成年商品豬大腸腸道菌群的計(jì)數(shù)與分析

■李 慧 楊大容 劉寶生

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330045）

動(dòng)物腸道菌群與動(dòng)物的生長(zhǎng)及健康關(guān)系密切，成年動(dòng)物腸道中長(zhǎng)期定居著大約1014個(gè)微生物個(gè)體，是動(dòng)物自身體細(xì)胞數(shù)量的十倍[1]。在這些微生物個(gè)體中，其中絕大部分是細(xì)菌。這些細(xì)菌按動(dòng)物腸道內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及微環(huán)境的不同而進(jìn)行相對(duì)穩(wěn)定的分布[2]，可以為宿主提供相當(dāng)于自身?yè)碛谢驍?shù)量150倍以上的額外基因儲(chǔ)備[3]。這些基因增強(qiáng)了動(dòng)物自身的代謝能力，可為宿主合成機(jī)體必需的氨基酸、維生素，同時(shí)還可降解協(xié)助宿主從自身無(wú)法降解的非淀粉多糖中獲得能量[4]。因此很多學(xué)者已經(jīng)將動(dòng)物腸道內(nèi)的微生物菌群當(dāng)作機(jī)體的一個(gè)重要的器官來(lái)看待[5]。

豬是畜牧業(yè)中提供肉食品的重要雜食性經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，同時(shí)也是研究人的腸道內(nèi)生菌群的主要模型動(dòng)物[6]。在過(guò)去的幾十年間，雖然在豬腸道菌群的結(jié)構(gòu)、功能及與宿主關(guān)系等多方面都開(kāi)展了很好的研究[7-8]，但到目前為止，豬腸道內(nèi)生菌群的真實(shí)狀況卻仍然不夠清楚。本研究利用5種常用的培養(yǎng)基，通過(guò)對(duì)成年健康商品豬的大腸腸道不同區(qū)段內(nèi)正常菌群的分離、計(jì)數(shù)，從而分析健康成年豬大腸腸道正常菌群的結(jié)構(gòu)，同時(shí)也比較不同培養(yǎng)基對(duì)豬腸道菌群分離培養(yǎng)的效果。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

從江西省某大型生豬屠宰加工基地隨機(jī)選擇健康成年商品肉豬3頭，鑒于菌群分離計(jì)數(shù)的工作量比較大，為避免腸道菌群在樣品保存過(guò)程中產(chǎn)生明顯變化，本研究的樣品采集分3次獨(dú)立進(jìn)行，每次只采集1頭豬的腸道內(nèi)生菌群。采樣時(shí)，利用生豬生產(chǎn)加工基地的生產(chǎn)設(shè)備和人員進(jìn)行豬的屠宰，生豬宰殺完成后，完整地取出豬的整個(gè)腸道，置于冰盒中，迅速轉(zhuǎn)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行腸道菌群的采集。

在腸道菌群采集時(shí)，根據(jù)豬大腸的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)分為盲腸、結(jié)腸和直腸三段。同時(shí)根據(jù)每段腸段的長(zhǎng)短不同，分別采集2、3、3個(gè)樣品。在盲腸段，采樣點(diǎn)分別為回盲口附近和盲腸的盲端頂端，結(jié)腸段為降部中段、圓錐頂部和升部中段，直腸段則在前、中、后部分別采集殘留在直腸中的糞便。無(wú)菌操作，分別從各采樣點(diǎn)采集20～30 g的腸內(nèi)容物至事先已滅過(guò)菌的50 ml離心管中，盲腸部分的樣品分別標(biāo)記為M1、M2，結(jié)腸部分的樣品分別標(biāo)記為J1～J3，直腸部分的樣品標(biāo)記為Z1～Z3。所有樣品均加蓋密封，然后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基的制備

本試驗(yàn)共選用了5種常用的非選擇性培養(yǎng)基：PCA（plate count agar）、NA（nutrient agar）、TSA（tryptic soy agar）、LB 營(yíng)養(yǎng)瓊脂（Luria-Bertani nutrient agar）和 標(biāo) 準(zhǔn) Ⅰ號(hào) 瓊脂（standard I nutrient agar，StdI）。按培養(yǎng)基（配方組成見(jiàn)表1）的制備操作說(shuō)明，分別用直徑為9 cm的一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿制備好相應(yīng)的瓊脂平板，備用。

表1 五種常用非選擇性培養(yǎng)基的配方(g/l)

1.3 腸道菌群的分離與培養(yǎng)

