不同飼料配方復(fù)制混合型高脂血癥大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究*

嚴(yán)家榮 吳賢生 黎雄才 劉盛來 劉月姝 鄺少松

（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心比較醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，佛山 528248）

心腦血管疾病是我國人群死亡的首要原因，高脂血癥和動脈粥樣硬化癥是導(dǎo)致心腦血管疾病發(fā)生的主要因素，而臨床上最為常見的是膽固醇和甘油三酯同時(shí)升高的混合型高脂血癥，但目前采用高脂飼料制作的高脂血癥大鼠模型多數(shù)只能提高血清TC含量，血清TG含量是否提高報(bào)道不一。因此，本試驗(yàn)通過比較9個(gè)配方飼料連續(xù)喂養(yǎng)大鼠4周對血脂水平的影響，從而找到復(fù)制混合型高脂血癥大鼠模型的合適配方，為降血脂物質(zhì)的藥效篩選及機(jī)制研究提供良好的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及飼養(yǎng)環(huán)境

無特定病原體（SPF）級SD大鼠，100只，雄性，體質(zhì)量160～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)使用許可證：SCXK（粵）2013-0002，質(zhì)量合格證號：44007200033720，飼養(yǎng)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級動物實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境設(shè)施使用許可證：SYXK（粵）2013-0002，動物實(shí)驗(yàn)證明 00157056。

1.2 主要試劑

TC、TG、HDLC、LDLC、GLU試劑盒均購自上?？迫A生物工程股份有限公司，TC、TG試劑盒批號是20160622；HDLC、LDLC試劑盒批號是 20160712；GLU試劑盒批號是20160312。

1.3 主要儀器

BS-3000 A電子分析天平，感量0.1 g，上海友聲衡器有限公司產(chǎn)品；ECHO全自動血液生化分析儀，意大利 LOGOTECH產(chǎn)品；RM2235型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)，德國 LEICA公司產(chǎn)品；BX43型生物顯微鏡，日本奧林巴斯產(chǎn)品；Image-Pro Express 5.1.1.14病理圖像分析系統(tǒng)，Media Cybernetics，Inc.產(chǎn)品。

1.4 飼料的配制方法

1.4.1 基礎(chǔ)飼料：由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，飼料成分見表1。

表1 基礎(chǔ)飼料配方Tab le 1 Ingredient com position of basic diet

1.4.2 實(shí)驗(yàn)飼料：豬油購于嘉里糧油（四川）有限公司，生產(chǎn)日期為20160906；膽固醇和膽鹽均購于廣州晶欣生物科技有限公司，LOT#分別是1810和20160113；蔗糖購于廣西來賓東糖遷江有限公司，批號20160125193217，各配方飼料構(gòu)成見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)飼料配方Tab le 2 Ingredient com position of the experim ental diets.

1.5 動物分組和造模

SPF級SD大鼠，雄性，100只。大鼠檢疫4 d合格后開始試驗(yàn)，按體質(zhì)量 隨機(jī)分為基礎(chǔ)飼料組、配方1飼料組、配方2飼料組、配方3飼料組、配方4飼料組、配方5飼料組、配方6飼料組、配方7飼料組、配方8飼料組、配方9飼料組，10只/組。除基礎(chǔ)飼料組給予基礎(chǔ)飼料外，其余各配方組給予相應(yīng)配方的模型飼料，連續(xù)喂養(yǎng)4周。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 觀察：試驗(yàn)期間每天觀察大鼠外觀體征、行為活動等情況。

1.6.2 體質(zhì)量：試驗(yàn)開始，測定大鼠體質(zhì)量的基礎(chǔ)值，試驗(yàn)期間，每周測量體質(zhì)量 各1次。

1.6.3 攝食量：每周測定攝食量1次。

1.6.4 血清 TC、TG、HDLC、LDLC、GLU含量：分別于喂養(yǎng)2周、喂養(yǎng)4周不禁食經(jīng)眼底靜脈叢采血，測定血清中 TC、TG、HDLC、LDLC、GLU的含量。

1.6.5 肝臟系數(shù)、脂肪系數(shù)測定：于喂養(yǎng)4周，禁食不禁水12 h后稱量大鼠體質(zhì)量，取大鼠肝臟、腎周脂肪、睪丸周脂肪并稱重，按以下公式計(jì)算肝臟系數(shù)、脂肪系數(shù)：

