV1.5二聚體之間的相互作用。當Nav1.5基因SCN5A突變時，動作電位的改變可以引發(fā)室性心律失常和長QT綜合征并最終導致猝死[40]。

Nav1.5主要存在于閏盤中，并與其他蛋白相互作用。橋粒、縫隙連接和鈉通道共同形成一個相互作用的電壓門控鈉通道復合體(VGSC)[41]。新斑蛋白2表達下降時，將出現(xiàn)鈉電流減??；而橋粒芯蛋白表達減少時，心肌傳導減慢，心室興奮時間延長，鈉電流振幅減??；橋粒斑蛋白減少時，會出現(xiàn)區(qū)域性的傳導減慢和Nav1.5的異常分布，CX43異常定位和發(fā)生室性心動過速[42]。此外，Rengasayee等[43]在高分辨率顯微鏡下觀察到Kir2.1通道沿著Nav1.5通道定位于周圍連接，當神經(jīng)元閏盤損傷時，周圍連接延伸腫脹，寬度增加，從而鈉鉀電流異常并導致傳導減慢和心律失常。Kir2.1具有靶向調(diào)控心肌細胞之間的縫隙耦連，各向異性傳導和心律失常發(fā)生的作用。

2.5錨蛋白-G

錨蛋白-G作為VGSC的組成成分之一，與Nav1.5連接的同時與新斑蛋白2、CX43相互作用。實驗在缺血再灌注模型犬術后48 h和5天兩個時間段分別觀察心外膜邊緣區(qū)Na通道，錨蛋白G，縫隙連接蛋白表達，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注48 h后Na通道和錨蛋白G沒有明顯改變，CX40/CX43開始改變但沒有明顯的側面分布，而5天后錨蛋白G表達增加出現(xiàn)重塑并伴有Na通道的下降，并證明在心肌缺血后期錨蛋白-G表達增強可以通過調(diào)節(jié)Nav1.5通道并把它定位到肌纖維膜上，從而對心肌產(chǎn)生保護作用[44]。

3 研究現(xiàn)狀

近年來研究的心律失常藥物主要集中作用在膜離子通道，但這些藥物本身具有致心律失常作用。目前調(diào)節(jié)CX43表達已經(jīng)成為抗心律失常藥物研究的新靶點。Kerstin等[45]研究表明，縫隙連接改造劑ZP123不僅可以調(diào)控心室顫動中細胞膜上CX43的表達、分布和磷酸化，在犬心室顫動模型上，ZP123能夠通過改善CX43的重塑降低復律時的除顫能量?，F(xiàn)在學界對閏盤蛋白的結構、分布、功能、調(diào)控機制已經(jīng)有初步的了解，關于閏盤蛋白和心律失常之間的相關機制研究已經(jīng)取得很大的進展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)micRNA、Wnt通路、AMPK通路、CaMKII通路等機制參與閏盤蛋白的調(diào)節(jié)，影響心律失常的發(fā)生發(fā)展[46]。但現(xiàn)在閏盤蛋白藥物的研究仍然較少，仍具有廣闊的開發(fā)價值。因此閏盤蛋白有望成為心律失常的靶向治療上的新突破。

4 結論

閏盤作為心肌電生理基本結構，具有復雜的結構，其間的閏盤蛋白相互影響，在心律失常的發(fā)生發(fā)展預后中發(fā)揮重要作用。心律失常作為心血管領域的常見疾病，其發(fā)病率和死亡率較高，但治療上仍然存在挑戰(zhàn)，需要尋找新的治療靶點。因此增強縫隙連接的交流和閏盤蛋白間相互作用的調(diào)節(jié)有望成為保護、調(diào)控甚至逆轉(zhuǎn)心律失常的新型治療手段。