1.3.1 樣品的前處理

從4℃冰柜中取出事先采集并保存的豬腸道各腸段樣品，準(zhǔn)確稱量并記錄裝有目標(biāo)腸段樣品的試管總重量。無(wú)菌操作，用滅菌后的不銹鋼干凈藥勺移取目標(biāo)腸段樣品約1 g，轉(zhuǎn)入一個(gè)15 ml的離心管中，用滅菌生理鹽水進(jìn)行10倍稀釋，然后將離心管置于旋渦振蕩器上高速振蕩5～10 min。為盡可能地避免因?yàn)閮?chǔ)存而導(dǎo)致的樣品中菌群數(shù)量的減少，每次采集的樣品必須在3 d內(nèi)完成菌群的分離與培養(yǎng)。

1.3.2 樣品的十倍梯度稀釋

無(wú)菌操作，用滅菌生理鹽水，將充分混勻震散的腸道菌群按10倍梯度稀釋法依次制備成最適涂板計(jì)數(shù)的三個(gè)連續(xù)梯度稀釋液。根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)的結(jié)果，不同腸段樣品的三個(gè)最適連續(xù)稀釋梯度依次選擇為：盲腸 10-5、10-6、10-7，結(jié)腸 10-7、10-8、10-9，直腸10-7、10-8、10-9。

1.3.3 腸道菌群的培養(yǎng)

本試驗(yàn)采用平板涂布法對(duì)樣品中的菌群進(jìn)行分離培養(yǎng)，五種不同的培養(yǎng)基分別同時(shí)接種相同的三個(gè)連續(xù)梯度稀釋液。無(wú)菌操作，用移液器移取各樣品的連續(xù)梯度稀釋液100 μl于事先制備并標(biāo)記好的培養(yǎng)基平板中央，用玻璃涂抹棒將菌液在整個(gè)平板表面涂抹均勻，每一樣品同一稀釋度每次涂布兩個(gè)平行平板。將涂布好后吸收完全的平板轉(zhuǎn)移至37℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18～24 h，待其長(zhǎng)成清晰而又不互相粘連的菌落時(shí)即可開(kāi)始進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.4 菌落計(jì)數(shù)

根據(jù)菌群分離的效果，選取菌落數(shù)在30～300個(gè)之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)同一類型的粘連菌落只計(jì)數(shù)一次，不同類型的重疊菌落單獨(dú)計(jì)數(shù)。每一樣品每個(gè)稀釋度的最終菌落數(shù)為兩個(gè)平行平板的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

不同腸段或采樣點(diǎn)之間菌群數(shù)量的差異，以及不同培養(yǎng)基對(duì)腸道菌群計(jì)數(shù)效果的差異均采用SAS 9.4的ANOVA或GLM過(guò)程進(jìn)行方差分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)，表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同腸段的菌群計(jì)數(shù)結(jié)果

按菌落計(jì)數(shù)的規(guī)則，從連續(xù)梯度平板中，選擇平行性好，菌落數(shù)在30～300個(gè)之間的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。不同培養(yǎng)基對(duì)各腸段不同采樣點(diǎn)菌群計(jì)數(shù)的結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 五種培養(yǎng)基對(duì)成年豬大腸不同腸段菌群計(jì)數(shù)結(jié)果[lg(cfu)/g]

從表2可以看出，從回盲口（M1）到直腸前段（Z1），隨著采樣位點(diǎn)的向后延伸，腸道內(nèi)生菌群活菌數(shù)量呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，但經(jīng)SAS 9.4的ANOVA過(guò)程統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果表明，除LB培養(yǎng)基的結(jié)腸J3位點(diǎn)及直腸Z1、Z3位點(diǎn)的活菌數(shù)顯著（P＜0.05）高于盲腸的M1位點(diǎn)外，其余各腸段采樣點(diǎn)間活菌數(shù)量均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。試驗(yàn)中所用到的其他4種培養(yǎng)基對(duì)豬大腸中不同位點(diǎn)菌群的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果均未呈現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）。

從上述各腸段不同位點(diǎn)的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果來(lái)看，盲腸的M1與M2位點(diǎn)，結(jié)腸的J1、J2與J3位點(diǎn)，以及直腸的Z1、Z2、Z3三個(gè)位點(diǎn)在五種不同的培養(yǎng)基中，菌群計(jì)數(shù)結(jié)果均顯示差異不顯著（P＞0.05）。這一結(jié)果說(shuō)明在成年豬同一腸段的不同位點(diǎn)之間，其菌群的活菌數(shù)量沒(méi)有明顯差異。因此，我們可以將盲腸、結(jié)腸和直腸內(nèi)的不同位點(diǎn)之間的樣品計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行合并分析，從而可以得出不同培養(yǎng)基對(duì)成年商品豬盲腸、結(jié)腸和直腸內(nèi)菌群的計(jì)數(shù)結(jié)果（見(jiàn)表3）。合并后的數(shù)據(jù)采用SAS 9.4的GLM過(guò)程進(jìn)行組間方差顯著性檢驗(yàn)，差異顯著性水平仍為P=0.05。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)豬大腸段的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果[lg(cfu)/g]