1.6.6 肝臟病理組織學(xué)檢測：取肝臟組織，4%甲醛溶液固定，經(jīng)HE染色后進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)檢測。并按照肝細(xì)胞脂肪變性評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，見圖1。

（1）含脂滴的肝細(xì)胞散在稀少（記0分）；

（2）含脂滴的肝細(xì)胞≤1/4（記1分）；

（3）含脂滴的肝細(xì)胞＞1/4且≤1/2（記2分）；

（4）含脂滴的肝細(xì)胞＞1/2且≤3/4（記3分）；

（5）肝組織幾乎被脂滴代替（記4分）。

圖1 肝臟病理組織學(xué)評分（H.E×200）Fig.1 the score of liver histopathology（H.E ×200）

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般癥狀

各組大鼠精神狀態(tài)良好，行為、飲水均無異常，發(fā)毛光亮，糞便成形，但各配方組大鼠攝食量偏少。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量

表3結(jié)果顯示，與基礎(chǔ)飼料組大鼠比較，配方5飼料組大鼠喂養(yǎng)3周體質(zhì)量 增長慢，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），配方6飼料組大鼠喂養(yǎng)3周、喂養(yǎng)4周體質(zhì)量 增長均慢，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其余各組各時(shí)間點(diǎn)的體質(zhì)量 增長均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

各配方飼料組大鼠組間比較，各時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量增長均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

結(jié)果提示，配方5飼料、配方6飼料給予大鼠喂養(yǎng)4周，體質(zhì)量增長緩慢。

表 3 各組大鼠體質(zhì)量（±s）Table 3 The body weight of rats

表 3 各組大鼠體質(zhì)量（±s）Table 3 The body weight of rats

注：凡有一個(gè)相同字母標(biāo)記的即為差異不顯著，凡無相同字母標(biāo)記的即為差異顯著Note：It's non-significant if there is a same letter marked，otherwise， it's significant

基礎(chǔ)飼料組10 196.6±9.7 258.7±14.9 331.7±20.3 383.1±26.8b 428.4±35.4b配方1飼料組 10 195.9±13.0 257.0±18.4 325.8±26.7 372.1±34.1 420.9±41.1配方2飼料組 10 193.4±10.9 246.3±17.5 309.3±26.8 351.3±36.4 387.7±42.8配方3飼料組 10 192.4±12.2 239.2±13.9 297.2±20.0 338.6±23.4 381.2±24.7配方4飼料組 10 197.3±12.7 250.7±21.5 315.1±32.4 363.3±44.5 405.7±52.8配方5飼料組 10 193.0±9.0 238.8±11.4 297.1±17.4 335.0±22.4a 373.9±24.5配方6飼料組 10 189.3±11.7 241.1±13.7 296.9±20.8 333.8±27.3a 371.0±32.5a配方7飼料組 10 196.0±12.4 250.2±22.7 321.3±34.7 375.5±46.7 425.1±57.1配方8飼料組 10 192.5±8.7 243.7±11.7 308.6±17.6 350.6±24.4 392.4±29.7配方9飼料組10 193.2±11.5 240.3±24.2 296.7±24.2 343.4±29.1 385.9±32.0

2.3 各組大鼠平均日攝食量

表4結(jié)果顯示，與基礎(chǔ)飼料組大鼠日攝食量比較，喂養(yǎng)1周，除配方3飼料組平均日攝食量減少（P＜0.05），配方7飼料組平均日攝食量增多（P＜0.05），其余配方組大鼠的平均日攝食量均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；喂養(yǎng)2周 ～4周，各配方飼料組大鼠的平均日攝食量均減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

表4 各組大鼠平均日攝食量（±s±s）Tab le 4 The average daily food intake of rats

表4 各組大鼠平均日攝食量（±s±s）Tab le 4 The average daily food intake of rats

注：凡有一個(gè)相同字母標(biāo)記的即為差異不顯著，凡無相同字母標(biāo)記的即為差異顯著Note：It's non-significant if there is a same letter marked，otherwise， it's significant

