超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中紐甜、阿力甜、阿斯巴甜、環(huán)天冬氨酰苯丙氨酸、甜蜜素、安塞蜜、糖精鈉

■李延山

（遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，遼寧沈陽110016）

人工合成的甜味劑有紐甜、阿力甜、阿斯巴甜、環(huán)天冬氨酰苯丙氨酸（BDPA）、甜蜜素、安塞蜜、糖精鈉等，其中阿力甜、阿斯巴甜、環(huán)天冬氨酰苯丙氨酸、甜蜜素、安塞蜜未列入飼料添加劑目錄，存在非法添加的風(fēng)險；紐甜、糖精鈉是飼料中允許使用的甜味劑，飼料企業(yè)對于購置的紐甜、糖精鈉有較強的質(zhì)控需求。因此制定飼料中紐甜、阿力甜、阿斯巴甜、BDPA、甜蜜素、安塞蜜、糖精鈉的檢測標準既能滿足監(jiān)管工作需要，也能服務(wù)于飼料企業(yè)，具有較大的社會效益。

采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測6種人工合成的甜味劑（即紐甜、阿斯巴甜、甜蜜素、安賽蜜、糖精鈉、阿力甜）及降解產(chǎn)物BDPA?；厥章试?5%～100%之間，RSD＜15%，方法檢測限為150 μg/kg，定量限為500 μg/kg，檢測限、定量限還可進一步降低優(yōu)化。標準線性工作范圍為：100～5 000 μg/l。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

樣品：玉米、豆粕、豬配合飼料、豬濃縮飼料、牛羊精補料、復(fù)合預(yù)混合飼料、維生素預(yù)混合飼料。

試劑：甲酸、甲醇、乙腈均為色譜級，乙酸鉛（分析純），超純水。

固相萃取小柱：HLB固相小柱，3 ml/60 mg。

儀器：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧電離源。

標準品：紐甜、阿力甜、阿斯巴甜、BDPA、甜蜜素、安塞蜜、糖精鈉對照品，純度≥98%。

儲備液配制：精確稱取紐甜、阿力甜、阿斯巴甜、甜蜜素、安塞蜜、糖精鈉對照品，用0.2%甲酸水溶液配成濃度約為0.1 mg/ml的標準儲備液，2～8℃冷藏保存，有限期6個月。

1.2 儀器參數(shù)條件

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：C18(100 mm×2.1 mm，粒徑1.7 μm)，或其他效果等同的C18柱；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μl；流動相及流速見表1；流速：0.3 ml/min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負離子模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；脫溶劑氣、錐孔氣、碰撞氣均為高純氮氣及其他合適氣體，使用前應(yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達到檢測要求；毛細管電壓、錐孔電壓、碰撞能量等電壓值應(yīng)優(yōu)化至最佳靈敏度；定性離子對、定量離子對及對應(yīng)的保留時間、錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表1 流動相及流速

表2 紐甜、阿力甜、阿斯巴甜、BDPA、甜蜜素、安塞蜜、糖精鈉的定性、定量離子對及保留時間、錐孔電壓、碰撞電壓的參考值

1.3 試驗方法

1.3.1 提取

稱取2 g（精確到0.000 1 g）試樣于50 ml離心管中，準確加入19 ml甲酸水提取液和1 ml飽和醋酸鉛溶液，充分震蕩15 min，超聲提取15 min，然后于7 000 r/min離心10 min，上清液備用。

1.3.2 凈化

固相萃取小柱先用3 ml乙腈、3 ml甲酸水提取液活化。取上清液3 ml過柱，用3 ml甲酸水提取液淋洗，空氣抽干2 min，用3 ml乙腈洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(50℃)至干,用3.0 ml 0.2%甲酸水溶液溶解，過0.22 μm濾膜后上機測定。若樣品液中含有的甜味劑濃度超出線性范圍，進樣前可用一定體積的0.2%甲酸水溶液稀釋，使稀釋后上機液的甜味劑濃度在線性范圍內(nèi)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取液的選擇

這7種甜味劑均易溶于水溶液，其中阿斯巴甜和BDPA在堿性條件下極易降解，因此提取液選擇偏酸性的水溶液。又因為飼料的蛋白質(zhì)會影響檢測結(jié)果，因此加入一定的蛋白沉淀劑。最終確定為19 ml 0.2%甲酸水溶液+1 ml飽和醋酸鉛溶液。

2.2 固相凈化柱的選擇

這7種甜味劑總體看是極性較弱的物質(zhì)，分別考察了HLB柱、C18柱、硅膠柱、以及MAX柱，結(jié)果表明，HLB柱具有較好的選擇性。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

對常用的流動相甲醇-水和乙腈-水進行了比對，試驗結(jié)果表明，甲醇-水信號值略高，但峰形較差，因此選擇乙腈-水。又將0.1%甲酸水溶液與20 mmol氨水水溶液作比較，發(fā)現(xiàn)流動相中含有20 mmol氨水水溶液時，有拖尾的現(xiàn)象；流動相中含有0.1%甲酸水溶液時，各組分的響應(yīng)值都比較高，而且峰形較好，無拖尾現(xiàn)象。因此，本試驗采用0.1%甲酸水溶液-乙腈做流動相。圖1為0.1%甲酸水溶液-乙腈做流動相的色譜圖(TIC)。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用ESI-的多級監(jiān)測模式。綜合比較ESI+與ESI-兩種模式下的目標物信號值。糖精鈉是強電離的陰離子，不適合ESI+模式，因此綜合考慮采用ESI-模式，并得到特征離子（見表2）及優(yōu)化后的7種甜味劑混合標準溶液的選擇性離子檢測監(jiān)測質(zhì)譜圖見圖2。

2.5 線性關(guān)系

配制系列濃度的紐甜、阿力甜、阿斯巴甜、BDPA、甜蜜素、安塞蜜、糖精鈉對照品工作液：分別吸取7種甜味劑儲備液，置于容量瓶中，用0.2%甲酸水溶液稀釋成濃度為0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/ml的標準曲線。標準曲線相關(guān)系數(shù)R2均在0.99以上。

2.6 回收率試驗

為進一步考察方法的適用性，以玉米、豆粕、豬配合飼料、豬濃縮飼料、牛羊精補料、復(fù)合預(yù)混合飼料、維生素預(yù)混合飼料為空白試樣，加標量分別為2.0、4.0、10.0 mg/kg。試驗的回收率在80%～105%。

2.7 精密度試驗

圖1 0.1%甲酸水溶液-乙腈做流動相的7種甜味劑色譜圖

N=5條件下，考察方法的精密度，RSD小于15%。

2.8 檢測限與定量限

信噪比=3確定為方法的檢測限，信噪比=10確定為方法的定量限。經(jīng)試驗確定本方法檢測限為150 μg/kg，定量限為500 μg/kg。

3 結(jié)論

建立了采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中紐甜、阿力甜、阿斯巴甜、環(huán)天冬氨酰苯丙氨酸、甜蜜素、安塞蜜、糖精鈉。該方法快速、高效、準確，可同時檢測飼料中7種甜味劑，定量限為500 μg/kg，能在7 min內(nèi)完成樣品的分析。為政府部門監(jiān)管提供了技術(shù)支撐，也為企業(yè)對原料和產(chǎn)品的質(zhì)控提供了方法。

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