從表3中可以看出，5種培養(yǎng)基中，NA、PCA兩種培養(yǎng)計(jì)數(shù)所得結(jié)果盲腸、結(jié)腸和直腸之間沒(méi)有明顯區(qū)別（P＞0.05），而培養(yǎng)基LB、TSA和StdI的培養(yǎng)結(jié)果則顯示出直腸內(nèi)的固有菌群數(shù)量明顯比盲腸多（P＜0.05）。有趣的是，在所有的5種培養(yǎng)基中，結(jié)腸內(nèi)活菌的計(jì)數(shù)結(jié)果均與盲腸和直腸無(wú)顯著性差異（P＞0.05），這從一個(gè)方面說(shuō)明了結(jié)腸不僅在結(jié)構(gòu)上是盲腸向直腸的過(guò)渡，而且在腸道內(nèi)生菌群數(shù)量上，也具有過(guò)渡的特征。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)豬腸道菌群計(jì)數(shù)的影響

本試驗(yàn)選用5種實(shí)驗(yàn)室常用的非選擇性培養(yǎng)基對(duì)豬大腸不同位點(diǎn)的內(nèi)生菌群進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)的結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)SAS統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明5種培養(yǎng)基對(duì)豬大腸相同位點(diǎn)樣品的菌群活菌計(jì)數(shù)結(jié)果均不存在顯著性差異（P＞0.05）。但從表3合并后分析的數(shù)據(jù)結(jié)果來(lái)看，培養(yǎng)基NA、PCA檢測(cè)的結(jié)果要比LB、TSA和StdI的稍低。因此，如果從最大限度地培養(yǎng)腸道菌群數(shù)量的角度出發(fā)，培養(yǎng)基LB、TSA和StdI的效果要比NA和PCA好。

3 討論

3.1 成年商品豬大腸不同腸段腸道可培養(yǎng)菌群的分布

在動(dòng)物腸道內(nèi)，不同腸段因?yàn)槠涔δ懿煌?，腸內(nèi)容物的組成和性狀差異很大，因此，腸內(nèi)容物中微生物的種類和數(shù)量也不可能完全一樣。在本試驗(yàn)中，因?yàn)槲宸N不同培養(yǎng)基對(duì)同一位點(diǎn)的菌群計(jì)數(shù)結(jié)果無(wú)顯著性差異（P＞0.05，見(jiàn)表2），因此，我們可將同一腸段不同培養(yǎng)基的計(jì)數(shù)結(jié)果取平均值作為該腸段的檢測(cè)值，進(jìn)一步分析各腸段間菌群數(shù)量的關(guān)系。結(jié)果表明，在豬的大腸中，從盲腸到直腸，整個(gè)腸段的內(nèi)生菌群數(shù)量沿腸管的延續(xù)方向向后逐漸增加，盲腸、結(jié)腸和直腸之間，其內(nèi)生菌群的數(shù)量均具有顯著性差異（P＜0.05，見(jiàn)表4）。Butine等[9]曾對(duì)生長(zhǎng)肥育豬盲腸和結(jié)腸的厭氧菌群進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果同樣表明結(jié)腸內(nèi)的活菌數(shù)量顯著高于盲腸。

表4 豬大腸不同腸段間的活菌計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析[lg(cfu)/g]

3.2 不同培養(yǎng)基對(duì)豬腸道菌群分離培養(yǎng)的影響

不同的培養(yǎng)基配方，因?yàn)槠錉I(yíng)養(yǎng)組成成分的差異性，必然會(huì)對(duì)所培養(yǎng)的菌群具有一定的選擇性。本試驗(yàn)的結(jié)果表現(xiàn)為：不同培養(yǎng)基對(duì)豬腸道同一位點(diǎn)菌群的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果可能不同。在用LB培養(yǎng)基進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)時(shí)，J3、Z1和Z3的菌群數(shù)量明顯要比M1多（P＜0.05），而其他四種培養(yǎng)基雖然都存在順著腸道的延續(xù)，從前至后菌群數(shù)量逐漸增加的趨勢(shì)，但未呈現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)利用5種實(shí)驗(yàn)室常用的非選擇性培養(yǎng)基對(duì)成年商品豬大腸內(nèi)8個(gè)位點(diǎn)的內(nèi)容物進(jìn)行了活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果表明從盲腸、結(jié)腸到直腸，腸道內(nèi)生菌群的數(shù)量沿腸道向后依次顯著增加（P＜0.05），同時(shí)，在盲腸、結(jié)腸和直腸的同一節(jié)段內(nèi)，不同位點(diǎn)的菌群數(shù)量差異不顯著（P＞0.05），即同一節(jié)段之間菌群活菌數(shù)量相似。本試驗(yàn)的結(jié)果可為進(jìn)一步研究飼料中不同添加劑對(duì)豬腸道正常菌群的影響提供依據(jù)。