基礎(chǔ)飼料組10 27.6±1.9b 31.7±3.4c 33.1±3.1 d 33.0±4.2 d配方1飼料組 10 25.9±1.9ab 26.2±2.2ab 25.5±2.3abc 26.9±2.6abc配方2飼料組 10 25.4±1.9ab 25.3±2.1ab 26.4±2.7abc 25.4±3.3abc配方3飼料組 10 24.3±1.5a 24.2±2.0a 24.7±2.0ab 25.0±2.1ab配方4飼料組 10 26.1±2.3ab 26.2±4.0ab 25.9±3.9abc 27.9±4.0bc配方5飼料組 10 25.3±1.7ab 24.1±1.4a 23.8±2.1a 25.3±1.6abc配方6飼料組 10 25.3±1.5ab 23.7±1.7a 24.3±1.3ab 23.8±2.1a配方7飼料組 10 29.3±2.4c 29.5±3.0c 29.0±3.5c 29.1±4.0c配方8飼料組 10 26.8±1.9ab 27.3±2.3ab 27.3±2.5bc 26.8±2.2abc配方9飼料組10 25.5±2.2ab 23.7±2.9a 26.7±2.3abc 25.7±2.2abc

各配方飼料組大鼠日攝食量組間比較，配方7飼料組大鼠于喂養(yǎng)1周、喂養(yǎng)2周的平均日攝食量與其它配方飼料組大鼠日攝食量比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），配方7飼料組大鼠于喂養(yǎng)3周、喂養(yǎng)4周的平均日攝食量與配方3飼料組、配方5飼料組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其余各配方組大鼠的平均日攝食量均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

結(jié)果提示，各配方飼料給予大鼠喂養(yǎng)4周，大鼠的平均日攝食量均減少，其中，配方7飼料引起大鼠平均日攝食量減少幅度最少。

2.4 各組大鼠血清 TC、TG、HDLC、LDLC、GLU含量的影響

表5結(jié)果顯示，喂養(yǎng)2周，與基礎(chǔ)飼料組大鼠血清各含量比較，各配方組大鼠血清TC、LDLC含量增加，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；各配方組大鼠血清GLU含量減少，但屬于生理值范圍內(nèi)波動，無臨床意義；各配方飼料組大鼠血清 TG、HDLC含量均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。各配方飼料組大鼠血清各含量組間比較，配方4飼料組大鼠血清TC含量高于配方 1、2、3、6、7、8、9 飼料組，配方 4 飼料組大鼠血清 LDLC含量高于配方 1，3，6，8，9飼料組，配方3、4、5、6飼料組大鼠血清 GLU含量低于配方8、9飼料組，但屬于生理值范圍內(nèi)波動，無臨床意義。

結(jié)果提示，各配方飼料給予大鼠喂養(yǎng)2周，血清TC、LDLC含量均增加，但 GLU含量改變無臨床意義，其中，配方4飼料引起大鼠TC、LDLC含量升高幅度最大。

表 5 喂養(yǎng) 2周后各組大鼠血清 TC、TG、HDLC、LDLC、GLU含量的影響（±s±s）Tab le 5 The effects of TC，TG，HDLC，LDLC and GLU in rat serum after 2 weeks feeding

表 5 喂養(yǎng) 2周后各組大鼠血清 TC、TG、HDLC、LDLC、GLU含量的影響（±s±s）Tab le 5 The effects of TC，TG，HDLC，LDLC and GLU in rat serum after 2 weeks feeding

注：凡有一個(gè)相同字母標(biāo)記的即為差異不顯著，凡無相同字母標(biāo)記的即為差異顯著Note：It's non-significant if there is a same lettermarked，otherwise， it's significant

基礎(chǔ)飼料組10 1.77±0.33a 2.11±0.73 0.64±0.08 0.38±0.06a 8.29±0.76c配方1飼料組 10 3.68±0.64bc 3.25±0.80 0.71±0.05 0.92±0.18b 7.19±0.78ab配方2飼料組 10 4.12±1.07bc 3.48±1.17 0.66±0.09 1.14±0.32bc 6.54±0.84ab配方3飼料組 10 4.13±0.71bc 3.03±0.58 0.68±0.10 0.99±0.17b 6.28±0.84a配方4飼料組 10 5.64±1.08e 2.72±0.96 0.71±0.13 1.32±0.28c 6.23±0.70a配方5飼料組 10 5.07±0.65de 2.83±0.85 0.71±0.07 1.12±0.17bc 6.35±0.85a配方6飼料組 10 3.46±0.71b 3.22±1.12 0.67±0.08 0.91±0.25b 6.23±0.45a配方7飼料組 10 4.54±0.41cd 2.48±0.69 0.68±0.07 1.03±0.11bc 6.86±0.88ab配方8飼料組 10 3.87±0.49bc 3.23±1.08 0.68±0.08 1.00±0.26b 7.40±0.89b配方9飼料組10 3.98±0.70bc 3.19±1.55 0.62±0.06 0.98±0.30b 7.37±0.64b

