龍華洋 孫 丹 李金萍 江世文,3
(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)系,北京 100069)(2.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心,西安 710038)(3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系,默索大學(xué)醫(yī)學(xué)院,紀(jì)念健康醫(yī)學(xué)中心,婦科與婦產(chǎn)科系,薩凡納,GA,美國(guó),31404)(4.常州大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院,常州 213164)
人附睪蛋白 4(Human epididymis protein 4,HE4)最初是在人附睪中被發(fā)現(xiàn),并因此而得名[1]。此后HE4被證明是由人 Wfdc2(WAP four-disulfide core domain protein 2)基因編碼的一種分泌蛋白,因此HE4又名為 WFDC2[2]。另有研究報(bào)道,除了在人附睪中表達(dá)外,HE4也在其他正常組織器官中有表達(dá),包括生殖系統(tǒng),呼吸系統(tǒng),并且HE4在氣管中表達(dá)最高,其余依次唾液腺,肺等組織[3-4]。
近年來(lái),越來(lái)越多的研究指出,HE4在一些癌癥中高表達(dá),包括卵巢癌[3,5-7],肺癌[8-11],子宮內(nèi)膜癌[12]。因此認(rèn)為HE4可以作為檢測(cè)這些癌癥的標(biāo)志物。在HE4相關(guān)癌癥的研究中,HE4與卵巢癌的研究最受研究者關(guān)注。目前,CA125的含量仍然是檢測(cè)卵巢癌的金標(biāo)準(zhǔn)[13],Hellstrom等[5]用卵巢癌患者血清中的 HE4水平來(lái)檢測(cè)卵巢癌,其結(jié)果與CA125有相同的靈敏性,并且用HE4作為檢測(cè)指標(biāo)能提高惡性腫瘤檢測(cè)的特異性。Ghasem i[14]和Zhao等[15]指出,CA125聯(lián)合 HE4檢測(cè)可以提高卵巢癌檢測(cè)的敏感性和特異性。研究指出,HE4可能是促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞[16-17]和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞[18]增殖的一個(gè)激活因子。而且,在癌細(xì)胞裸鼠異種移植實(shí)驗(yàn)中,過(guò)表達(dá)HE4的腫瘤體積明顯大于對(duì)照組腫瘤[17]。上述研究提示,HE4高表達(dá)與腫瘤增殖有關(guān),但是在正常組織中,HE4缺失的影響以及它正常的生理功能仍然不清楚。
基因敲除小鼠模型是研究動(dòng)物基因功能的重要工具之一,小鼠的基因組與人類基因組相似度達(dá)90%,有99%的基因與人類基因同源[19],并且表達(dá)HE4蛋白的人Wfdc2在如小鼠等一些物種間高度保守[3],但目前尚無(wú) WFDC2敲除小鼠模型來(lái)研究HE4的正常生理功能。
基因敲除技術(shù)的傳統(tǒng)方法是通過(guò)同源重組獲得基因敲除的ES細(xì)胞,然后通過(guò)嵌合體技術(shù)獲得基因敲除動(dòng)物[20],近幾年來(lái)興起的基因編輯工具包括鋅指核酸酶 ZFN技術(shù)[21],轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶TALEN技術(shù)[22],成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列CRISPR以及CRISPR相關(guān)蛋白系統(tǒng)CRISPR/Cas9技術(shù)[23]。本研究采用TALEN技術(shù)敲除C57BL/6 J小鼠Wfdc2基因,首次獲得WFDC2敲除小鼠模型,并發(fā)現(xiàn)純合WFDC2敲除小鼠出生后短時(shí)間內(nèi)死亡,為進(jìn)一步研究HE4的正常生理功能奠定基礎(chǔ)。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由北京生命科學(xué)研究所轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中心提供。使用許可證號(hào):SYXK(京)2015-002。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均在SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)和繁殖。溫度控制在 22℃,濕度 70%,自動(dòng)光周期(12 h明/12暗),自由采食和飲水。