表6結(jié)果顯示，喂養(yǎng)4周，與基礎(chǔ)飼料組大鼠比較，各配方組大鼠血清 TC、LDLC含量增加，配方1組大鼠血清TG含量增加，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），各配方飼料組大鼠血清HDLC、GLU含量均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。各配方飼料組大鼠組間比較，配方4飼料組大鼠血清TC含量高于配方1、3、6、8、9飼料組，配方3飼料組大鼠血清TC含量高于配方6飼料組，配方1飼料組大鼠血清TG含量高于配方6飼料組，配方6飼料組大鼠血清LDLC含量低于其它配方飼料組，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

結(jié)果提示，各配方飼料給予大鼠喂養(yǎng)4周，血清TC、LDLC含量均增加，其中，配方4飼料引起大鼠TC、LDLC含量升高幅度最大，配方1引起大鼠 TG含量升高幅度最大。

2.5 各組大鼠肝臟系數(shù)和脂肪系數(shù)的影響

表7結(jié)果顯示，喂養(yǎng)4周，與基礎(chǔ)飼料組大鼠比較，各配方組大鼠肝臟系數(shù)均增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），各配方飼料組大鼠脂肪系數(shù)均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。各配方飼料組大鼠組間比較，配方4飼料組大鼠肝臟系數(shù)高于配方1、2、3、5、6、8、9 飼料組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

結(jié)果提示，各配方飼料給予大鼠喂養(yǎng)4周，肝臟系數(shù)均增加，但不能引起大鼠肥胖，其中，配方4飼料引起大鼠肝臟系數(shù)增加幅度最大。

表 6 喂養(yǎng) 4周后各組大鼠血清 TC、TG、HDLC、LDLC、GLU含量的影響（±s±s）Tab le 6 The effects of TC，TG，HDLC，LDLC and GLU in rat serum after 4 weeks feeding

表 6 喂養(yǎng) 4周后各組大鼠血清 TC、TG、HDLC、LDLC、GLU含量的影響（±s±s）Tab le 6 The effects of TC，TG，HDLC，LDLC and GLU in rat serum after 4 weeks feeding

注：凡有一個(gè)相同字母標(biāo)記的即為差異不顯著，凡無相同字母標(biāo)記的即為差異顯著Note：It's non-significant if there is a same letter marked，otherwise， it's significant

基礎(chǔ)飼料組10 1.68±0.29a 1.98±0.29a 0.58±0.08 0.32±0.02a 7.61±0.87配方1飼料組 10 3.52±0.36bc 3.28±0.98b 0.58±0.03 0.85±0.19c 7.07±0.94ab配方2飼料組 10 4.06±1.32cd 2.80±0.93 0.57±0.10 1.03±0.44c 6.82±0.72a配方3飼料組 10 3.83±0.69c 2.47±0.58 0.55±0.07 0.87±0.19c 6.78±0.11a配方4飼料組 10 4.95±1.09 d 2.35±0.68 0.59±0.11 1.04±0.18c 7.82±1.53配方5飼料組 10 3.96±0.50cd 2.28±0.40 0.56±0.06 0.84±0.13c 7.32±0.49配方6飼料組 10 3.02±0.74b 2.01±0.35a 0.52±0.07 0.63±0.12b 7.79±1.00配方7飼料組 10 4.23±0.69cd 2.73±1.03 0.56±0.05 0.93±0.20c 8.45±1.00c配方8飼料組 10 3.41±0.51bc 2.73±0.79 0.58±0.09 0.87±0.17c 8.10±0.93bc配方9飼料組10 3.45±0.78bc 2.58±1.19 0.57±0.07 0.83±0.26c 7.91±0.75

表7 喂養(yǎng)4周后各組大鼠肝臟系數(shù)和脂肪系數(shù)的影響（±s ±s）Tab le 7 The effects of the liver coefficien t and fat coefficien t in rats after 4 weeks feeding

表7 喂養(yǎng)4周后各組大鼠肝臟系數(shù)和脂肪系數(shù)的影響（±s ±s）Tab le 7 The effects of the liver coefficien t and fat coefficien t in rats after 4 weeks feeding

注：凡有一個(gè)相同字母標(biāo)記的即為差異不顯著，凡無相同字母標(biāo)記的即為差異顯著Note：It's non-significant if there is a same lettermarked，otherwise，it's significant