Golden Gate TALEN assembly合成的質(zhì)粒(Addgene),10X T4 DNA ligase buffer(NEB),T4 DNA ligase(NEB),限制性內(nèi)切酶 Bsa I(NEB),Sac I,Esp3I(Fisher)質(zhì)粒小提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、T載體試劑盒、mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit(Life Technologies)。
根據(jù) NCBI上小鼠 Wfdc2基因序列,利用TALEN在線設(shè)計(jì)工具(http://tale-nt.cac.cornell.edu)設(shè)計(jì)基因敲除位點(diǎn)。TALENs敲除靶序列如下:TALEN-L靶向序列5'-GCA CCA TGC CTG CCT G-3',TALEN-R靶向序列 5'-AGT AGG AGG CCA GCG GC-3'。中間的 spacer序列為 5'-TCG CCT CTG CTT GCT G-3'。
采用Golden gate法將識(shí)別靶序列的RVD模塊構(gòu)建到載體上。然后將TALEN片段通過(guò) Esp3I酶切構(gòu)建到pCAG-T7-TALEN載體上,使得TALEN表達(dá)有 CAG或者 T7啟動(dòng)子啟動(dòng),其中 CAG啟動(dòng)TALENs在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá),T7啟動(dòng) TALENs體外轉(zhuǎn)錄成mRNA。將測(cè)序正確的TALENs表達(dá)載體采用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒備用。
Sac I酶切 TALENs無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒,電泳回收片段,并進(jìn)行純化。以純化片段為模板,采用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成多聚腺苷酸化的mRNA。將體外轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定mRNA用NucAway Spin Columns純化回收并用顯微注射緩沖液稀釋到100ng/μL,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
將WFDC2的TALEN-L和 TALEN-R mRNA混合在一起后在顯微鏡(Nikon)下利用顯微操作系統(tǒng)(Eppendorf)注射到15枚 C57BL/6 J的受精卵中,培養(yǎng)3.5 d后挑選出存活的囊胚,混合一起用裂解液裂解,以裂解液為模板,以上游引物:5'-TGTGCTTCCTACCCGCCTCCT-3'和下游引物:5'-CCCGCTCCTCTTCATCAGGTCTC-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并采用T7E1進(jìn)行酶切鑒定,其中擴(kuò)增片段大小為413 bp,酶切片段為120 bp+293 bp。驗(yàn)證 TALENs有切割活性后,按照上述方法,獲得顯微注射受精卵,將其移植到ICR代孕雌鼠輸卵管內(nèi)。
取1周齡小鼠腳趾提取基因組DNA,同時(shí)進(jìn)行編號(hào),按照酶切鑒定方法對(duì)F0代小鼠進(jìn)行基因型鑒定,并將T7E1酶切鑒定為陽(yáng)性的小鼠的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T載體上,進(jìn)行測(cè)序和突變基因分析。將Wfdc2基因發(fā)生移碼突變的F0代小鼠單獨(dú)建系,最后得到Wfdc2純合雙敲除小鼠。1
對(duì)WFDC2敲除小鼠的出生情況進(jìn)行觀察分析,記錄每一窩的出生胎鼠數(shù)量,基因型比例以及存活情況。
小鼠Wfdc2基因有五個(gè)已知轉(zhuǎn)錄變異體,為了高效敲除WFDC2蛋白表達(dá),本研究選擇的敲除位點(diǎn)為 Wfdc2基因的第一個(gè)外顯子區(qū)域,如圖 1。TAL-effector識(shí)別模塊 HD、NG、NI、NN分別識(shí)別堿基C、T、A、G,因此本研究中識(shí)別 Wfdc2的模塊序列分別為5'-NN HD NIHD HD NING NN HD HD NG NN HD HD NG NN-3'和TALEN-R 5'-NINN NN NI NN NN HD HD NINN HD NN NN HD HD NI-3'。采用Golden gate的方法[24]獲得了 TALENs體外轉(zhuǎn)錄模板,如圖2。