基礎(chǔ)飼料組10 4.41±0.39b 2.27±0.53 10 3.31±0.25a 2.55±0.61配方1飼料組 10 4.31±0.66b 3.04±0.85配方2飼料組 10 4.32±0.29b 2.82±0.60配方3飼料組 10 4.25±0.44b 2.93±0.72配方4飼料組 10 5.06±0.71c 3.05±0.76配方5飼料組 10 4.28±0.35b 2.46±0.54配方6飼料組 10 4.04±0.42b 2.59±0.59配方7飼料組 10 4.68±0.39bc 2.51±0.77配方8飼料組 10 4.26±0.57b 2.79±0.48配方9飼料組

2.6 各組大鼠肝臟脂肪變性評分結(jié)果

表8結(jié)果顯示，與基礎(chǔ)飼料組大鼠比較各配方飼料組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度較重，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），各配方飼料組之間大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

結(jié)果提示，各配方飼料給予大鼠喂養(yǎng)4周均能引起肝細(xì)胞脂肪變性，但各配方飼料組之間引起大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度未見明顯差異。配方3、配方4、配方5、配方7、配方8飼料引起的脂肪變性評分集中在3分以上。

表8 喂養(yǎng)4周后各組大鼠肝臟脂肪變性評分結(jié)果Tab le 8 The Result of the degree of hepatic steatosis of rats after 4 weeks feeding

3 討論

隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，高蛋白、高脂、高糖飲食攝入機(jī)會增多，加上運(yùn)動量的減少，攝入的脂肪無法消耗而積聚，導(dǎo)致高脂血癥（hyperlipidm ia，HLP）的發(fā)病率日益增高，高脂血癥與動脈粥樣硬化密切相關(guān)，是引起心腦血管疾病的重要因素之一[1]。

由于人體血脂的主要成分是TC和TG，因此兩者同時(shí)升高的混合型高脂血癥在臨床上最為常見。然而，目前采用高脂飼料制作的高脂血癥大鼠模型多數(shù)只能提高血清TC含量，血清TG含量是否提高報(bào)道不一[2-3]，有些文獻(xiàn)甚至報(bào)道降低的結(jié)果[4-5]。

現(xiàn)有研究表明，飼料中膽固醇、膽鹽、豬油含量與血脂關(guān)系密切，膽固醇、豬油的攝入可以增加機(jī)體膽固醇的含量，膽鹽的攝入可以幫助脂肪乳化與吸收，及促進(jìn)脂溶性維生素的吸收等作用，可增加外源性膽固醇的吸收[6]。因此，本課題擬改良高脂飼料配方，研究20%蔗糖與豬油、膽固醇、膽鹽不同配比，在造模4周時(shí)，高血脂癥大鼠模型的血糖、血清血脂及肝臟質(zhì)量、肝臟組織病理學(xué)改變。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與基礎(chǔ)飼料組大鼠比較，9種配方喂養(yǎng)大鼠4周，大鼠體質(zhì)量、攝食量均下降，血清TC、TG、LDLC含量均升高，血清GLU含量未見明顯變化，肝臟系數(shù)增大，脂肪系數(shù)未見明顯變化，肝細(xì)胞脂肪變性程度加重，提示9種配方均可以復(fù)制混合型高脂血癥大鼠模型，不能復(fù)制肥胖模型，對大鼠的血糖未造成影響。9種配方均對動物的攝食量、體質(zhì)量 增長有影響，這可能由于飼料中摻入了膽固醇、豬油等油膩的高脂物品，使飼料性質(zhì)發(fā)生改變，有異味，導(dǎo)致大鼠攝食量減少，從而影響大鼠的正常體質(zhì)量的增長。各配方飼料組間比較，配方7飼料對大鼠攝食量降低幅度較低，配方1飼料對血清TG含量升高幅度最大，配方4飼料對血清TC、LDLC含量升高幅度最大，對肝臟系數(shù)增加幅度最大，配方3、配方 4、配方 5、配方 7、配方 8飼料引起的脂肪變性評分集中在3分以上，提示配方1更有利于提高血清TG含量，配方4更有利于提高血清TC、LDLC含量，引起肝臟病變更明顯，配方7最適合大鼠口感，對大鼠體質(zhì)量影響最小。

因此，配方1、配方4、配方7喂養(yǎng)大鼠4周，均可以復(fù)制混合型高脂血癥大鼠模型，這3個(gè)配方各有優(yōu)缺點(diǎn)，研究者可以根據(jù)研究目的選擇使用。