圖1 Wfdc2基因敲除TALENs位點(diǎn)Fig.1 The TALENs binding site in the m ouse Wfdc2 gene
圖2 Wfdc2 TALENs識(shí)別臂的構(gòu)建Fig.2 The construction of Wfdc2 TALENs tem p late
體外轉(zhuǎn)錄分別得到 TALEN-L和TALEN-R的mRNA。將mRNA分別稀釋到100ng/μL后等量混合進(jìn)行胞質(zhì)注射,先注射15枚受精卵,進(jìn)行TALENs活性驗(yàn)證(圖3),驗(yàn)證TALENs有切割活性后,共注射140枚受精卵,移植131枚到5只ICR代孕雌鼠輸卵管中,共出生24只小鼠。對(duì)出生的24只F0代小鼠進(jìn)行鑒定,鑒定結(jié)果顯示,有9只敲除陽(yáng)性小鼠(圖4),選取第24號(hào) F0代陽(yáng)性小鼠繼續(xù)繁育最終獲得敲除17個(gè)堿基的Wfdc2純合雙敲除模型。
得到24號(hào)F0代陽(yáng)性小鼠后,我們將它與野生型小鼠交配,F(xiàn)1代留下敲除17個(gè)堿基的雜合WFDC2敲除小鼠(WFDC2+/-),這些雜合小鼠能正常生長(zhǎng),和野生型小鼠生長(zhǎng)情況并無(wú)明顯的差別,WFDC2+/-小鼠自交,能正常懷孕產(chǎn)仔得到F2代小鼠,根據(jù)孟德爾第一定律,F(xiàn)2代小鼠中將出現(xiàn)野生型(WFDC2+/+),雜合(WFDC2+/-)及純合(WFDC2-/-)小鼠,并且 WFDC2+/+∶WFDC2+/-∶WFDC2-/-的比例應(yīng)為1∶2∶1。但是在 F2代小鼠出生后5 d我們對(duì)F2代小鼠編號(hào)及基因型鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn),存活的F2代小鼠中沒有發(fā)現(xiàn)WFDC2-/-小鼠,只發(fā)現(xiàn) WFDC2+/+和 WFDC2+/-。這一結(jié)果說(shuō)明WFDC2-/-小鼠可能胚胎致死或者出生后死亡。
圖4 鑒定Wfdc2基因發(fā)生切割的小鼠Fig.4 Restriction digest of PCR p roducts used for identification of m ice carrying-induced m utations of the Wfdc2 gene
為驗(yàn)證 WFDC2-/-小鼠是否胚胎致死,我們對(duì)7只胚胎 18.5 d(E18.5)WFDC2+/-孕鼠進(jìn)行剖腹產(chǎn),發(fā)現(xiàn)E18.5 d孕鼠腹中胎兒中有 WFDC2-/-小鼠,并且未見死胎,其中野生型占總出生數(shù)量的29.58%,WFDC2+/-占 46.48%,WFDC2-/-占23.94%(表1),接近孟德爾第一定律1∶2∶1的比例。這一結(jié)果提示,WFDC2-/-小鼠可能在出生后死亡,經(jīng)過(guò)仔細(xì)觀察追蹤,我們發(fā)現(xiàn),每窩新生胎兒中,都有一些新生小鼠尸體或殘骸,懷疑有的可能被母鼠吃掉。接著,我們對(duì)這些尸體或殘骸進(jìn)行基因型鑒定,發(fā)現(xiàn)這些死去的胎鼠是WFDC2-/-小鼠。為了防止母鼠將新生 WFDC2-/-小鼠吃掉,我們將剛出生的胎鼠立即與母鼠分開,對(duì)不同 WFDC2+/-自交所產(chǎn)生6窩新生小鼠出生情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì),其中50%的新生WFDC2-/-小鼠在5 h之內(nèi)死亡,所有新生WFDC2-/-小鼠在18 h內(nèi)死亡,而 WFDC2+/-小鼠和WFDC2+/+小鼠能正常存活下來(lái)(圖5);在這些胎鼠中,WFDC2+/+占總出生數(shù)量的 23%,WFDC2+/-占 52%,WFDC2-/-占 25%(表 2),接近孟德爾第一定律;而 WFDC2+/-自交后代每窩平均產(chǎn)仔數(shù)和WFDC2+/+自交后代每窩平均產(chǎn)仔數(shù)之間沒有顯著差異(圖 6)。上述結(jié)果說(shuō)明非純合WFDC2敲除小鼠和野生型小鼠一樣具有正常的生長(zhǎng)發(fā)育和生殖繁育能力,而純合 WFDC2敲除小鼠能夠正常出生,并在出生后死亡。
圖5 新生小鼠24 h內(nèi)生存曲線Fig.5 Survival curve for WT、hetero and KO fetus after birth w ithin 24 hours
表1 E18.5天胎鼠基因型分布情況Tab le 1 Genotype distribution of em bryos from E18.5
表2 新生小鼠基因型分布Tab le 2 Genotype distribution of neonatal from P0
圖6 WFDC2+/-自交后代每窩平均產(chǎn)仔數(shù)和WFDC2+/+自交后代每窩平均產(chǎn)仔數(shù)Fig.6 Summ ary of litter sizes born from WFDC2+/+and WFDC2+/-
現(xiàn)今基因組編輯技術(shù)突飛猛進(jìn),在TALEN基因編輯技術(shù)之后,又出現(xiàn)了CRISPER-Cas9基因編輯技術(shù),因其操作周期短,效率高而被廣泛使用[23,25]。而TALEN也因其相對(duì)操作簡(jiǎn)單,特異性高等特點(diǎn),仍被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物等的基因編輯。本研究通過(guò)胞質(zhì)注射TALEN mRNA的方法獲得了Wfdc2基因發(fā)生移碼突變的F0代小鼠,將該種小鼠單獨(dú)建系,繁育和培養(yǎng),最后獲得純合的WFDC2敲除模型小鼠。
現(xiàn)今有關(guān)WFDC2功能的研究,特別是它在腫瘤發(fā)生過(guò)程中所起作用的研究越來(lái)越受人重視。許多研究都指出卵巢癌,肺癌等組織中HE4有異常高表達(dá),并提出 HE4可以作為這些癌癥的檢測(cè)指示物。但HE4的高表達(dá)是促進(jìn)癌癥的發(fā)生還是由于癌癥的發(fā)生而導(dǎo)致HE4的高表達(dá)這個(gè)問(wèn)題仍然沒有定論。在目前的研究更傾向于HE4高表達(dá)促進(jìn)癌癥的發(fā)生。Zhu等[16]通過(guò)沉默卵巢癌細(xì)胞中HE4的表達(dá),發(fā)現(xiàn)這些癌細(xì)胞的增殖及遷移能力隨HE4的減少而降低,指出HE4的表達(dá)可能是維持腫瘤細(xì)胞增殖、遷移的因子,并且Moore等[17]通過(guò)在卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)HE4,證明HE4促進(jìn)卵巢腫瘤的發(fā)生。但是 Gao等[26]和 Kong等[27]卻指出 HE4在腫瘤中起著抑制癌細(xì)胞增殖和遷移的作用。因此現(xiàn)階段關(guān)于HE4是否促進(jìn)腫瘤的發(fā)生的結(jié)論還需要更多的研究來(lái)證實(shí)。WFDC2除了在腫瘤組織中有高表達(dá)外,它在正常組織中也有表達(dá)。在人體正常組織中表達(dá)量從高到低的器官依次是氣管,唾液腺,肺;而在小鼠正常組織中表達(dá)量從高到低的器官依次是肺,腎等[4]器官,這些研究結(jié)果提示HE4可能參與調(diào)控體內(nèi)相關(guān)正常生理活動(dòng)。
本研究發(fā)現(xiàn)WFDC2純合敲除小鼠出生后死亡,而非純合WFDC2敲除小鼠能正常生長(zhǎng)和繁育??赡艿脑蚴牵?).純合WFDC2敲除小鼠在孕鼠母體內(nèi)能夠獲得來(lái)自母體血液的WFDC2,而出生后由于缺乏母體和自身合成的WFDC2而死亡。而非純合小鼠由于未全部失去自身合成WFDC2的能力而能在出生后正常存活并生長(zhǎng)發(fā)育。有趣的是,WFDC2在一些物種中高度保守[3],成熟WFDC2蛋白分子量在13kD,在被糖基化修飾后為27kD左右,至于27kD的WFDC2是否能透過(guò)胎盤屏障而到達(dá)胎兒體內(nèi)還有待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。2).WFDC2表達(dá)可能具有時(shí)空性,在胚胎發(fā)育期或胚胎發(fā)育早期,WFDC2不參與相關(guān)生理活動(dòng),在小鼠出生后 WFDC2參與并維持正常生理活動(dòng),而純合敲除小鼠由于缺乏WFDC2表達(dá)而不能實(shí)現(xiàn)相關(guān)生理功能正常進(jìn)行,最終導(dǎo)致死亡。本實(shí)驗(yàn)首次通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明WFDC2參與調(diào)控小鼠正常生理活動(dòng),提示 WFDC2可能在維持胎兒正常生理功能中起著重要的作用,同時(shí),通過(guò)研究HE4正常生理功能的作用機(jī)制,能更好的幫助我們理解它們?cè)诎┌Y發(fā)生中所起的作用。因此,本研究獲得的WFDC2敲除小鼠是研究WFDC2生理功能的良好模型。